Her beskriver vi en optimeret og effektiv fjernelse strategi for indsamling af bio-partikler i "røre DNA 'prøver, sammen med en forbedret amplifikationsprotokol involverer en et-trins 5 pi mikro-volumen lyse / STR forstærkning, for at tillade genvinding af kort tandemgentagelse (STR) profiler af bio-partikel donor (s).
DNA-profiler kan fås fra 'berøring DNA' beviser, som omfatter mikroskopiske spor af menneskeligt biologisk materiale. Aktuelle metoder til genopretning af spor DNA ansætte vatpinde eller tape til at prøve et interesseområde. Dog vil en sådan »blind-pensling" tilgang co-prøve cellulært materiale fra forskellige individer, selv om den enkeltes celler er placeret i geografisk adskilte steder på emnet. Således er nogle af de DNA-blandinger stødt kontakten DNA-prøver kunstigt skabt af pensling selv. I nogle tilfælde kan et offers DNA findes i betydelige overskud dermed maskering enhver potentiel gerningsmand DNA.
For at omgå udfordringerne med standard nyttiggørelse og analysemetoder, har vi udviklet en lavere pris, "intelligent analyse« metode, som medfører forøget genetisk analyse af trit DNA-beviser. Vi beskriver en optimeret end effektiv mikromanipuleringer recovery strategi for indsamling af bio-partikler i kontakt DNA-prøver, samt en forbedret forstærkning strategi med en et-trin 5 pi microvolume lyse / STR forstærkning for at tillade udvinding af STR-profiler fra bio-partikel donor (s). Brugen af individuelle eller få (dvs. "klumper") biopartikler resulterer i evnen til at opnå en enkelt kilde profiler. Disse procedurer udgør alternative forbedrede teknikker til isolering og analyse af enkelte biopartikler fra retsmedicinsk touch-DNA-beviser. Selv om det ikke er nødvendigt i hvert retsmedicinsk undersøgelse, kan metoden være yderst gavnligt for inddrivelse af en enkelt kilde gerningsmanden dna-profil i sager om fysiske overgreb (fx kvælning), som måske ikke muligt ved hjælp af standard analyseteknikker. Derudover de strategier, der er udviklet her giver mulighed for at få genetisk information på enkelt celle niveau fra en række forskellige other ikke-retsmedicinsk spor biologisk materiale.
Touch-DNA er en form for spor biologiske beviser, som er den direkte overførsel af cellemateriale (f.eks kaste hudceller) fra et individ til et objekt eller en anden person under fysisk kontakt 1. Evnen til at få DNA-profiler fra en række rørt objekter (dokumenter, sengetøj, sko, skydevåben, drikke containere, kuglepenne, håndtag dokumentmappe) er blevet rapporteret i litteraturen 2-9.
En kritisk faktor i analysen af touch-DNA-beviser er en vellykket genopretning af spor biologisk materiale til stede. Touch DNA-beviser er typisk indsamlet af pensling den mistænkte område med en steril vatpind (omtalt som "blind-pensling"). Ved anvendelse af denne fremgangsmåde, er arten af det indsamlede biologiske materiale ikke kendt, og prøveudtagning af en generaliseret område udføres. Tilstedeværelsen af overfladevand riller eller sprækker kan hindre en vellykket inddrivelse af de ofte allerede lille mængde bigiske materiale til stede. Derudover en 'blind-pensling tilgang nødvendigvis co-prøve cellulært materiale fra forskellige individer, hvis celler er til stede på det element, selv om den enkeltes celler er placeret i rumligt adskilte steder på emnet. Genopretningen af iblandede dna-profiler, der ofte udfordrende at løse især lav skabelon DNA-prøver, der ofte observeres 8,10,11 og i mange tilfælde vil være en konsekvens artefakt af pensling selve processen. Hvis kun en lille mængde materiale var til stede fra en af donorerne, kan standard udvinding og analyseteknikker undlader at inddrive en profil fra den mindre bidragyder. Derudover type vatpind eller om det blev anvendt tør eller våd (præ-fugtet med sterilt vand) kan påvirke mængden af biologisk materiale, der er indsamlet på grund af forskelle i absorptionsevne og adsorptionsevne og effektiviteten af frigivelse af det biologiske materiale 12. Standard ekstraktionsmetoder kan medføre yderligere tab prøve på grund af behov fysisk manipulation af prøven eller prøve transfer trin.
Som beskrevet ovenfor, kan simple pensling teknikker til genvinding af biologisk materiale resultere i tab af spormængder af biologisk prøve samt en øget forekomst af iblandede profiler på grund af en manglende særskilte individuelle biologiske komponenter. Derfor søgte vi at udvikle mere selektive og effektiv inddrivelse strategier for indsamling af cellulære mikropartikler til stede på rørt objekter. Den udviklede strategi til analyse af biologisk materiale fra kontakten DNA beviser (her benævnt "biopartikler" på grund af det faktum, at en kerne er ikke altid synlige, da størstedelen af de celler, der findes i det ydre epidermale lag af huden er døde eller døende keratinocytter 13) omfatter følgende: 1) indsamling af biologisk materiale (dvs. biopartikler) via gel-film frabout rørt genstande og overflader, slidte tøj eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøgelse af den genvundne biologisk materiale for at sikre indsamling af potentiel menneskeligt biologisk materiale, og 3) mikromanipuleringsmetoder af enkelte eller få bio-partikler ved hjælp af en vandopløselig lim, og 4) autosomal DNA-STR profilering af de indsamlede bio-partikler ved hjælp af en microvolume (5 pi) et-trins lyse / amplifikationsreaktion.
Denne procedure giver adskillige fordele i forhold til traditionelt anvendte analysemetoder. Genvinding af biopartikler hjælp af gel-film tillader en mikroskopisk undersøgelse af det biologiske materiale til stede i prøven forud for analyse. Mens et flertal af de biopartikler udvundet fra touch-DNA-beviser ikke kan være celler med kerne, hvilket gør det vanskeligere at afgøre, hvilke eller hvor mange bio-partikler bør vælges, den mikroskopiske undersøgelse af disse prøver inden analyse giver en chance for at søge efter celler med kerne således maximizing sandsynligheden for dna-profil opsving. Indsamlingen af biopartikler hjælp af vandopløseligt selvklæbende assisteret mikromanipulering tillader direkte overførsel af målrettede biopartikler i reaktionsrør. Denne procedure er visualiseret under mikroskop for at sikre en vellykket overførsel af biologisk materiale. Den reducerede eller microvolume reaktion øger følsomheden og samtidig reducere omkostningerne til analyse pr prøve. Dette tillader analyse af øget antal prøver fra en individuel bevis. På grund af det område i den genetiske tilstand af bio-partikler i kontakt DNA-beviser er flere prøvetagninger fra enkelte poster anbefales.
Her viser vi den vellykkede brug af de udviklede protokoller til at opnå meget overbevisende genetiske profiler af donorer af biologisk materiale i kontakt DNA-beviser. De udviklede bioparticle indsamlings- og DNA-profilering metoder giver en omfattende 'smart' (dvs. specifikke, målelige, attainable, realistiske og rettidige) molekylær tilgang til karakterisering, analyse og fortolkning af spor biologisk materiale. Mens oprindeligt udviklet til anvendelse til retskemisk analyse af trit DNA-beviser, kan de strategier, der er udviklet her blive anvendt på andre kilder til biologisk materiale og giver en mulighed for at få individuelle identifikationsoplysninger på enkelt celle niveau.
Her har vi beskrevet metoder til indsamling og øget genetisk analyse af biopartikler udvundet fra touch-DNA-beviser. Den udviklede metode involverer følgende: 1) indsamling af biologisk materiale (dvs. biopartikler) via gel-film fra rørt genstande og overflader, slidte tøj eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøgelse af den genvundne biologisk materiale for at sikre samling af potentielle humant biologisk materiale, og 3) mikromanipulering af enkelt eller få biopartikler anvendelse af et vandopløseligt klæbemiddel, og 4) autosomal DNA-STR profilering af de indsamlede biopartikler bruger microvolume (5 pi) i ét trin lysis / amplifikationsreaktion. Brugen af en et-trins lukkede rør reaktion reducerer risikoen for forurening og prøve tab fra yderligere prøve manipulationer eller overførsel til andre reaktionsrør. Den forbedrede en-trin microvolume (5 pi) lysis / STR amplificeringsreaktioner tillader inddrivelse af hel eller probative STR profiler af donoren af enkelte eller få biopartikler. Denne fremgangsmåde blev udviklet for at opnå en enkelt kilde STR profiler fra enkelt- og multi-source touch-DNA-beviser (f.eks, slidte tøj og andre husholdningsartikler, rørt håndteres / genstande og overflader, hud / hud blandinger). Det har med succes været anvendt til påvisning af den mandlige donor i simulerede fysiske overgreb blandingen prøver.
Denne strategi kunne evalueres yderligere i yderligere kropsvæske / væv blandingen scenarier såsom et offer skrabe hans / hendes voldsmand, hvor kun få biopartikler fra voldsmand ville være til stede blandt en overvældende mængde af biologisk materiale fra offeret. Derudover, da denne tilgang er udviklet i den aktuelle undersøgelse muliggør analyse på enkelt bioparticle niveau, det kunne bruges til at få en bedre forståelse af arten og omfanget af sekundær overførsel 14-19, hvor en mellemmand overfører en dna-profil på en Surface, genstand eller person til en anden overflade genstand eller person 20. En blind-pensling tilgang til analysen af sekundær overførsel kan ikke identificere spormængder af materiale fra den sekundære donor. Den fremgangsmåde udviklet her tillader analyse af enkelte eller få biopartikler, og derfor er resultaterne ikke forstyrret af tilstedeværelsen af en overvældende mængde af biologisk materiale fra den primære donor. De metoder, der er udviklet i dette arbejde kan også have konsekvenser for analyse af spor biologisk materiale i seksuelle overgreb tilfælde som dem, der involverer digitale penetration af skeden, hvor positiv identifikation af spormængder af hudceller fra gerningsmanden kan være afgørende at fastslå, at seksuel kontakt opstod.
Mens indsamling af biopartikler fra gel-film prøve ikke indebærer vanskelige og komplekse manipulationer, der er kritiske skridt i denne procedure, der skal udføres med stor omhu for at sikre, successful overførsel af biopartikler til den nedstrøms reaktionsbeholder. Samlingen af biopartikler med vandopløseligt klæbemiddel skal ses mikroskopisk (dvs. at stereomikroskop ved stor forstørrelse (~ 200-300X) sikre, at kun de biopartikler af interesse opsamles. Afhængig af størrelsen af klæbemidlet "bolden" bruges, er der er potentialet til at indsamle yderligere omgivende materiale, som kan omfatte både biologiske og ikke-biologisk materiale (f.eks, fibre, andet snavs). kan Indsamlingen af utilsigtede yderligere biopartikler medføre inddrivelse af sammenblandede DNA-profiler. Samlingen af ikke-biologisk materiale kan indføre inhibitorer ind i mikro-volumen lyse / STR reaktioner. Hvis flere biopartikler indsamles med samme lim "bold", er der et potentiale for tidligere indsamlede biopartikler at blive Ikkefastgjorte fra limen. Dette er ikke observeret hyppigere, men kan forekomme når større antal bioparticles er indsamlet (fx over 50) med en enkelt klæbemiddel "bolden". Hvis der målrettet et stort antal biopartikler, anbefales det, at flere samlinger af færre biopartikler er lavet, men alle overføres til samme 0,2 ml rør. Når biopartikler er blevet indsamlet, skal man være omhyggelig under fjernelse af gel-film slide fra mikroskopbordet og anbringelse af 0,2 ml rør, således at spidsen af nålen ikke forstyrres. Under placering af spidsen af nålen i amplificeringsblandingen nederst 0,2 ml rør, bør nålespidsen ikke komme i kontakt med siderne af røret for at undgå tab af materiale på siderne af røret. Mens solubilisering af klæbemidlet er typisk hurtig (~ 30 sek eller mindre afhængig af størrelsen af klæbemidlet "bolden") og kan overvåges under mikroskopisk undersøgelse bør kanylespidsen langsomt fjernes fra amplificeringsblandingen at sikre fuldstændig solubiliseringaf klæbemidlet er blevet opnået. Hvis klæbemidlet ikke er helt opløst, kan nålen blive returneret til væsken for at tillade fuldstændig opløsning.
De her beskrevne protokoller er blevet optimeret til brug med biopartikler og menneskelige celler fra retsmedicinsk biologiske beviser. Lysis buffer valgt, er kompatibel med det valgte DNA-STR amplifikation kit. Selvom der kan være passende alternative lysis buffere, skal deres effektivitet med hensyn til cellelyse og kompatibilitet med nedstrøms analyse kontrolleres af brugeren. Derudover har STR forstærkning kit og amplifikationscyklus nummer beskrevet i denne protokol er optimeret til brug med en enkelt eller få biopartikler. En næste generation STR forstærkning kit med rapporteret øget robusthed og følsomhed blev udvalgt og har vist sig at resultere i inddrivelse af høj kvalitet STR-profiler fra enkelte eller få biopartikler. Mens mange andre STR kits, med varierende anbefalet forstærker,kation cyklus tal, er til rådighed, kan de ikke råder over det fornødne følsomhed og derfor vil skulle evalueres korrekt før brug i disse protokoller.
På trods af den vellykkede anvendelse af de beskrevne metoder til genopretning STR profiler fra en enkelt eller få biopartikler vil succesraten for profil opsving ikke være 100%. Derfor kan for nogle prøver observeres en begrænset del dna-profil eller ingen profil. Dette kan ikke undgås på grund af den manglende evne til endegyldigt visuelt identificere de fleste biopartikler som cellulært materiale, den potentielle forringede tilstand af det nukleare materiale i de indsamlede biopartikler eller tab af prøvemateriale fra klæbemidlet før overførsel til reaktionsbeholderen. Derfor er analysen af en enkelt bioparticle prøve for hvert tryk DNA element ikke anbefales. Vi ofte indsamler 20 prøvesæt fra en person gel-film prøven og vil indsamle yderligere prøvesæt efter behov, hvis en egnet STR-profil ikke opnås. THan eneste begrænsning for samlinger er mængden af biologisk materiale til stede på gelen-film prøve (og sandsynligvis udgifter til analyse, selvom microvolume reaktioner giver mulighed for at indsamle yderligere prøver til en tilsvarende eller lavere pris som en enkelt standard reaktion volumen ( fx 25 pi).
De udviklede DNA-profilering metoder beskriver her giver en molekylær tilgang til karakterisering, analyse og fortolkning af spor biologisk materiale udvundet fra touch-DNA-prøver. Men der er yderligere genetisk information, der kan fås fra de gendannede biopartikler foruden bestemmelse af donor (dvs. STR profil) af donoren af det biologiske materiale. Vævet eller kropsvæske kilde til oprindelse (f.eks, hud versus spyt) kan tilvejebringe vigtige baggrundsoplysninger til en strafferetlig efterforskning. Uden en sådan bestemmelse, kan den tvetydighed af vævet kilde til oprindelseslandet eksplgrænset som alternative omstændigheder i kriminalitet (f.eks hvordan kroppen væske kan være deponeret) kunne foreslået. De bioparticle indsamling og isolation protokoller beskrevet her kan anvendes til at indsamle biopartikler eller andre celler (f.eks, buccal, vaginal) til anvendelse i et væv kildeidentifikation (mRNA profilering 21-30) strategi der involverer mikro-volumen revers transkription (RT) og amplifikationsreaktioner. Med yderligere optimering kan det også være muligt at udvikle en DNA / RNA co-isolation strategi at tillade celletype identifikation (RNA) og STR profilering fra den samme prøve, herunder biopartikler fra kontakt DNA-beviser.
The authors have nothing to disclose.
The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile |
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
Sterile water | 18.2 mega-ohm, autoclaved | ||
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL | various | ||
Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
Mini-centrifuge | various | ||
Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
GeneMapper software | Life Technologies | various | Various versions of the software are available and can be used |
WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
Double sided tape | various | ||
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. |
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. |
AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |