Här beskriver vi en optimerad och effektiv strategi borttagning för insamling av biologiska partiklar i "röra DNA" prov, tillsammans med en förbättrad förstärkningsprotokoll som involverar ett steg 5 pl mikrovolym lys / STR förstärkning, för att möjliggöra återvinning av kort tandem repeat (STR) profiler av bio-partikeln donator (s).
DNA-profiler kan erhållas från "touch-DNA" bevis, som omfattar mikroskopiska spår av mänskligt biologiskt material. Nuvarande metoder för återvinning av spår DNA anställa bomullspinnar eller tejp för att prova ett område av intresse. Dock kommer en sådan "blinda-svabbar" -strategi co-prov cellmaterial från olika individer, även om individernas cellerna är belägna i geografiskt skilda platser på posten. Således några av de DNA-blandningar som uppstått i berörings DNA-prover är artificiellt skapas av svabbar själv. I vissa fall kan en offrets DNA hittas i betydande överskott därmed maskera eventuella gärningsmannens DNA.
För att kringgå de utmaningar med standardmetoder för återvinning och analys, har vi utvecklat en lägre kostnad, "smart analys" metod som leder till förbättrad genetisk analys av beröring DNA-bevis. Vi beskriver en optimerad end effektiv mikromanipulering återhämtningsstrategi för insamling av biologiska partiklar i kontakt DNA-prover, samt en förbättrad strategi förstärkning involverar ett steg 5 pl microvolume lys / STR förstärkning för att tillåta återvinning av STR-profiler från bio-partikeln donator (s). Användningen av enskilda eller få (dvs, "klumpar") biopartiklar ger möjligheten att få enstaka källprofiler. Dessa förfaranden representerar alternativa förbättrade tekniker för isolering och analys av enskilda biopartiklar från kriminaltekniska beröring DNA-bevis. Även om inte nödvändigt i alla rättsmedicinsk undersökning, kunde metoden vara till stor nytta för återvinning av en enda källa gärningsmannen DNA-profil i fall som rör fysisk misshandel (t.ex. strypning) som kanske inte är möjligt att använda standardanalystekniker. Dessutom de strategier som utvecklats här erbjuder en möjlighet att få genetisk information vid enstaka cellnivå från en mängd olika ofins icke forensic spår biologiskt material.
Touch-DNA är en form av spår biologiska bevis som är direkt överföring av cellmaterial (t.ex. skjul hudceller) från en individ till ett objekt eller en annan individ under fysisk kontakt 1. Förmågan att få DNA-profiler från en mängd olika berörde objekt (dokument, sängkläder, skor, skjutvapen, dricka behållare, pennor, portfölj handtag) har rapporterats i litteraturen 2-9.
En kritisk faktor i analysen av beröring DNA-bevis är den lyckad återhämtning av spår biologiskt material närvarande. Peka DNA-bevis är vanligtvis samlas in av badda det misstänkta området med en steril bomullspinne (kallad "blinda-svabbar"). Med användning av detta tillvägagångssätt, är naturen av det insamlade biologiska materialet inte känd och provtagning av en generaliserad område utförs. Förekomsten av spår eller sprickor yta kan hindra framgångsrik återhämtning av ofta redan liten mängd bimiologiska material närvarande. Dessutom en "blind svabbar" tillvägagångssätt kommer nödvändigtvis samarprovcellmaterial från de olika individer vars celler är närvarande på objektet, även om individernas cellerna finns i rumsligt distinkta platser på posten. Återhämtningen av blandade DNA-profiler, som ofta är utmanande att lösa särskilt med låg mall DNA-prover, observeras ofta 8,10,11 och i många fall kommer att vara en följd artefakt av svabbar processen. Om endast en liten mängd material var närvarande från en av givarna, kan standard utvinning och analystekniker misslyckas med att återhämta sig en profil från mindre bidragsgivaren. Dessutom, vilken typ av kompress eller om det användes torr eller våt (pre-fuktad med sterilt vatten) kan påverka mängden biologiskt material som samlas in på grund av skillnader i absorptivitet och adsorptivitet och effektiviteten i frisättningen av det biologiska materialet 12. Standard utvinningsmetoder kan resultera i ytterligare provförlust på grund krävs fysisk manipulation av provet eller provöverföringssteg.
Som beskrivits ovan, kan enkla bomullstopp tekniker för återvinning av biologiskt material resultera i förlust av spårmängder av biologiskt prov samt en ökad förekomst av blandade profiler pågrund av en underlåtenhet att separera enskilda biologiska komponenter. Därför försökte vi utveckla mer selektiva och effektiva återhämtningsstrategier för insamling av cellulära mikropartiklar som finns på berört objekt. Den utvecklade strategin för analys av biologiskt material från beröring DNA-bevis (som här kallas "biopartiklar" på grund av det faktum att en kärna är inte alltid synlig eftersom en majoritet av de celler som finns i det yttre epidermal lagret av huden är döda eller döende keratinocyter 13) innebär följande: 1) insamling av biologiskt material (dvs biopartiklar) via gel-film frOm rörde föremål och ytor, slitna kläder poster eller direkt mänsklig hud, 2) mikroskopisk undersökning av det återvunna biologiskt material för att säkerställa uppbörden av potentiella humanbiologiskt material, och 3) mikromanipulering av enstaka eller några få bio-partiklar med hjälp av en vattenlösligt lim, och 4) autosomalt DNA-STR profilering av de insamlade biologiska partiklar med hjälp av en microvolume (5 pl) ett steg lys / amplifieringsreaktion.
Detta förfarande erbjuder många fördelar jämfört med traditionellt använda analysmetoder. Återvinning av biopartiklar som använder gel-filmen tillåter en mikroskopisk undersökning av det biologiska materialet som finns i provet före analys. Medan en majoritet av de utvunna från beröring DNA-bevis biopartiklar kanske inte är kärnförsedda celler vilket gör det svårare att avgöra vilka eller hur många biologiska partiklar bör väljas, den mikroskopisk undersökning av dessa prover före analys ger till möjligheten att söka efter kärnförsedda celler sålunda maximizing sannolikheten för DNA-profil återhämtning. Insamlingen av biopartiklar använder vattenlösligt lim assisterad mikromanipulation medger direkt överföring av riktade biopartiklar i reaktionsrören. Detta förfarande visualiseras under mikroskop för att säkerställa framgångsrik överföring av det biologiska materialet. Det reducerade eller microvolume reaktion ökar känsligheten samtidigt minska kostnaden för analys per prov. Detta möjliggör analys av ökat antal prover från en enskild bevis. På grund av intervallet i den genetiska tillstånd av bio-partiklar i kontakt DNA-bevis, är flera provtagningar från enskilda objekt rekommenderas.
Här visar vi en framgångsrik användning av de utvecklade protokoll för att få högt bevisvärde genetiska profiler av givarna av biologiskt material i kontakt DNA-bevis. De utvecklade bioparticle insamling och DNA profilering metoder ge en heltäckande "smart" (dvs, specifika, mätbara, attainable och realistiska) molekylär baserad strategi för karakterisering, analys och tolkning av spår biologiskt material. Medan ursprungligen utvecklades för applicering på kriminalteknisk analys av beröring DNA-bevis, kan de strategier som utvecklats här tillämpas på andra källor för biologiskt material och erbjuder en möjlighet att få individuell identifierande information på enskild cellnivå.
Här har vi beskrivit metoder för insamling och förbättrad genetisk analys av biopartiklar återvinns från beröring DNA-bevis. Den utvecklade synsätt innebär följande: 1) insamling av biologiskt material (dvs biopartiklar) via gel-filmen från berört föremål och ytor, slitna kläder poster eller direkt mänsklig hud, 2) mikroskopisk undersökning av det återvunna biologiskt material för att säkerställa uppbörden av potentiella humant biologiskt material, och 3) mikromanipulering av enstaka eller ett fåtal biopartiklar användning av ett vattenlösligt lim, och 4) autosomal DNA-STR profilering av de uppsamlade biopartiklar som använder en microvolume (5 | il) en-steg-lys / amplifieringsreaktion. Användningen av en en-stegs slutna röret reaktion minskar risken för förorening och provförlust från ytterligare prov manipulationer eller överföring till andra reaktionsrör. Den förbättrade ett steg microvolume (5 pl) lys / STR amplifieringsreaktionerna medger återvinning av helt eller probative STR profiler av givaren av enstaka eller några få biopartiklar. Detta tillvägagångssätt har utvecklats för att få enstaka källa STR profiler från enkel- och fler source beröring DNA-bevis (t.ex., slitna objekt kläder och andra hushållsartiklar, berört / hanteras föremål och ytor, hud / hud blandningar). Det har framgångsrikt använts för detektion av den manliga donator i simulerade fysiska misshandel blandning prover.
Detta tillvägagångssätt skulle utvärderas ytterligare i ytterligare kroppsvätska / vävnads blandningen scenarier som ett offer kliade sig / hennes angripare, där endast ett fåtal biopartiklar från gärningsmannen skulle vara närvarande bland en överväldigande mängd biologiskt material från offret. Dessutom, eftersom detta tillvägagångssätt utvecklats i den aktuella studien tillåter analys vid den enda bioparticle nivån, det skulle kunna användas för att få en bättre förståelse av arten och omfattningen av sekundär överföring 14-19, där en mellanhand överför en DNA-profil på en surface, föremål eller person till en annan yta föremålet eller personen 20. En blind-svabbar förhållningssätt till analysen av sekundära överföringen kan misslyckas med att identifiera spårmängder av material från den sekundära givaren. Den metod som utvecklats här tillåter analys av enstaka eller några få biopartiklar varför resultaten inte förväxlas genom närvaron av en överväldigande mängd biologiskt material från den primära donator. De metoder som utvecklats i detta arbete kan också få konsekvenser för analys av spår biologiskt material i sexuella övergrepp fall som exempelvis innebär digital penetration av slidan där positiv identifiering av spårmängder av hudceller från gärningsmannen kan vara avgörande för att fastställa att sexuell kontakt inträffade.
Medan insamling av biopartiklar från gel-filmprov inte innebär svåra och komplexa manipulationer, det finns kritiska steg i denna procedur som måste utföras med stor omsorg för att se till successful överföring av biopartiklar till nedströmsreaktionskärlet. Insamlingen av biopartiklar med vattenlösligt lim måste ses mikroskopiskt (dvs, stereo vid hög förstoring (~ 200-300X) för att se till att endast de biopartiklar av intresse samlas. Beroende på storleken av limmet "boll" används finns finns risk för att samla in ytterligare omgivande material som kan innefatta både biologiska och icke-biologiska material (t.ex., fibrer, annat skräp). får Insamlingen av oavsiktliga ytterligare biopartiklar resultera i återhämtningen av blandade DNA-profiler. Insamlingen av icke-biologiskt material får införa hämmare in i mikrovolym lys / STR reaktioner. Om flera biopartiklar samlas med samma klister "boll", det finns en potential för tidigare insamlade biopartiklar att lossna från limmet. Detta är inte frekvent, men kan inträffa när större antal bioparticles samlas (t.ex. över 50) med en enda klister "boll". Om ett stort antal biopartiklar är riktade, rekommenderas att flera samlingar av färre biopartiklar görs men alla överförda till samma 0,2 ml rör. När biopartiklar har samlats, måste man vara försiktig vid avlägsnandet av gel-filmen slide från mikroskopet scenen och placeringen av 0,2 ml rör, så att spetsen på nålen inte störs. Under placeringen av spetsen på nålen i huvudblandningen vid botten av 0,2 ml rör, bör nålspetsen inte göra kontakt med de sidor av röret, för att undvika förlust av material på sidorna av röret. Medan solubilisering av bindemedlet är typiskt snabb (~ 30 sek eller mindre beroende på storleken av limmet "boll") och kan övervakas under mikroskopisk undersökning, bör nålspetsen avlägsnas långsamt från huvudblandningen för att säkerställa att fullständig solubiliseringav bindemedlet har uppnåtts. Om limmet inte fullständigt har lösts upp, kan nålen återföras till vätskan för att medge fullständig upplösning.
De protokoll som beskrivs här har optimerats för användning med biopartiklar och mänskliga celler från rättsmedicinsk biologisk bevis. Den lysbuffert valda är kompatibelt med den utvalda DNA-STR amplifieringskit. Även om det kan finnas lämpliga alternativa lys buffertar, måste deras effektivitet i termer av cellysering och kompatibilitet med nedströms analys kontrolleras av användaren. Dessutom har STR amplifieringskit och amplifieringscykel nummer beskrivs i detta protokoll optimerats för användning med enstaka eller några biopartiklar. Ett nästa generations STR förstärkning kit med rapporterat ökad robusthet och känslighet valdes och har visat sig resultera i återhämtningen av högkvalitativa STR-profiler från enstaka eller några få biopartiklar. Medan många andra STR kit, med varierande rekommenderas Amplifitionscykelnummer, finns tillgängliga, kan de inte ha lämplig känslighet och därför skulle behöva utvärderas ordentligt innan de används i dessa protokoll.
Trots den framgångsrika användningen av de beskrivna metoderna för återvinning STR profiler från enstaka eller några biopartiklar, kommer andelen framgångsrika profil återhämtning inte vara 100%. Därför, för vissa prover en begränsad partiell DNA-profil eller någon profil kan observeras. Detta kan inte undvikas på grund av oförmåga att slutgiltigt visuellt identifiera de flesta biopartiklar som cellmaterial, den potentiella försämrat tillstånd av kärnämnet i de insamlade biopartiklar eller förlust av provmaterial från limmet före överföringen i reaktionskärlet. Därför är analysen av ett enda bioparticle prov för varje beröring DNA post rekommenderas inte. Vi samlar ofta 20 provuppsättningar från en individuell gel-film prov och kommer att samla in ytterligare provningssatser som behövs om en lämplig STR-profil inte erhålls. Than bara begränsning för samlingarna är mängden biologiskt material som finns på prov gel-film (och troligen kostnaden för analysen, även om microvolume reaktionerna ger möjlighet att samla in ytterligare prover för en liknande eller lägre kostnad som en enda standard reaktionsvolym ( t.ex., 25 pl).
De utvecklade DNA profilering metoder beskriver här ger en molekylbaserad strategi för karakterisering, analys och tolkning av spår biologiskt material återvinns från berörings DNA-prover. Det finns dock ytterligare genetisk information som kan erhållas från de utvunna biopartiklar utöver bestämning av donator (dvs., STR-profil) av givaren av det biologiska materialet. Vävnaden eller kroppsvätska ursprungskälla (t.ex. hud kontra saliv) kan ge viktig bakgrundsinformation som en brottsutredning. Utan en sådan beslutsamhet, kan den tvetydighet av vävnadskällan ursprungs Explosad som alternativa omständigheterna kring brottet (t.ex. hur kroppsvätska kan ha deponerats) kunde föreslås. De bioparticle insamling och isolerings protokoll som beskrivs här kan användas för att samla biopartiklar eller andra celler (t.ex., buckal, vaginal) för användning i en vävnadskälla identifikation (mRNA profiling 21-30) strategi som innebär mikro volym omvänd transkription (RT) och amplifieringsreaktioner. Med ytterligare optimering kan det även vara möjligt att utveckla ett DNA / RNA co-isolering strategi att tillåta celltyp identifiering (RNA) och STR profilering från samma prov, inklusive biopartiklar från beröring DNA-bevis.
The authors have nothing to disclose.
The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile |
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
Sterile water | 18.2 mega-ohm, autoclaved | ||
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL | various | ||
Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
Mini-centrifuge | various | ||
Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
GeneMapper software | Life Technologies | various | Various versions of the software are available and can be used |
WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
Double sided tape | various | ||
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. |
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. |
AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |