여기에 우리가 존재 바이오 입자의 수집을위한 최적화하고 효율적인 제거 전략을 설명 한 번에 5 ㎕를 마이크로 볼륨 용해 / STR 증폭을 포함하는 향상된 증폭 프로토콜과 함께, 샘플 'DNA 터치'를,의 회복을 허용하는 짧은 탠덤 반복 (STR) 바이오 입자 기증자 (들)의 프로필.
DNA 프로파일은 인체의 생체 물질을 포함하는 미세 흔적 '터치 DNA'증거로부터 얻을 수있다. 추적 DNA 채용 면봉 또는 접착 테이프를 회수 현재의 방법은 관심 영역을 샘플링. 그러나, 이러한 "블라인드 보라고 '접근 공동 샘플 것이다 다공질 재료를 다른 개체로부터, 개인의 세포가 상품에 지리적으로 구별되는 지역에 위치하는 경우에도. 따라서, 터치 DNA 샘플에서 발생하는 DNA 혼합물의 일부는 인위적으로 자신을 보라고에 의해 만들어집니다. 일부 예에서, 희생자의 DNA 따라서 잠재적 가해자 DNA 마스킹 상당한 과량에서 찾을 수있다.
표준 복구 및 분석 방법에 문제를 회피하기 위해, 우리는 터치 DNA 증거의 향상된 유전자 분석 결과 낮은 비용으로, '스마트 분석'방법을 개발했다. 우리는 최적화를 설명터치 DNA 샘플에 존재하는 생체 입자의 회수뿐만 아니라, 바이오 입자 공여자 STR 프로파일의 회복을 허용하기 위해 한 단계 5 μL microvolume 용해 / STR 증폭 관련된 향상된 증폭 전략 D 효율적인 미세 조작 복구 전략 (들). 개개의 사용 또는 몇몇 (즉, "덩어리") 단일 소스 정보를 획득 할 수있는 능력의 결과 bioparticles. 이러한 절차는 분리 및 법정 터치 DNA 증거에서 단일 bioparticles의 분석을위한 대안 향상된 기술을 나타냅니다. 모든 법의학 수사에 필요한 것은 아니지만,이 방법은 표준 분석 기술을 이용하여 가능하지 않을 수 물리적 공격 (예를 들어, 질식) 포함하는 경우에 단일 소스 가해자 DNA 프로파일의 회복에 매우 유익 할 수있다. 또한, 여기서 개발 된 전략은 O의 다양한 단일 세포 수준에서의 유전자 정보를 얻을 수있는 기회를 제공거기는 비 법정 추적 생물학적 물질.
터치 DNA가 세포 물질의 직접 전송입니다 추적 생물학적 증거의 한 형태이다 신체 접촉을 한 동안이나 기타 개인에게 개인으로부터 (예를 들면, 피부 세포를 창고). 터치 개체의 다양한 DNA 프로파일을 얻을 수있는 능력 (문서, 침구, 신발, 총기, 마시는 용기, 펜은, 서류 가방은 핸들) 문헌 2-9에서보고되었다.
터치 DNA 증거의 분석에서 중요한 요소는 추적 생물학적 물질의 존재가 성공적으로 복구 된 것입니다. DNA 증거는 일반적으로 멸균 면봉으로 의심되는 영역을 보라고 의해 수집 만져 ( "블라인드 보라고"라고 함). 이 방법을 이용하여, 수집 된 생체 물질의 특성은 공지되지 않고, 일반화 된 영역의 샘플링이 수행된다. 표면의 홈이나 틈새의 존재는 Bi를 이미 종종 소량의 성공적인 회수를 방해 할 수학적 물질의 존재. 또한, '블라인드 보라고'에 접근하게됩니다 세포 항목에 존재하는, 개인의 세포 항목에 공간적으로 서로 다른 위치에있는 경우에도 다른 개인의 필요 공동 샘플 세포 물질. 종종 낮은 주형 DNA 샘플과 특히 해결하기 위해 도전하고 혼합 된 DNA 프로파일의 회복은 자주 8,10,11를 관찰하고 많은 경우 보라고 프로세스 자체의 결과적인 이슈가 될 것입니다. 물질의 소량 만이 도너의 하나에서 존재하는 경우, 표준 추출 및 분석 기술은 작은 기여도 프로파일을 복구하지 못할 수있다. 또한, 건식 또는 습식 사용 하였다 여부 면봉 형태 인해 흡수율 및 흡착성과 생체 물질 (12)의 방출 효율의 차이에 수집되는 생체 물질의 양에 영향을 미칠 수있다 (멸균 수로 미리 적신). 에스tandard 추출 방법으로 인해 샘플 또는 샘플 전송 단계의 필요한 물리적 조작에 추가 샘플 손실이 발생할 수 있습니다.
상술 한 바와 같이, 생체 물질의 회복을위한 간단한 기술 보라고 인해 개별 생물학적 성분을 분리 실패 생물학적 샘플뿐만 아니라 혼합 된 프로파일의 증가 발생 미량의 손실을 초래할 수있다. 따라서, 우리는 감동 객체에 존재하는 세포의 미세 입자의 수집에 대한보다 선택하고 효율적인 복구 전략을 개발하기 위해 노력했다. 터치 DNA 증거로부터 생체 물질의 분석을위한 개발 전략 (표피의 외부 표피 층에있는 세포의 대다수가 죽었거나 죽어 때문에 핵 항상 표시하지 않다는 사실을 "bioparticles"로서 여기서 언급 겔 필름 FR을 통해 생물학적 물질 (즉, bioparticles)의 1) 모음 : 다음) (13) 각화 포함톰은 수용성 접착제를 사용하여 객체와 표면 마모 의류 항목 또는 직접 인간의 피부, 잠재적 인 인간의 생물학적 물질의 수집을 보장하기 위해 복구 된 생물학적 물질의 2) 현미경 검사, 단일 또는 소수의 바이오 입자의 3) 미세 조작을 터치하고, microvolume (5 μL) 원스텝 용해 / 증폭 반응을 이용하여 수집 된 생체 입자 4) 염색체 DNA-STR 프로파일.
이 절차는 전통적으로 사용되는 분석 방법에 비해 많은 장점을 제공한다. 겔 필름을 이용하여 복구 bioparticles의 분석 이전에 샘플에 생체 물질 존재 현미경 검사를 허용한다. 터치 DNA 증거에서 발견 bioparticles의 대부분은 핵 세포가 더 어려워 또는 바이오 입자가 선택되어야하는, 분석 기회 제공 이전에 이들 시료의 현미경 검사가 핵 세포를 검색 할 결정 할 수있게되지 않을 수 있지만 따라서 maximizDNA 프로파일 복구의 확률을 보내고. 수용성 접착제를 이용한 미세 조작을 사용하여 bioparticles의 컬렉션은 반응 튜브에 대상 bioparticles의 직접 전송을 가능하게한다. 이 절차는 생체 물질의 성공적인 전송을 보장하기 위해 현미경으로 가시화된다. 샘플 당 분석 비용을 줄이면서 감소되거나 microvolume 반응 민감도를 증가시킨다. 이 증거의 개별 부분에서 샘플의 증가 수의 분석을 수 있습니다. 때문에 터치 DNA 증거에 바이오 입자의 유전 적 상태의 범위, 개별 항목에서 여러 샘플링 권장합니다.
여기서 우리는 터치 DNA 증거 생물학적 물질의 기증자의 높은 입증하는 유전자 프로파일을 얻기 위해 개발 된 프로토콜의 성공적인 사용을 보여줍니다. 개발 bioparticle 수집 및 DNA 프로파일 링 방법은 포괄적 인 '스마트'(즉, 특정, 측정, 아타을 제공특성, 분석 및 추적 생물학적 재료의 해석, inable 사실 적시) 분자 기반의 접근 방식. 원래 터치 DNA 증거 법의학 분석 어플리케이션을 위해 개발 동안, 여기서 개발 된 전략은 생체 물질의 다른 소스에인가하고 단일 세포 수준에서의 개인 식별 정보를 획득 할 기회를 제공 할 수있다.
여기에서 우리는 수집 및 터치 DNA 증거에서 발견 bioparticles의 향상된 유전자 분석 방법을 설명했다. 접촉 물체와 표면, 착용 의류 항목 또는 직접 인간의 피부에서 젤 필름을 통해 생물학적 물질 (즉, bioparticles)의 1) 수집, 회수 된 생물학적 물질의 2) 현미경 검사는 잠재적 인 수집을 보장하기 위해 : 개발 방법은 다음과 같은 포함 인간의 생체 물질 및 수용성 접착제를 사용하여 단일 또는 몇 bioparticles 3) 미세 조작 및 microvolume (5 μL) 원스텝 용해 / 증폭 반응을 사용하여 수집 bioparticles 4) 염색체 DNA-STR 프로파일. 원스텝 폐쇄 반응 튜브의 사용은 추가적인 샘플 조작 또는 다른 반응 튜브에 양도 오염 시료 손실 가능성을 감소시킨다. 향상된 원스텝 microvolume (5 μL)의 용해는 / STR 증폭 반응은 전체 또는 probativ의 복구를 허용전자 STR 단일 또는 몇 bioparticles의 기증자의 프로필. 이 방법은 단일 및 멀티 소스 터치 DNA 증거 (예를 들면, 착용 의류 항목 및 기타 가정 용품, 감동 / 처리 객체와 표면, 피부 / 피부 혼합물)에서 하나의 소스 STR 프로파일을 얻기 위해 개발되었다. 이 성공적 모의 물리적 공격 혼합물 샘플 남성 기증자의 검출을 위해 사용되었다.
이러한 접근 방식은 더욱 이러한 가해자에서 불과 몇 bioparticles 피해자의 생물학적 물질의 압도적 인 양의 사이에 존재하는 것입니다있는 그 / 그녀의 가해자를 긁적 피해자로 추가 체액 / 조직 혼합물 시나리오에서 평가 될 수있다. 현재 연구 개발이 접근법은 단일 bioparticle 수준에서 분석을 허용 이후 또한이를 중개자 표면 처에 DNA 프로파일을 전사하는 이차 전사 14-19의 본질 및 범위의 더 나은 이해를 얻기 위해 사용될 수있다다른 표면 객체 또는 사람 20 CE, 개체 또는 사람. 차 전사의 분석 블라인드 보라고 방식은 보조 기증자 물질의 미량을 식별하는 데 실패 할 수 있습니다. 여기서 개발 된 방법은 단일 또는 몇 bioparticles의 분석을 허용하고, 따라서 결과가 기본 도너로부터 생체 물질의 압도적 인 양의 존재에 의해 혼동되지 않는다. 이러한 가해자로부터 피부 세포의 미량의 긍정적 인 인식이 중요 할 수있는 곳 질 디지털 침투를 포함하는 것과도 성폭력의 경우 추적 생물학적 물질의 분석에 영향을 미칠 수있다이 연구에서 개발 된 방법은 성적 접촉을 설정하려면 발생했습니다.
겔 필름 샘플에서 bioparticles의 수집이 어렵고 복잡한 조작을 포함하지 않지만, SU을 보장하기 위해 매우 세 심하게 수행해야하는이 절차의 중요한 단계가 있습니다하류 반응 용기에 bioparticles의 ccessful 전송. 수용성 접착제 bioparticles의 컬렉션이 사용 된 접착제 "공"의 크기에 따라. 즉, 높은 배율 (~ 200-300X)의 실체는 관심 만 bioparticles가 수집되도록 (현미경으로 볼 수 있어야합니다 모두 생물학적 및 비 생물학적 물질 (예를 들면, 섬유, 먼지 등)을 포함 할 수있는 추가 주변 재료를 수집 할 가능성이있다. 의도 추가적인 bioparticles의 컬렉션은 혼합 된 DNA 프로파일의 회복 될 수있다. 비 – 생물학적 물질의 컬렉션 여러 bioparticles 동일한 접착제 "공"을 수집하는 경우에는 마이크로 볼륨 용해으로 억제제를 도입 할 수 / STR 반응., 이전에 수집 bioparticles 접착제로 부착되기위한 가능성이있다.이 자주 관찰되지 않고, 발생 때 bioparticl 더 많은 수의ES 수집 (예를 들어, 50) 하나의 접착제 "공"와. bioparticles의 많은 수를 대상으로하면, 적은 수의 다수 bioparticles 모음이 이루어지는하지만 모두 동일한 0.2 ㎖의 튜브에 옮기고 것이 권장된다. bioparticles 수집 되었으면 케어 현미경 스테이지로부터 겔 필름 슬라이드와 바늘의 선단이 방해되지 않도록 0.2 ㎖의 튜브의 배치의 제거시주의해야한다. 0.2 ㎖의 튜브의 아래쪽 증폭 믹스 바늘의 선단부의 배치 중에, 바늘의 선단이 관의 측면에 재료의 손실을 피하기 위해 관의 측면과 접촉해서는 안된다. 접착제의 용해가 빠르며 전형적 동안 (~ 30 초 이하인 접착제 "공"의 크기에 따라) 수는 현미경 시험 동안 모니터링, 바늘의 선단이 서서히 그 완료를 보장하기 위해 증폭 믹스 제거해야 가용화접착제 달성되었다. 접착제가 완전히 용해되지 않은 경우, 바늘이 완전히 용해 할 수 있도록 액체로 복귀 할 수있다.
여기에 설명 된 프로토콜은 법정 생물학적 증거에서 bioparticles과 인간의 세포와 함께 사용하기에 최적화되어있다. 선택된 용해 버퍼는 선택된 STR-DNA 증폭 키트와 호환된다. 적합한 대안 용해 버퍼가있을 수 있지만, 다운 스트림 분석 세포 용해 및 호환성 측면에서 효율성은 사용자가 검증되어야한다. 또한,이 프로토콜에 설명 STR 증폭 키트 및 증폭 사이클 수는 단일 또는 소수의 bioparticles 함께 사용하기 위해 최적화되었다. 보고 증가 견고성과 감도 차세대 STR 증폭 키트는 선택한 단일 또는 몇 bioparticles에서 높은 품질의 STR 프로파일의 회복이 발생할 것으로 입증되었습니다. 동안 다양한 추천의 앰프와 수많은 다른 STR 키트,양이온 사이클 번호들은 적절한 감도를 가질 수 없으며, 따라서 적절하게 이러한 프로토콜에 사용하기 전에 평가 될 필요가 가능하다.
단일 또는 몇 bioparticles에서 복구 STR 프로파일에 대한 설명 방법의 성공적인 사용에도 불구하고, 프로필 회복의 성공률은 100 %되지 않습니다. 따라서 일부 샘플에 대한 제한된 부분 DNA 프로파일 또는 전혀 프로필을 관찰 할 수있다. 이것은 결론적으로 인해 시각적으로 다공질 재료로서 가장 bioparticles를 식별 할 무능력 피할 수없고, 반응 용기에 전달하기 전에 수집 bioparticles 또는 접착제의 샘플 재료의 손실이 핵 물질의 잠재적 인 성능 저하 상태. 따라서, 각 터치 DNA 항목에 대한 하나의 bioparticle 샘플의 분석은하지 않는 것이 좋습니다. 우리는 자주 개인 겔 필름 샘플 20 샘플 세트를 수집하고 적합한 STR 프로필을 얻을 수없는 경우 필요에 따라 추가 샘플 세트를 수집합니다. 티microvolume 반응이 (하나의 표준 반응 부피와 유사한 또는 더 낮은 비용의 추가 샘플을 수집 할 수있는 기회를 제공하지만 모음 그가 유일한 제한은, 겔 필름 샘플 (분석의 예상 비용에 존재하는 생물학적 물질의 양 예를 들어, 25 μL).
개발 된 DNA 프로파일 링 방법은 여기에 설명하는 특성, 분석 및 터치 DNA 샘플에서 발견 추적 생물학적 재료의 해석에 분자 기반의 접근 방식을 제공합니다. 그러나, 생체 물질의 도너의 도너 (즉, STR 프로파일)의 판정에 더하여 회수 bioparticles로부터 획득 될 수있는 추가의 유전 정보가 존재한다. 기원 조직 또는 체액 소스 (예, 타액 대 피부)가 범죄 수사에 결정적 콘텍스트 정보를 제공 할 수있다. 이러한 판정없이 기원 조직 공급원의 모호함 수 EXPLO범죄의 대안 상황으로 한정된 범위 (예를 들어, 체액이 퇴적되었을 수있는 방법을) 제안 할 수있다. 여기에 설명 bioparticle 수집 및 분리 프로토콜 (예를 들면, 구강, 질) 조직 소스 식별에 사용하기위한 마이크로 볼륨 전사 (RT)를 역방향 포함 전략 (mRNA를 21-30 프로파일) bioparticles 또는 다른 세포를 수집하기 위해 사용될 수 있고 증폭 반응. 상기 최적화는 또한 터치 DNA 증거로부터 bioparticles 포함 동일한 시료로부터 세포 유형 식별 (RNA) 및 STR 프로파일을 허용하는 DNA / RNA 공동 분리 전략을 개발하는 것이 가능할 수있다.
The authors have nothing to disclose.
The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile |
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
Sterile water | 18.2 mega-ohm, autoclaved | ||
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL | various | ||
Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
Mini-centrifuge | various | ||
Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
GeneMapper software | Life Technologies | various | Various versions of the software are available and can be used |
WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
Double sided tape | various | ||
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. |
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. |
AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |