Summary
Her beskriver vi en optimalisert og effektiv fjerning strategi for innsamling av bio-partikler som finnes i 'berøre DNA' prøvene, sammen med en forbedret amplifikasjonsprotokoll involverer en ett-trinns 5 mL mikro-volum lyse / STR forsterkning, for å tillate utvinning av korte tandem gjentagelse (STR) profiler av bio-partikkel-donor (e).
Abstract
DNA-profiler kan fås fra "touch DNA 'bevis, som består av mikroskopiske spor av humant biologisk materiale. Dagens metoder for utvinning av spor DNA ansette bomullspinner eller teip til å prøve et område av interesse. Imidlertid vil en slik "blind-swabbing 'tilnærming co-sample cellemateriale fra de forskjellige individer, selv om den enkeltes cellene er plassert i geografisk adskilte steder på varen. Dermed er noen av de DNA-blandinger oppstått i berørings DNA-prøver kunstig skapt av swabbing selv. I noen tilfeller kan en offerets DNA finnes i betydelig overskudd og dermed maske eventuelle gjerningsmannens DNA.
For å omgå utfordringene med standard utvinning og analysemetoder, har vi utviklet en lavere kostnad, "smart analyse 'metode som resulterer i økt genetisk analyse av berørings DNA-bevis. Vi beskriver en optimalisert end effektiv micromanipulation utvinning strategi for innsamling av bio-partikler som er tilstede i kontakt DNA-prøver, så vel som en forbedret forsterkning strategi som involverer en ett-trinns 5 ul microvolume lyse / STR forsterkning for å tillate utvinning av STR profiler fra bio-partikkel donor (e). Bruken av individuelle eller noen (dvs, "klumper") bioparticles resulterer i evnen til å oppnå enkel kildeprofiler. Disse fremgangsmåter representerer alternative forbedrede teknikker for isolering og analyse av enkelt bioparticles fra rettsmedisinske berøring DNA bevis. Selv om ikke nødvendig i alle rettsmedisinske undersøkelser, kan metoden være svært gunstig for utvinning av en enkelt kilde gjernings DNA-profil i saker om fysiske overgrep (for eksempel kvelning) som kanskje ikke være mulig å bruke standard analyseteknikker. I tillegg, strategier utvikles her tilbyr en mulighet til å oppnå genetisk informasjon på celle-nivået fra en rekke other ikke-rettsmedisinske spor biologisk materiale.
Introduction
Berørings DNA er en form for spor biologiske bevis som er den direkte overføring av cellemateriale (f.eks felle hudceller) fra et individ til et objekt eller et annet individ i løpet av en fysisk kontakt. Evnen til å innhente DNA-profiler fra en rekke berørt objekter (dokumenter, sengetøy, sko, skytevåpen, drikkebeholdere, penner, koffert håndtak) er rapportert i litteraturen 2-9.
En kritisk faktor i analysen av berøring DNA bevis er vellykket gjenoppretting av sporet biologisk materiale som er tilstede. Trykk på DNA-bevis er vanligvis samlet inn av swabbing det mistenkte området med en steril bomullspinne (referert til som "blind-swabbing"). Ved hjelp av denne metode, er arten av det oppsamlede biologiske materialet ikke kjent, og sampling av en generalisert område er utført. Tilstedeværelsen av overflate riller eller sprekker kan hindre vellykket utvinning av ofte allerede liten mengde biological materiale til stede. I tillegg er en "blind-swabbing 'tilnærming vil nødvendigvis co-sample cellemateriale fra de ulike personer med celler er til stede på elementet, selv om den enkeltes cellene finnes i romlig forskjellige steder på varen. Gjenvinningen av blandet DNA-profiler, som ofte er vanskelig å løse spesielt med lavt templat DNA-prøver, blir ofte observert 8,10,11 og i mange tilfeller vil være et følge artefakt av swabbing prosessen. Hvis bare en liten mengde av materiale som var tilstede fra en av giverne, kan standard ekstraksjonsmetoder og analyseteknikker ikke klarer å gjenopprette en profil mot mindre bidragsyter. I tillegg er den type pinne eller om det ble brukt tørt eller vått (pre-fuktet med sterilt vann), kan påvirke mengden av biologisk materiale som er innsamlet på grunn av forskjeller i absorpsjonsevne og adsorpsjonsevne og effektiviteten av frigjøring av det biologiske materiale 12. Standard utvinning metoder kan føre til tilleggsutvalget tap på grunn av nødvendig fysisk manipulering av prøven eller prøveoverførings trinn.
Som beskrevet ovenfor, kan pensling enkle teknikker for utvinning av biologisk materiale resultere i tap av spormengder av biologisk prøve, så vel som en økt forekomst av blandet profiler på grunn av en manglende evne til å skille de enkelte biologiske komponenter. Derfor forsøkte vi å utvikle mer selektive og effektiv utvinning strategier for innsamling av cellulære mikropartikler til stede på berørt gjenstander. Den strategi utviklet for analyse av biologisk materiale fra berøring DNA bevis (referert til her som "bioparticles" på grunn av det faktum at en kjerne er ikke alltid synlig ettersom et flertall av celler som finnes i den ytre epidermale lag av huden er døde eller døende keratinocytter 13) innebærer følgende: 1) innsamling av biologisk materiale (dvs. bioparticles) via gel-film from rørt gjenstander og overflater, slitte klær eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøkelse av det utvunnede biologisk materiale for å sikre samling av potensiell human biologisk materiale, og 3) mikromanipulasjons av ett eller noen få bio-partikler ved bruk av et vannløselig klebemiddel, og 4) autosomal DNA-STR profilering av de innsamlede bio-partikler ved hjelp av en microvolume (5 mL) ett-trinns lyse / amplifikasjonsreaksjon.
Denne prosedyren gir en rekke fordeler fremfor tradisjonelt brukt analysemetoder. Utvinning av bioparticles ved hjelp av gel-filmen tillater en mikroskopisk undersøkelse av det biologiske materiale som er tilstede i prøven før analyse. Mens et flertall av bioparticles utvinnes fra berørings DNA-bevis kan ikke være kjerneholdige celler gjør det vanskeligere å avgjøre hvilke eller hvor mange bio-partikler bør velges, mikroskopisk undersøkelse av disse prøvene før analyse gir til muligheten til å søke etter nukleerte celler dermed maximizing sannsynligheten for DNA-profil utvinning. Samlingen av bioparticles ved hjelp av vannoppløselige klebemiddel-assistert micromanipulation tillater direkte overføring av målrettede bioparticles inn i reaksjonsrørene. Denne prosedyren blir visualisert under mikroskop for å sikre vellykket overføring av det biologiske materialet. Den reduserte eller microvolume reaksjon øker følsomheten og redusere kostnadene for analyse per prøve. Dette tillater analyse av økt antall prøver fra et individ stykke bevis. På grunn av omfanget i den genetiske tilstand av bio-partikler i berøring DNA-bevis, er flere prøvetakinger fra enkeltelementer anbefales.
Her demonstrerer vi vellykket bruk av de utviklede protokoller til å oppnå svært probative genetiske profiler av donorene av biologisk materiale i berøring DNA-bevis. De utviklet bioparticle innsamling og DNA-profilering metoder gir en omfattende "smart" (dvs. spesifikke, målbare, attainable, realistisk og tidsriktig) molekylær basert tilnærming til karakterisering, analyse og tolkning av spor biologisk materiale. Mens opprinnelig utviklet for søknad til rettsmedisinsk analyse av berøring DNA-bevis, kan de strategier utviklet her brukes til andre kilder til biologisk materiale og gir en mulighet til å få individuell identifiserende informasjon på celle-nivå.
Protocol
MERK: Kroppsvæsker ble samlet inn fra frivillige som bruker prosedyrer godkjent av University of Central Florida Institutional Review Board. Informert skriftlig samtykke ble innhentet fra hver donor.
1. Innsamling av Bioparticles fra Touched Objekter og Overflater
- Kutt gel-film til ønsket størrelse. Sørge for at det er den riktige størrelse for mikroskop-objektglass som blir anvendt som den faste bærer. For eksempel, for en 3 "x 1" objektglass ved å bruke en gel-film størrelse på 2 "x 0,75".
MERK: Lengden og bredden av materialet kan reduseres, hvis ønsket, men bør ikke overstige denne størrelsen. - Fjern den hvite backing fra gel-film og fest gel-film til objektglass (figur 1A). Trykk hardt ned for å sikre en komplett vedlegg.
MERK: Det er en klar topp beskyttende lag som ikke bør fjernes slik at trykket skal påføres langs stykke gel-film uten å forurense den gel-filmoverflaten. Forberedt gel-film lysbilder (med beskyttende lag festet) kan lagres i romtemperatur inntil nødvendig. - Fjern den gjennomsiktige toppen beskyttelsesfilmen fra gel-film ved hjelp av sterile pinsett når du er klar til å bruke (figur 1B) gel-film prøven. Plasser gel-film overflate i direkte kontakt med den ønskede rørt gjenstanden eller overflaten (figur 2). Anvende en liten mengde trykk for å sikre effektiv overføring av bio-partikler til gel-film.
MERK: Hvis du bruker for mye press er brukt, kan glasset lysbilde bryte.
MERK: Flere samplings fra samme objekt eller overflaten kan samles på samme stykke gel-film. - Bekrefte overføringen av bio-partikler på gel-film (figur 3) ved å plassere objektglasset på et stereomikroskop (trans- eller epi-belysning kan benyttes). Bruk forstørrelse av ~ 20X for beste visning større områder av gel-film, og forstørrelse av ~ 200X for beste viEwing individuelle bio-partikler.
- Oppbevar gel-film prøve lysbilde ved romtemperatur i en overbygd sklie boks eller bruke umiddelbart for beising og / eller bio-partikkel samling.
2. Valgfritt Farging av Bioparticles til Aid i Visualisering
- Plasser gel-film prøve lysbilde utarbeidet i trinn 1 på et lysbilde-flekker stativ over en vask.
- Ved hjelp av en engangsoverføring pipette, dekke hele gel-filmoverflaten med trypan blå flekk (figur 4A). Inkuber ved romtemperatur i 1-2 min.
- Fjern overflødig flekken ved å vippe lysbilde for å tillate flekken til å renne ut i vasken (Figur 4B).
MERK: Raset kan skylles av milde flom med sterilt vann ved hjelp av en engangsoverføring pipette hvis nødvendig (Figur 4C). - Tillate lysbildet lufttørke før du går videre til isolering av bio-partikler. Vis lysbildet bruker en stereomikroskop (~ 20X for generell visning og ~ 200-300X til view individuelle bioparticles) for å sikre riktig farging (figur 4D-E).
MERK: Raset kan oppbevares i romtemperatur i en overbygd sklie boks.
3. Isolering av Bioparticles av interesse for analyse
- Plasser riktig antall 0,2 ml PCR-rør i et stativ og merke rørene på riktig måte.
- Forberede STR forsterkning mix (se Materials List) i en utpekt PCR forsterkning hette eller biosikkerhet kabinett. Vortex master mix godt og kort sentrifuger i en mini-sentrifuge.
- Volumet av forsterkning blanding er nødvendig per prøve er 3,5 pl; fremstille et passende volum av masterblanding for det ønskede antall prøver.
- Pipet 3,5 mL av forsterkning mix i hver 0,2 ml tube. Cap hvert rør løst.
- Legg et stykke dobbeltsidig tape på en ren glassobjektglass eller direkte på et glass blokk.
MERK: Dette vil bli brukt til å holde0,2 ml rør på plass under prøvetakingen. - Legg et stykke dobbeltsidig tape på en ren glassobjektglass. Legg et stykke vannløselig bølgelodde tape på toppen av dobbeltsidig tape.
MERK: Dette lysbildet kan lagres i et tørke for fremtidig bruk. - Plasser den første 0,2 ml tube på dobbeltsidig tape lysbilde eller blokkere utarbeidet i trinn 3.4. Sett dette røret til side inntil prøven er samlet.
- Plasser den vannoppløselige bølgeloddebånd glide under mikroskopet (lav forstørrelse). Ved hjelp av spissen på en kanyle wolfram, forsiktig å skrape overflaten av båndet for å samle en liten mengde (eller "ball") av klebemiddel ved enden av nålen (figur 5A).
MERK: Størrelsen på ballen kan gjøres liten eller stor, avhengig av antall bioparticles som skal samles inn. - Fjern forsiktig wolfram nål med lim fra under mikroskopet uten å forstyrre spissen av nålen. Nålen kanvære plass i et rack hvis ønskelig under prøveplassering.
- Plasser den fremstilte gel-filmprøve (fra trinn 1 og 2) på objektbordet. Juster fokus og forstørrelse inntil bioparticles kan lett sees. Identifisere de bio-partikler som vil bli samlet inn.
MERK: En glassblokk kan bli brukt til å støtte glide hvis nødvendig. - Hente tungsten nål med lim ball, og plassere nålen over gel-filmoverflaten hvor bio-partikler av interesse ligger. Trykk på spissen av nålen (med klebemiddel) ned slik at den er i kontakt med bio-partikkel (figur 5B). Løfte nålen opp at bio-partikkelen er blitt oppsamlet. Gjenta denne prosessen til ønsket antall av bio-partikler er samlet.
- Plasser fremstilt 0,2 ml PCR-rør på objektbordet. Juster forstørrelse, slik at bunnen av røret som inneholder forsterknings blanding er i fokus.
- Sett forsiktig wolfram needle inn i 0,2 ml PCR rør til spissen av nålen er i forsterkning mix.
MERK: Dette er best utføres mens du ser gjennom mikroskop. - Hold nålen i forsterkningen mix før limet oppløses og bioparticles slippes ut løsning (figur 5C). Fjern nålen, plasserer de 0,2 ml oppreist og løst cap røret.
- Gjenta samling prosedyren for ytterligere prøver. Rengjør wolfram nål med pre-fuktet alkohol (isopropanol) kluter i mellom prøvene.
4. Kombinert Microvolume nukleinsyreisolering (Direkte Lysis) og Autosomal Short Tandem Repeat (STR) Profiling
- Forbered lysis buffer (se Materials) i en utpekt PCR forsterkning hette eller biosikkerhet kabinett. Tilsett 1,5 mL av lyseringsbuffer til hvert rør for en 5 pl totalt reaksjonsvolum. Lukk tube lokk tett.
MERK: 0,2 ml rør allerede inneholde 3,5 mL avforsterkning mix og samlingen bio-partikler fra Trinn 3. - Plassere prøvene i termosykler og forsterke prøvene ved hjelp av følgende sykkel betingelser: 75 ° C i 15 min; 95 ° C i 11 min; 34 sykluser ved 94 ° C i 20 sek og 59 ° C i 3 minutter; 60 ° C i 10 min; og 4 ° C hold.
- Butikk amplifiseringsprodukter ved 4 ° C for korttidslagring.
5. Produkt Detection - Kapillær elektroforese (CE)
- I en 96 brønners plate, tilsett 10 mL av CE kjører mix (9,7 mL avionisert formamid og 0,3 mL størrelse standard, se Materials). Tilsett 1 mL av amplifisert produkt eller en allelisk stige til hver brønn.
FORSIKTIG: Formamid er en potensiell mutagen og bør håndteres i en kjemisk hette mens iført egnet personlig verneutstyr. - Bruke elektro betingelser spesifisert av produsenten i forsterkersettet manuell eller internally validert forhold.
- Analysere rådata med STR analyse programvare.
Representative Results
Representative bilder av individuelle og klumpet seg bioparticles som ble utvunnet fra en skjorte krage (100% polyester) bæres av en mannlig donor er vist i figur 6 (enkelte bioparticles) og Figur 7 (klumpet seg bioparticles). De bioparticles ble utvunnet fra skjortekragen ved hjelp av protokollen beskrevet her: overføring av bioparticles fra skjortekragen til gel-film gjennom direkte kontakt, farging av innhentede bioparticles med trypanblått, samling av bioparticle prøver ved hjelp av en tungsten nål og vannløselig lim og STR-analyse ved bruk av 5 ul mikro volum lyse / STR forsterkning. Figurene 6 og 7 representerer en typisk prøve av bioparticles som skulle bli analysert fra et individ berøring DNA-element (20 enkelt / enkelt bioparticles og 20 klumpet bioparticles). Den bioparticle (e) samlet i hvert bilde er merket med lengde og bredde målinger (i mikron). Den percentage av STR alleler utvinnes fra hver av de innsamlede bioparticle (e) er gitt på hvert enkelt bilde for å demonstrere de variable grad av suksess som kan forventes å være hentet fra bioparticles med denne type bevis. De bioparticles utvinnes fra berørings DNA-prøver i stor grad er døde eller døende keratinocytter og derfor en avtrykkene STR profilen ikke er oppnådd fra hver bioparticle oppsamlet, som kan sees i figurene 6 og 7. For denne skjortekragen prøven ble STR profiler innhentet fra 14/20 (70%) av de enkelte bioparticles og 15/20 (75%) klumpet seg bioparticles. Men hver av de gjenopprettede profiler varierer i avtrykkene verdi: 3-97% allelet recovery for individuelle bioparticles profiler og 3-100% allelet recovery for de klumpet seg bioparticle profiler. På grunn av variasjonen i suksessraten, er samlingen av mange bioparticles fra hver berøring DNA element anbefales. Dette sikrer en bedre sjanse til å få en svært probative STR profil.
STR profilen oppnådd fra en av de individuelle bioparticle prøver fra snippen er vist i figur 8 (bioparticle fra hvilken profil stammer er vist til venstre). Nesten full STR profil (28 ut av 30 alleler, en locus slippe ut, nøyaktigheten av den oppnådde profil bekreftet ved sammenligning med en referanseprofil) ble oppnådd fra denne personen bioparticle. Den oppnådde profil er av høy kvalitet med rimelig balanserte inter-locus topphøyder og ingen allelisk slippe ut. Allelisk slippe ut og ubalanserte topphøyde gjenstander er både hyppig observert med lav mal DNA-prøver. STR profilen oppnådd fra en av de klumpet seg bioparticle prøver fra snippen er vist på figur 9. En full STR profil (30/30 alleler, nøyaktigheten av den oppnådde profil bekreftet ved sammenligning med en referanseprofil) ble oppnådd. Som nevnt tidligere, er en STR-profil ikke utvinnes fra stadigy bioparticle samlet. Et eksempel på mislykket DNA profilering av en enkelt bioparticle (3% allele utvinning, tredeveendedel alleler) er vist i Figur 10 (individuell bioparticle). Mens denne personen bioparticle var ikke vellykket, ble svært probative STR profiler av giveren av de bioparticles i dette utvalget innhentet fra andre bioparticles utvinnes fra samme prøve. Dette viser nødvendigheten av å utføre flere enkeltcelle / klump samplings fra samme objekt.
De utviklede "smarte" analysemetoder beskrevet her for berøring DNA-bevis har blitt brukt til å gjenopprette probative enkelt kildeprofiler fra singel og "klumpet seg" bioparticles fra ulike berørt gjenstander og klær (f.eks stol armlener, bil ratt, mobiltelefoner, kaffekopper, sigaretter, penner, skjorter, shorts, og gensere). Men viktigst av alt, denne tilnærmingen har også blitt brukt for påvisning og profilering av mannlig dOnor DNA (enkelt kilde) i simulerte fysisk kontakt / overgrep blandede prøver (f.eks gjerningsmannen gripe en offerets håndledd, nakke eller klær, eller kontakt med offerets sengetøy som i seksuelle overgrep).
Figur 1: Utarbeidelse av gel-film lysbilder for bioparticle samling. (A) Den hvite tilbake beskyttelsesdekselet fjernes ved hjelp av sterile pinsetter fra den del av gel-film for å eksponere den selvklebende bakside. Den gel-film blir så festet til et mikroskop-objektglass med fast trykk. (B) Når gel-film prøven er klar til å brukes for bioparticle samling, den øverste klar beskyttende film er fjernet ved hjelp av sterile pinsetter.
Figur 2: Bioparticle samling ved hjelp av gel-film fra forskjellige substrater. De gel-film lysbilder kan brukes til å samle inn bioparticles fra en rekke overflater. Den gel-filmen er plassert i direkte kontakt med gjenstanden eller overflaten av interesse. Lett trykk påføres for å overføre bioparticles på gelcoat-filmoverflaten. Innsamling av bioparticles fra (A) slitte klær (frakk krage), (B) rørte gjenstander (travel kaffe kopp), og (C) direkte menneskelig hud (mannlig håndledd) vises.
Fig. 3: Bioparticles på en slitt klær element (inne bukseben) Bioparticles overføres til gel-film gjennom direkte kontakt med gjenstanden overflate. Bioparticles kan bli funnet som "klumper" eller individuelle / single bioparticles (indikert med røde piler).
Figur 4:. Valgfritt farging av bioparticles på gel-film lysbilder For bedre visualisering av bioparticles, kan gel-filmprøver være farget med trypanblått flekken. Hele overflaten av gel-filmen er dekket av trypanblått (A). Etter 1-2 min for farging, sleiden forsiktig skråstilt for å tillate overskytende flekken for å kjøre av sleiden (B). Lett flom med sterilt vann (C) kan anvendes for å fjerne overskudd av flekken. Etter at dekselet er lufttørket, kan sleiden sees under mikroskopet for å sikre riktig farging (D, E). Merk:. Ikke alle bioparticles vil vises farget (dvs. blå farge) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
oad / 52612 / 52612fig5.jpg "/>
Figur 5: Bioparticle innsamling og analyse. (A) En liten mengde (eller "ball") av vannløselige bølgeloddebånd ("lim") samles på spissen av en wolfram nål ved forsiktig skraping. (B) Klebemidlet blir deretter rørt til gel film overflate for å samle bioparticles av interesse. Enkelte eller flere bioparticles kan samles med et enkelt klebemiddel ball. (C) Når de ønskede bioparticles har blitt samlet inn, blir nålespissen plasseres i forsterkning i en blanding av 0,2 ml PCR-rør. Nålen holdes i væsken før den går i oppløsning og frigivelse av bioparticles i oppløsning er observert. Alle trinnene i innsamlingsprosessen er utført og sett under mikroskop for å sikre en vellykket bioparticle innsamling og overføring. Klikk her for å se et LARger versjon av denne figuren.
Figur 6:. Individuelle bioparticles i en skjortekragen prøve Bioparticles ble gjenopprettes ved hjelp gel-film fra innsiden av en skjorte krage bæres av en mannlig donor. De bioparticles ble farget med trypanblått og bilder av tjue forskjellige individuelle bioparticles identifisert i prøven blir vist. I hvert bilde, er det bioparticle som ble samlet sirklet (røde sirkler indikerer bioparticles der en profil ble gjenvunnet, svart sirkler indikerer bioparticles der en profil ikke ble gjenopprettet). Den prosent allelet recovery (antall observerte alleler ut av en mulig 30) vises over bildet av bioparticle som en profil ble gjenfunnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: klumpet seg bioparticles i en skjortekragen prøve Bioparticles ble gjenopprettes ved hjelp gel-film fra innsiden av en skjorte krage bæres av en mannlig donor.. De bioparticles ble farget med trypanblått og bilder av tjue forskjellige klumpet bioparticles identifisert i prøven blir vist. I hvert bilde, er det bioparticle som ble samlet sirklet (røde sirkler indikerer bioparticles der en profil ble gjenvunnet, svarte sirkler indikerer bioparticles der en profil ikke ble gjenopprettet prosent allelet recovery (antall observerte alleler ut av en mulig 30). er vist for hver bioparticle hvorfra en profil ble gjenfunnet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8: Autosomal STR profilen oppnådd fra en enkelt bioparticle fra en mannlig skjortekrave en autosomal STR profil ble oppnådd fra et enkelt bioparticle (vist til venstre) ved hjelp av 5 ul direkte lyse / amplifikasjonsreaksjonen.. Nøyaktigheten av denne profilen ble bestemt ved sammenligning med en referanseprøve donor. Femten autosomal STR loci og amelogenin (kjønnsbestemmelse) er co-forsterket i en enkelt reaksjon og atskilt med kapillær elektroforese. Resultatene vises her som en elektroferogrammet. Allel tallene er betegnelse under hver topp på hvert locus. Den x-aksen representerer fragment størrelse (basepar, bp) og y-aksen representerer signalintensitet (RFU relativ fluorescensenheter, gitt under hver tilsvarende allelet nummer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9: Autosomal STR profil hentet fra en clumped bioparticle fra en mannlig skjortekragen En autosomal STR profilen ble hentet fra en clumped bioparticle (vist på venstre) ved hjelp av de fem ul direkte lyse / amplifikasjonsreaksjonen.. Nøyaktigheten av denne profilen ble bestemt ved sammenligning med en referanseprøve donor. Femten autosomal STR loci og amelogenin (kjønnsbestemmelse) er co-forsterket i en enkelt reaksjon og atskilt med kapillær elektroforese. Resultatene vises her som en elektroferogrammet. Allel tallene er betegnelse under hver topp på hvert locus. X-aksen representerer fragment størrelse (basepar, bp), og y-aksen representerer signalintensitet (RFU relative fluorescensenheter; tilgjengelig under hver korresponderende allel nummer).pg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 10: Eksempel på en unnlatelse av å oppnå en autosomal STR profilen oppnådd fra en samlet bioparticle Den enkelte bioparticle vist på venstre side ble oppsamlet fra en skjortekrage gel-filmprøve. Som det kan ses fra den resulterende STR profil (vist til høyre), ble bare ett allel (av 30 mulige) erholdt. Allel tallene er betegnelse under hver topp på hvert locus. Den x-aksen representerer fragment størrelse (basepar, bp) og y-aksen representerer signalintensitet (RFU relativ fluorescensenheter, gitt under hver tilsvarende allelet nummer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Her har vi beskrevet metoder for innsamling og økt genetisk analyse av bioparticles utvinnes fra berørings DNA-bevis. Den utviklet tilnærming innebærer følgende: 1) innsamling av biologisk materiale (dvs. bioparticles) via gel-film fra berørt gjenstander og overflater, slitte klær eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøkelse av gjenvunnet biologisk materiale for å sikre innsamling av potensiell humant biologisk materiale, og 3) micromanipulation av ett eller noen få bioparticles ved hjelp av et vannløselig klebemiddel, og 4) autosomal DNA-STR profilering av de innsamlede bioparticles ved hjelp av en microvolume (5 ul) ett-trinns lyse / amplifikasjonsreaksjonen. Bruken av en ett-trinns lukkede rør reaksjonen reduserer muligheten for forurensning og tap av prøven fra prøve ytterligere manipulasjoner eller overføring til andre reaksjonsrørene. Den forbedrede ett-trinns microvolume (5 mL) lyse / STR amplifikasjonsreaksjoner tillater gjenvinning av hele eller probative STR profiler av giveren av én eller noen få bioparticles. Denne tilnærmingen ble utviklet for å oppnå enkelt kilde STR profiler fra en- og flerkildeberørings DNA-bevis (f.eks, slitte klær og andre husholdningsartikler, rørte håndteres / objekter og overflater, hud / hud blandinger). Det har med hell blitt brukt for påvisning av hann donor i simulerte fysiske angrep blandede prøver.
Denne tilnærmingen kan bli ytterligere vurdert i flere kroppsvæske / vev blanding scenarier som et offer skrape hans / hennes overfallsmannen, der bare noen få bioparticles fra overfallsmannen ville være til stede blant en overveldende mengde av biologisk materiale fra offeret. I tillegg, siden denne tilnærmingen utviklet i denne studien tillater analyse på enkelt bioparticle nivå, det kan brukes til å få en bedre forståelse av arten og omfanget av sekundær overføring 14-19, hvor en mellommann overfører en DNA-profil på en overflaterce, objekt eller person til en annen overflate objekt eller person 20. En blind-swabbing tilnærming til analyse av sekundær overføring kan mislykkes i å identifisere spormengder av materiale fra den sekundære donor. Tilnærmingen utviklet her tillater analyse av en enkelt eller noen få bioparticles og derfor resultatene ikke blir tilbakevist av tilstedeværelsen av en overveldende mengde av biologisk materiale fra den primære donor. De metoder utviklet i dette arbeidet kan også ha implikasjoner for analyse av spor biologisk materiale i overgrepssaker som for eksempel de som involverer digital penetrering av vagina hvor positiv identifikasjon av spormengder av hudceller fra gjerningsmannen kan være avgjørende for å fastslå at seksuell kontakt inntraff.
Mens samlingen av bioparticles fra gel-film prøven ikke innebære vanskelige og komplekse manipulasjoner, er det kritiske trinnene i denne fremgangsmåten som må utføres med stor forsiktighet for å sikre successful overføring av bioparticles til nedstrømsreaksjonsbeholderen. Samlingen av bioparticles med det vannoppløselige klebemiddel må sees mikroskopisk (dvs. til stereomikroskopet ved høy forstørrelse (~ 200-300X) at bare de bioparticles av interesse blir oppsamlet. Avhengig av størrelsen av limet "ball" anvendes, er det er mulighet for å samle inn ytterligere omgivende materiale som kan omfatte både biologiske og ikke-biologiske materiale (f.eks, fibre, annet avfall). kan Samlingen av utilsiktede ytterligere bioparticles resultere i utvinning av blandet DNA-profiler. Samlingen av ikke-biologisk materiale kan innføre inhibitorer inn i mikro-volum lyse / STR reaksjoner. Hvis flere bioparticles er samlet med det samme klebemiddel "ball", er det et potensial for tidligere innsamlede bioparticles å bli fristilt fra limet. Det er ikke ofte observeres, men kan skje når et større antall bioparticles samles (f.eks over 50) med et enkelt lim "ball". Hvis et stort antall bioparticles er rettet, er det anbefalt at flere samlinger av færre bioparticles er gjort, men alle overført inn i den samme 0,2 ml rør. Når bioparticles er blitt samlet inn, må man være forsiktig under fjerning av gel-film lysbilde fra objektbordet og plassering av et 0,2 ml rør, slik at tuppen av nålen ikke er forstyrret. Under plassering av spissen av nålen i forsterkning blanding i bunnen av 0,2 ml rør, bør spissen av nålen ikke i kontakt med de sider av røret for å unngå tap av materiale på sidene av røret. Mens oppløsningen av klebemidlet er vanligvis hurtig (~ 30 sek eller mindre avhengig av størrelsen av limet "ball") og kan overvåkes ved mikroskopisk undersøkelse, må spissen av nålen langsomt fjernet fra forsterker blanding for å sikre at fullstendig solubiliseringav klebemidlet er blitt oppnådd. Hvis limet ikke er fullstendig oppløst, kan nålen bli returnert til væsken for å tillate fullstendig oppløsning.
Protokollen beskrevet her har blitt optimalisert for bruk med bioparticles og menneskelige celler fra rettsmedisinske biologiske bevis. Den lyseringsbuffer valgt er kompatibelt med den valgte DNA-STR amplifikasjon kit. Selv om det kan være gode alternative lyse buffere, må deres effektivitet i form av cellelyse og kompatibilitet med genetisk analyse verifiseres av brukeren. I tillegg har den STR forsterkning kit og forsterkning syklus nummer beskrevet i denne protokollen er optimalisert for bruk med én eller noen få bioparticles. En neste generasjon STR forsterkning kit med rapporterte øket robusthet og sensitivitet ble valgt ut og har vist seg å resultere i utvinning av høy kvalitet STR profiler fra én eller noen få bioparticles. Mens mange andre STR kits, med varierende anbefales Amplifisjonssykkel tall, er tilgjengelige, kan de ikke ha egnet følsomhet og derfor må være skikkelig evaluert før bruk i disse protokollene.
Til tross for vellykket bruk av de beskrevne metoder for utvinning STR profiler fra én eller noen få bioparticles, vil suksessraten av profilen utvinning ikke være 100%. Derfor, for enkelte prøver kan observeres en begrenset partiell DNA-profil eller ingen profil. Dette kan ikke unngås på grunn av den manglende evne til å entydig visuelt identifisere de fleste bioparticles som cellemateriale, potensialet nedbrutt tilstand av kjernemateriale i de innsamlede bioparticles eller tap av prøvemateriale fra klebemidlet før overføringen til reaksjonsbeholderen. Derfor er analyse av en enkelt prøve for hver bioparticle berøring DNA-element som ikke er anbefalt. Vi ofte samle 20 prøvesett fra en individuell gel-film prøven og vil samle flere prøvesett som nødvendig hvis en passende STR-profil ikke oppnås. THan eneste begrensningen for samlingene er mengden av biologisk materiale som er tilstede i gel-film prøven (og sannsynligvis kostnadene for analyse, selv om microvolume reaksjoner gir mulighet til å samle inn ytterligere prøver for en tilsvarende eller lavere kostnad som en enkelt standard reaksjonsvolum ( f.eks 25 ul).
De utviklede DNA-profilering metodene beskriver her gi en molekylær basert tilnærming til karakterisering, analyse og tolkning av spor biologisk materiale utvunnet fra berørings DNA-prøver. Det er imidlertid ytterligere genetisk informasjon som kan oppnås fra de utvunnede bioparticles i tillegg til bestemmelse av donor (dvs. STR profil) av donor av det biologiske materialet. Vev eller kroppsvæske opphav (f.eks hud versus spytt) kan gi viktig kontekstuell informasjon til en kriminell etterforskning. Uten en slik bestemmelse, kan tvetydigheten vevskilden opprinnelses bli Exploset som alternative omstendighetene rundt forbrytelsen (f.eks, hvordan kroppsvæske kan ha blitt deponert) kunne bli foreslått. De bioparticle innsamling og isoleringsmetoder som er beskrevet her kan brukes til å samle bioparticles eller andre celler (f.eks, buccal, vaginal) for bruk i en vevskilde identifikasjon (mRNA profilerings 21-30) strategi som involverer mikro volum revers transkripsjon (RT) og amplifiseringsreaksjoner. Med ytterligere optimalisering kan det også være mulig å utvikle en DNA / RNA-isolering co strategi for å muliggjøre celletypeidentifikasjonen (RNA) og STR profilering fra samme prøve, inkludert bioparticles fra touch DNA bevis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SealRite 1.5 ml natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous alternative suppliers are available, but tubes should be sterile |
| 0.2 ml PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
| Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
| Sterile water | 18.2 MΩ, autoclaved | ||
| Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1 mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
| Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
| Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
| Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,000 μl | various | ||
| Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
| Mini-centrifuge | various | ||
| Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
| GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
| GeneMapper software | Life Technologies | various | various versions of the software are available and can be used |
| WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
| Double sided tape | various | ||
| Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
| 3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
| Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 μl portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 μl is used for each sample. To prepare 10 μl of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 μl sterile water, 2.1 μl 10x buffer - blue, 1 μl forensicGEM. |
| STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 μl PCR reaction mix, 1.1 μl Primer set, 0.2 μl (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 μl of the prepared mix is added to the 0.2 ml tube for bioparticle collection. |
| AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
| HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
| GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
| 96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
| Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
| Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |
References
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Getting blood from a stone': ultrasensitive forensic DNA profiling of microscopic bio-particles recovered from 'touch DNA' evidence. Methods Mol.Biol. 1039, 3-17 (2013).
- Balogh, M. K., Burger, J., Bender, K., Schneider, P. M., Alt, K. W. STR genotyping and mtDNA sequencing of latent fingerprint on paper. Forensic Sci Int. 137 (2-3), 188-195 (2003).
- Barbaro, A., Cormaci, P., Teatino, A., La, M. A., Barbaro, A. Anonymous letters? DNA and fingerprints technologies combined to solve a case. Forensic Sci Int. 146, S133-S134 (2004).
- Bright, J. A., Petricevic, S. F. Recovery of trace DNA and its application to DNA profiling of shoe insoles. Forensic Sci.Int. 145 (1), 7-12 (2004).
- Castello, A., Alvarez, M., Verdu, F. DNA from a Computer Keyboard. Forensic Science Communications. 6 (3), (2004).
- Horsman-Hall, K. M., et al. Development of STR profiles from firearms and fired cartridge cases. Forensic Sci Int. Genet. 3 (4), 242-250 (2009).
- Petricevic, S. F., Bright, J. A., Cockerton, S. L. DNA profiling of trace DNA recovered from bedding. Forensic Sci. Int. 159 (1), 21-26 (2006).
- Oorschot, R. A., Jones, M. K.
- Sewell, J., et al. Recovery of DNA and fingerprints from touched documents. Forensic Sci Int.Genet. 2 (4), 281-285 (2008).
- Raymond, J. J., van Oorschot, R. A., Gunn, P. R., Walsh, S. J., Roux, C. Trace evidence characteristics of DNA: A preliminary investigation of the persistence of DNA at crime scenes. Forensic Sci Int Genet. 4 (1), 26-33 (2009).
- Wickenheiser, R. A. Trace DNA: a review, discussion of theory, and application of the transfer of trace quantities of DNA through skin contact. J.Forensic Sci. 47 (3), 442-450 (2002).
- Sweet, D., Lorente, M., Lorente, J. A., Valenzuela, A., Villanueva, E. An improved method to recover saliva from human skin: the double swab technique. J. Forensic Sci. 42 (2), 320-322 (1997).
- Molecular Biology of the Skin - the Keratinocyte. Darmon, M. M., Blumenberg, M. M. , Academic Press. San Diego, CA. (1993).
- Daly, D. J., Murphy, C., McDermott, S. D. The transfer of touch DNA from hands to glass, fabric and wood. Forensic Sci Int Genet. 6 (1), 41-46 (2012).
- Goray, M., Eken, E., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Secondary DNA transfer of biological substances under varying test conditions. Forensic Sci Int Genet. 4 (2), 62-67 (2010).
- Goray, M., Mitchell, R. J., van Oorschot, R. A. Investigation of secondary DNA transfer of skin cells under controlled test conditions. Leg.Med.(Tokyo). 12 (3), 117-120 (2010).
- Lowe, A., Murray, C., Whitaker, J., Tully, G., Gill, P. The propensity of individuals to deposit DNA and secondary transfer of low level DNA from individuals to inert surfaces. Forensic Sci Int. 129 (1), 25-34 (2002).
- Phipps, M., Petricevic, S. The tendency of individuals to transfer DNA to handled items. Forensic Sci Int. (2-3), 168-162 (2007).
- Zoppis, S., et al. DNA fingerprinting secondary transfer from different skin areas: Morphological and genetic studies. Forensic Sci Int Genet. 11, 137-143 (2014).
- Gill, P. Misleading DNA Evidence: Reasons for Miscarriages of Justice. , Academic Press - Elsevier. (2014).
- Haas, C., Hanson, E., Ballantyne, J. Capillary electrophoresis of a multiplex reverse transcription-polymerase chain reaction to target messenger RNA markers for body fluid identification. Methods Mol. Biol. 830, 169-183 (2012).
- Hanson, E., Ballantyne, J. RNA Profiling for the Identification of the Tissue Origin of Dried Stains in Forenic Biology. Forensic Sci Rev. , 22145-22157 (2010).
- Hanson, E., Haas, C., Jucker, R., Ballantyne, J. Specific and sensitive mRNA biomarkers for the identification of skin in 'touch DNA' evidence. Forensic Sci Int Genet. 6, 548-558 (2012).
- Hanson, E. K., Ballantyne, J. Highly specific mRNA biomarkers for the identification of vaginal secretions in sexual assault investigations. Sci Justice. 53 (1), 14-22 (2013).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Messenger RNA profiling: a prototype method to supplant conventional methods for body fluid identification. Forensic Sci Int. 135 (2), 85-96 (2003).
- Juusola, J., Ballantyne, J. Multiplex mRNA profiling for the identification of body fluids. Forensic Sci Int. 152 (1), 1-12 (2005).
- Fleming, R. I., Harbison, S. The development of a mRNA multiplex RT-PCR assay for the definitive identification of body fluids. Forensic Sci Int Genet. 4 (4), 244-256 (2010).
- Haas, C., Klesser, B., Maake, C., Bar, W., Kratzer, A. mRNA profiling for body fluid identification by reverse transcription endpoint PCR and realtime PCR. Forensic Sci Int Genet. 3 (2), 80-88 (2009).
- Lindenbergh, A., et al. A multiplex (m)RNA-profiling system for the forensic identification of body fluids and contact traces. Forensic Sci Int Genet. 6 (2), 565-577 (2012).
- Richard, M. L., et al. Evaluation of mRNA marker specificity for the identification of five human body fluids by capillary electrophoresis. Forensic Sci Int Genet. 6 (4), 452-460 (2012).
