Her beskriver vi en optimalisert og effektiv fjerning strategi for innsamling av bio-partikler som finnes i 'berøre DNA' prøvene, sammen med en forbedret amplifikasjonsprotokoll involverer en ett-trinns 5 mL mikro-volum lyse / STR forsterkning, for å tillate utvinning av korte tandem gjentagelse (STR) profiler av bio-partikkel-donor (e).
DNA-profiler kan fås fra "touch DNA 'bevis, som består av mikroskopiske spor av humant biologisk materiale. Dagens metoder for utvinning av spor DNA ansette bomullspinner eller teip til å prøve et område av interesse. Imidlertid vil en slik "blind-swabbing 'tilnærming co-sample cellemateriale fra de forskjellige individer, selv om den enkeltes cellene er plassert i geografisk adskilte steder på varen. Dermed er noen av de DNA-blandinger oppstått i berørings DNA-prøver kunstig skapt av swabbing selv. I noen tilfeller kan en offerets DNA finnes i betydelig overskudd og dermed maske eventuelle gjerningsmannens DNA.
For å omgå utfordringene med standard utvinning og analysemetoder, har vi utviklet en lavere kostnad, "smart analyse 'metode som resulterer i økt genetisk analyse av berørings DNA-bevis. Vi beskriver en optimalisert end effektiv micromanipulation utvinning strategi for innsamling av bio-partikler som er tilstede i kontakt DNA-prøver, så vel som en forbedret forsterkning strategi som involverer en ett-trinns 5 ul microvolume lyse / STR forsterkning for å tillate utvinning av STR profiler fra bio-partikkel donor (e). Bruken av individuelle eller noen (dvs, "klumper") bioparticles resulterer i evnen til å oppnå enkel kildeprofiler. Disse fremgangsmåter representerer alternative forbedrede teknikker for isolering og analyse av enkelt bioparticles fra rettsmedisinske berøring DNA bevis. Selv om ikke nødvendig i alle rettsmedisinske undersøkelser, kan metoden være svært gunstig for utvinning av en enkelt kilde gjernings DNA-profil i saker om fysiske overgrep (for eksempel kvelning) som kanskje ikke være mulig å bruke standard analyseteknikker. I tillegg, strategier utvikles her tilbyr en mulighet til å oppnå genetisk informasjon på celle-nivået fra en rekke other ikke-rettsmedisinske spor biologisk materiale.
Berørings DNA er en form for spor biologiske bevis som er den direkte overføring av cellemateriale (f.eks felle hudceller) fra et individ til et objekt eller et annet individ i løpet av en fysisk kontakt. Evnen til å innhente DNA-profiler fra en rekke berørt objekter (dokumenter, sengetøy, sko, skytevåpen, drikkebeholdere, penner, koffert håndtak) er rapportert i litteraturen 2-9.
En kritisk faktor i analysen av berøring DNA bevis er vellykket gjenoppretting av sporet biologisk materiale som er tilstede. Trykk på DNA-bevis er vanligvis samlet inn av swabbing det mistenkte området med en steril bomullspinne (referert til som "blind-swabbing"). Ved hjelp av denne metode, er arten av det oppsamlede biologiske materialet ikke kjent, og sampling av en generalisert område er utført. Tilstedeværelsen av overflate riller eller sprekker kan hindre vellykket utvinning av ofte allerede liten mengde biological materiale til stede. I tillegg er en "blind-swabbing 'tilnærming vil nødvendigvis co-sample cellemateriale fra de ulike personer med celler er til stede på elementet, selv om den enkeltes cellene finnes i romlig forskjellige steder på varen. Gjenvinningen av blandet DNA-profiler, som ofte er vanskelig å løse spesielt med lavt templat DNA-prøver, blir ofte observert 8,10,11 og i mange tilfeller vil være et følge artefakt av swabbing prosessen. Hvis bare en liten mengde av materiale som var tilstede fra en av giverne, kan standard ekstraksjonsmetoder og analyseteknikker ikke klarer å gjenopprette en profil mot mindre bidragsyter. I tillegg er den type pinne eller om det ble brukt tørt eller vått (pre-fuktet med sterilt vann), kan påvirke mengden av biologisk materiale som er innsamlet på grunn av forskjeller i absorpsjonsevne og adsorpsjonsevne og effektiviteten av frigjøring av det biologiske materiale 12. Standard utvinning metoder kan føre til tilleggsutvalget tap på grunn av nødvendig fysisk manipulering av prøven eller prøveoverførings trinn.
Som beskrevet ovenfor, kan pensling enkle teknikker for utvinning av biologisk materiale resultere i tap av spormengder av biologisk prøve, så vel som en økt forekomst av blandet profiler på grunn av en manglende evne til å skille de enkelte biologiske komponenter. Derfor forsøkte vi å utvikle mer selektive og effektiv utvinning strategier for innsamling av cellulære mikropartikler til stede på berørt gjenstander. Den strategi utviklet for analyse av biologisk materiale fra berøring DNA bevis (referert til her som "bioparticles" på grunn av det faktum at en kjerne er ikke alltid synlig ettersom et flertall av celler som finnes i den ytre epidermale lag av huden er døde eller døende keratinocytter 13) innebærer følgende: 1) innsamling av biologisk materiale (dvs. bioparticles) via gel-film from rørt gjenstander og overflater, slitte klær eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøkelse av det utvunnede biologisk materiale for å sikre samling av potensiell human biologisk materiale, og 3) mikromanipulasjons av ett eller noen få bio-partikler ved bruk av et vannløselig klebemiddel, og 4) autosomal DNA-STR profilering av de innsamlede bio-partikler ved hjelp av en microvolume (5 mL) ett-trinns lyse / amplifikasjonsreaksjon.
Denne prosedyren gir en rekke fordeler fremfor tradisjonelt brukt analysemetoder. Utvinning av bioparticles ved hjelp av gel-filmen tillater en mikroskopisk undersøkelse av det biologiske materiale som er tilstede i prøven før analyse. Mens et flertall av bioparticles utvinnes fra berørings DNA-bevis kan ikke være kjerneholdige celler gjør det vanskeligere å avgjøre hvilke eller hvor mange bio-partikler bør velges, mikroskopisk undersøkelse av disse prøvene før analyse gir til muligheten til å søke etter nukleerte celler dermed maximizing sannsynligheten for DNA-profil utvinning. Samlingen av bioparticles ved hjelp av vannoppløselige klebemiddel-assistert micromanipulation tillater direkte overføring av målrettede bioparticles inn i reaksjonsrørene. Denne prosedyren blir visualisert under mikroskop for å sikre vellykket overføring av det biologiske materialet. Den reduserte eller microvolume reaksjon øker følsomheten og redusere kostnadene for analyse per prøve. Dette tillater analyse av økt antall prøver fra et individ stykke bevis. På grunn av omfanget i den genetiske tilstand av bio-partikler i berøring DNA-bevis, er flere prøvetakinger fra enkeltelementer anbefales.
Her demonstrerer vi vellykket bruk av de utviklede protokoller til å oppnå svært probative genetiske profiler av donorene av biologisk materiale i berøring DNA-bevis. De utviklet bioparticle innsamling og DNA-profilering metoder gir en omfattende "smart" (dvs. spesifikke, målbare, attainable, realistisk og tidsriktig) molekylær basert tilnærming til karakterisering, analyse og tolkning av spor biologisk materiale. Mens opprinnelig utviklet for søknad til rettsmedisinsk analyse av berøring DNA-bevis, kan de strategier utviklet her brukes til andre kilder til biologisk materiale og gir en mulighet til å få individuell identifiserende informasjon på celle-nivå.
Her har vi beskrevet metoder for innsamling og økt genetisk analyse av bioparticles utvinnes fra berørings DNA-bevis. Den utviklet tilnærming innebærer følgende: 1) innsamling av biologisk materiale (dvs. bioparticles) via gel-film fra berørt gjenstander og overflater, slitte klær eller direkte menneskelig hud, 2) mikroskopisk undersøkelse av gjenvunnet biologisk materiale for å sikre innsamling av potensiell humant biologisk materiale, og 3) micromanipulation av ett eller noen få bioparticles ved hjelp av et vannløselig klebemiddel, og 4) autosomal DNA-STR profilering av de innsamlede bioparticles ved hjelp av en microvolume (5 ul) ett-trinns lyse / amplifikasjonsreaksjonen. Bruken av en ett-trinns lukkede rør reaksjonen reduserer muligheten for forurensning og tap av prøven fra prøve ytterligere manipulasjoner eller overføring til andre reaksjonsrørene. Den forbedrede ett-trinns microvolume (5 mL) lyse / STR amplifikasjonsreaksjoner tillater gjenvinning av hele eller probative STR profiler av giveren av én eller noen få bioparticles. Denne tilnærmingen ble utviklet for å oppnå enkelt kilde STR profiler fra en- og flerkildeberørings DNA-bevis (f.eks, slitte klær og andre husholdningsartikler, rørte håndteres / objekter og overflater, hud / hud blandinger). Det har med hell blitt brukt for påvisning av hann donor i simulerte fysiske angrep blandede prøver.
Denne tilnærmingen kan bli ytterligere vurdert i flere kroppsvæske / vev blanding scenarier som et offer skrape hans / hennes overfallsmannen, der bare noen få bioparticles fra overfallsmannen ville være til stede blant en overveldende mengde av biologisk materiale fra offeret. I tillegg, siden denne tilnærmingen utviklet i denne studien tillater analyse på enkelt bioparticle nivå, det kan brukes til å få en bedre forståelse av arten og omfanget av sekundær overføring 14-19, hvor en mellommann overfører en DNA-profil på en overflaterce, objekt eller person til en annen overflate objekt eller person 20. En blind-swabbing tilnærming til analyse av sekundær overføring kan mislykkes i å identifisere spormengder av materiale fra den sekundære donor. Tilnærmingen utviklet her tillater analyse av en enkelt eller noen få bioparticles og derfor resultatene ikke blir tilbakevist av tilstedeværelsen av en overveldende mengde av biologisk materiale fra den primære donor. De metoder utviklet i dette arbeidet kan også ha implikasjoner for analyse av spor biologisk materiale i overgrepssaker som for eksempel de som involverer digital penetrering av vagina hvor positiv identifikasjon av spormengder av hudceller fra gjerningsmannen kan være avgjørende for å fastslå at seksuell kontakt inntraff.
Mens samlingen av bioparticles fra gel-film prøven ikke innebære vanskelige og komplekse manipulasjoner, er det kritiske trinnene i denne fremgangsmåten som må utføres med stor forsiktighet for å sikre successful overføring av bioparticles til nedstrømsreaksjonsbeholderen. Samlingen av bioparticles med det vannoppløselige klebemiddel må sees mikroskopisk (dvs. til stereomikroskopet ved høy forstørrelse (~ 200-300X) at bare de bioparticles av interesse blir oppsamlet. Avhengig av størrelsen av limet "ball" anvendes, er det er mulighet for å samle inn ytterligere omgivende materiale som kan omfatte både biologiske og ikke-biologiske materiale (f.eks, fibre, annet avfall). kan Samlingen av utilsiktede ytterligere bioparticles resultere i utvinning av blandet DNA-profiler. Samlingen av ikke-biologisk materiale kan innføre inhibitorer inn i mikro-volum lyse / STR reaksjoner. Hvis flere bioparticles er samlet med det samme klebemiddel "ball", er det et potensial for tidligere innsamlede bioparticles å bli fristilt fra limet. Det er ikke ofte observeres, men kan skje når et større antall bioparticles samles (f.eks over 50) med et enkelt lim "ball". Hvis et stort antall bioparticles er rettet, er det anbefalt at flere samlinger av færre bioparticles er gjort, men alle overført inn i den samme 0,2 ml rør. Når bioparticles er blitt samlet inn, må man være forsiktig under fjerning av gel-film lysbilde fra objektbordet og plassering av et 0,2 ml rør, slik at tuppen av nålen ikke er forstyrret. Under plassering av spissen av nålen i forsterkning blanding i bunnen av 0,2 ml rør, bør spissen av nålen ikke i kontakt med de sider av røret for å unngå tap av materiale på sidene av røret. Mens oppløsningen av klebemidlet er vanligvis hurtig (~ 30 sek eller mindre avhengig av størrelsen av limet "ball") og kan overvåkes ved mikroskopisk undersøkelse, må spissen av nålen langsomt fjernet fra forsterker blanding for å sikre at fullstendig solubiliseringav klebemidlet er blitt oppnådd. Hvis limet ikke er fullstendig oppløst, kan nålen bli returnert til væsken for å tillate fullstendig oppløsning.
Protokollen beskrevet her har blitt optimalisert for bruk med bioparticles og menneskelige celler fra rettsmedisinske biologiske bevis. Den lyseringsbuffer valgt er kompatibelt med den valgte DNA-STR amplifikasjon kit. Selv om det kan være gode alternative lyse buffere, må deres effektivitet i form av cellelyse og kompatibilitet med genetisk analyse verifiseres av brukeren. I tillegg har den STR forsterkning kit og forsterkning syklus nummer beskrevet i denne protokollen er optimalisert for bruk med én eller noen få bioparticles. En neste generasjon STR forsterkning kit med rapporterte øket robusthet og sensitivitet ble valgt ut og har vist seg å resultere i utvinning av høy kvalitet STR profiler fra én eller noen få bioparticles. Mens mange andre STR kits, med varierende anbefales Amplifisjonssykkel tall, er tilgjengelige, kan de ikke ha egnet følsomhet og derfor må være skikkelig evaluert før bruk i disse protokollene.
Til tross for vellykket bruk av de beskrevne metoder for utvinning STR profiler fra én eller noen få bioparticles, vil suksessraten av profilen utvinning ikke være 100%. Derfor, for enkelte prøver kan observeres en begrenset partiell DNA-profil eller ingen profil. Dette kan ikke unngås på grunn av den manglende evne til å entydig visuelt identifisere de fleste bioparticles som cellemateriale, potensialet nedbrutt tilstand av kjernemateriale i de innsamlede bioparticles eller tap av prøvemateriale fra klebemidlet før overføringen til reaksjonsbeholderen. Derfor er analyse av en enkelt prøve for hver bioparticle berøring DNA-element som ikke er anbefalt. Vi ofte samle 20 prøvesett fra en individuell gel-film prøven og vil samle flere prøvesett som nødvendig hvis en passende STR-profil ikke oppnås. THan eneste begrensningen for samlingene er mengden av biologisk materiale som er tilstede i gel-film prøven (og sannsynligvis kostnadene for analyse, selv om microvolume reaksjoner gir mulighet til å samle inn ytterligere prøver for en tilsvarende eller lavere kostnad som en enkelt standard reaksjonsvolum ( f.eks 25 ul).
De utviklede DNA-profilering metodene beskriver her gi en molekylær basert tilnærming til karakterisering, analyse og tolkning av spor biologisk materiale utvunnet fra berørings DNA-prøver. Det er imidlertid ytterligere genetisk informasjon som kan oppnås fra de utvunnede bioparticles i tillegg til bestemmelse av donor (dvs. STR profil) av donor av det biologiske materialet. Vev eller kroppsvæske opphav (f.eks hud versus spytt) kan gi viktig kontekstuell informasjon til en kriminell etterforskning. Uten en slik bestemmelse, kan tvetydigheten vevskilden opprinnelses bli Exploset som alternative omstendighetene rundt forbrytelsen (f.eks, hvordan kroppsvæske kan ha blitt deponert) kunne bli foreslått. De bioparticle innsamling og isoleringsmetoder som er beskrevet her kan brukes til å samle bioparticles eller andre celler (f.eks, buccal, vaginal) for bruk i en vevskilde identifikasjon (mRNA profilerings 21-30) strategi som involverer mikro volum revers transkripsjon (RT) og amplifiseringsreaksjoner. Med ytterligere optimalisering kan det også være mulig å utvikle en DNA / RNA-isolering co strategi for å muliggjøre celletypeidentifikasjonen (RNA) og STR profilering fra samme prøve, inkludert bioparticles fra touch DNA bevis.
The authors have nothing to disclose.
The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile |
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
Sterile water | 18.2 mega-ohm, autoclaved | ||
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL | various | ||
Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
Mini-centrifuge | various | ||
Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
GeneMapper software | Life Technologies | various | Various versions of the software are available and can be used |
WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
Double sided tape | various | ||
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. |
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. |
AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |