Burada mevcut olan biyo-parçacıkların toplanması için, optimize edilmiş ve etkin bir temizleme stratejisi tarif tek-aşamalı bir 5 ul mikro hacim liziz / STR amplifikasyon içeren geliştirilmiş bir amplifikasyon protokolü ile birlikte numune 'DNA dokunun', bir geri kazanıma müsaade etmek kısa tandem tekrarı (STR) biyo-parçacık verici (ler) profilleri.
DNA profilleri, insan biyolojik materyalin mikroskopik izlerini oluşur 'dokunmatik DNA' delil, elde edilebilir. Iz DNA istihdam pamuklu ya da yapışkan bant kurtarma için mevcut yöntemler ilgi alanı örnek. Ancak, bu tür bir 'kör-alma, temizleme' yaklaşımı birlikte örnek olacak hücresel materyal, farklı bireylerden, bireylerin hücreleri öğe üzerinde coğrafi farklı konumlarda bulunan bile. Bu durumda, tarama DNA örnekleri karşılaşılan bir DNA karışımların bazı yapay kendisi sürme ile oluşturulur. Bazı durumlarda, bir kurbanın DNA'sı, böylece herhangi bir potansiyel failin DNA maskeleme anlamlı fazla bulunabilir.
Standart kurtarma ve analiz yöntemleri ile zorlukları aşmak için, biz dokunmatik DNA kanıtları gelişmiş genetik analiz sonuçları düşük maliyet, 'akıllı analiz' yöntemi geliştirdik. Biz optimize edilmiş tarifDokunmatik DNA örneklerinde, bu biyo-parçacıkların toplanması ve aynı zamanda biyo-parçacık vericiden STR kurtarma izin vermek için, bir aşamalı bir 5 ul microvolume lizis / STR amplifikasyon içeren gelişmiş bir yükseltme stratejisi d etkili mikromanipulasyon kurtarma stratejisi (ler). kullanımı, bireysel ya da birkaç (yani, "kümeleri") tek kaynak profilleri elde etmek yeteneği bioparticles sonuçları. Bu prosedürler izolasyon ve adli dokunmatik DNA kanıtları gelen tek bioparticles analizi için alternatif gelişmiş teknikler temsil eder. Her adli soruşturmada gerekli olmasa da, yöntem standart analiz teknikleri kullanılarak mümkün olmayabilir fiziksel saldırı (örn, boğulma) içeren durumlarda tek bir kaynak failin DNA profilinin kurtarma için çok faydalı olabilir. Ayrıca, burada geliştirilen stratejiler o çeşitli tek hücre düzeyinde genetik bilgiyi elde etmek için bir fırsat sunuyoruzther olmayan adli iz biyolojik materyal.
Dokunmatik DNA hücresel materyalin doğrudan transferi iz biyolojik delillerin bir şeklidir fiziksel temas sırasında 1 bir nesne ya da başka bir kişiye bir kişiden (örn, cilt hücrelerini döken). dokundu nesnelerin çeşitli DNA profilleri elde yeteneği (belgeler, yatak, ayakkabı, ateşli silahlar, içme kapları, kalem, çanta kolları) literatürde 2-9 bildirilmiştir.
Dokunmatik DNA kanıtları analizinde kritik bir faktör iz biyolojik madde mevcut başarılı kurtarma. DNA kanıtları genellikle steril bir pamuklu bir bez ile şüpheli bölgeyi sürüntü ile toplanır dokunun ("kör-svapları" olarak anılacaktır). Bu yaklaşımı kullanarak, toplanan biyolojik maddenin doğası bilinmemektedir ve genelleştirilmiş bir alan örnekleme yapılır. Yüzey oluklar veya yarıklar varlığı bi genellikle zaten az miktarda başarılı kurtarma engelleyebilirological malzeme mevcut. Ayrıca, bir 'kör-alma, temizleme' yaklaşımı olacak hücreler öğe üzerinde mevcut, bireylerin hücreleri öğe üzerinde mekansal farklı konumlarda bulunan bile farklı bireylerden mutlaka ortak örnek hücresel materyal. genellikle düşük şablon DNA örnekleri ile özellikle çözmek için zorlu olan karıştırılmış DNA profilleri, kurtarma, sık sık 8,10,11 görülmektedir ve birçok durumda alma, temizleme işleminin kendisi bir netice eserdir olacaktır. Malzemenin sadece küçük bir miktar vericilerden birinden mevcut ise, standart ekstre etme ve analiz teknikleri küçük katkı bir profil kurtarmak için başarısız olabilir. Buna ek olarak, kuru ya da ıslak kullanılmış ya da ister çubukla tipi bağlı bir emme kapasitesine ve emme kapasitesinin ve biyolojik malzemenin 12 salım etkinliğindeki farklılıkları için toplanan biyolojik maddenin miktarını etkileyebilir (steril su ile önceden ıslatılmış). Standard ekstraksiyon yöntemleri, numune ya da örnek aktarımı adımları için gerekli fiziksel manipülasyonu için ek örnek kaybına neden olabilir.
Yukarıda tarif edildiği gibi, biyolojik maddenin geri kazanılması için basit bir swab teknikleri nedeniyle ayrı biyolojik bileşenleri ayırmak için bir hata için biyolojik örnek olarak karıştırılmış profillerin bir artış meydana eser miktarlarda kaybına neden olabilir. Bu nedenle, biz dokundu nesneler üzerinde bulunan hücresel mikro parçacıkların toplanması için daha seçici ve etkin kurtarma stratejileri geliştirmeye çalıştılar. Dokunmatik DNA kanıtları biyolojik materyalin analizi için geliştirilen strateji (nedeniyle cildin dış epidermal tabakasında bulunan hücrelerin büyük çoğunluğu ölü veya ölmekte olduğundan bir çekirdek her zaman görünür olmadığı gerçeği "bioparticles" olarak anılacaktır Jel film fr yoluyla biyolojik materyal (yani, bioparticles) 1) toplama: Aşağıdaki) 13 keratinositler içerirom suda çözünür bir yapıştırıcı kullanarak nesneleri ve yüzeyleri, yıpranmış giyim öğeleri veya doğrudan insan derisi, potansiyel insan biyolojik materyalin toplanmasını sağlamak kurtarıldı biyolojik maddenin 2) mikroskobik inceleme, tek veya birkaç biyo-parçacıkların 3) mikromanipulasyon dokundu, ve Bir mikrohacim (5 ul), tek aşamalı bir lizis / amplifikasyon reaksiyonu kullanılarak toplanmıştır biyo-parçacıkların 4), otozomal DNA STR profil.
Bu prosedür geleneksel olarak kullanılan analiz yöntemleri üzerinde çok sayıda avantaj sunuyor. Jel film kullanılarak bioparticles geri kazanımı analiz öncesi numune içinde biyolojik madde mevcut mikroskobik muayene izin verir. Dokunmatik DNA kanıtları elde bioparticles bir çoğunluğu çekirdekli hücreler daha zor ya da biyo-parçacıklar seçilmelidir kaç, analiz fırsatı sağlar önce bu örneklerin mikroskobik incelemesinde çekirdekli hücreler için arama belirlemek için yapım olmayabilir Bu şekilde maximizDNA profili kurtarma olasılığını ing. suda çözünür yapışkan destekli Mikromanipülasyondan kullanarak bioparticles toplama reaksiyon tüpleri içine hedeflenen bioparticles doğrudan transferine izin verir. Bu prosedür, biyolojik materyalin başarılı transferini sağlamak için mikroskop altında görüntülenmiştir. örnek başına analiz maliyetini azaltan azaltılmış ya da microvolume Reaksiyon duyarlılığını arttırır. Bu kanıt, bir bireysel parça örneklerinin artan sayıda analiz edilmesini sağlar. Nedeniyle dokunmatik DNA kanıtları biyo-parçacıkların genetik devlet aralığı, ürüne birden fazla örnekleme tavsiye edilir.
Burada, biz dokunmatik DNA kanıtları biyolojik materyalin donörlerin yüksek ispatlayıcı genetik profilleri elde etmek için geliştirilen protokoller başarılı kullanımını göstermektedir. geliştirilen bioparticle toplama ve DNA profilleme yöntemleri kapsamlı bir 'akıllı' (yani, belirli, ölçülebilir, Atta sağlamakkarakterizasyonu, analiz ve iz biyolojik maddenin yorumlanması, inable gerçekçi ve zamanında) moleküler temelli yaklaşım. Başlangıçta dokunmatik DNA kanıtları adli analiz uygulaması için geliştirilmiş olsa da, burada geliştirilen stratejiler biyolojik maddenin diğer kaynaklardan uygulanan ve tek hücre düzeyinde bireysel tanımlama bilgilerini elde etmek için bir fırsat sunuyoruz olabilir.
Burada toplama ve dokunmatik DNA kanıtları elde bioparticles gelişmiş genetik analiz için yöntemler tarif etmişlerdir. dokundu nesneler ve yüzeyler, yıpranmış giysiler öğeleri veya doğrudan insan derisinden jel film aracılığıyla biyolojik materyal (yani, bioparticles) 1) koleksiyon, geri kazanılmış biyolojik materyalin 2) mikroskobik inceleme potansiyeli toplanmasını sağlamak için: geliştirilen yaklaşım aşağıdaki içerir insan biyolojik madde ve suda çözünür bir yapışkan kullanılarak bir veya birkaç bioparticles 3) mikro manipülasyon ve mikrohacim (5 ul), tek aşamalı bir lizis / amplifikasyon reaksiyonu kullanılarak toplanmıştır bioparticles 4), otozomal DNA STR profil. tek-aşamalı bir kapalı tüp reaksiyon kullanımı ek örnek manipülasyon ya da diğer reaksiyon tüplerine transfer kontaminasyonu ve örnek kaybı için potansiyeli azaltmaktadır. geliştirilmiş tek aşamalı microvolume (5 ul) lizis / STR amplifikasyon reaksiyonları tam ya da probativ ve geri kazanımına olanake STR tek veya birkaç bioparticles bir donörün profilleri. Bu yaklaşım, tek ve çoklu-dokunmatik kaynak DNA kanıtları (örneğin, yıpranmış giysiler öğeleri ve diğer ev eşyaları, dokundu / ele nesneler ve yüzeyler, cilt / deri karışımları) den tek kaynak STR profillerini elde etmek için geliştirilmiştir. Bu başarıyla simüle fiziksel saldırı karışımı örneklerinde erkek donör tespiti için kullanılmaktadır.
Bu yaklaşım ayrıca, saldırgan sadece birkaç bioparticles kurbanın biyolojik maddenin ezici bir miktarda arasında mevcut olacağı onun / onu saldırganı çizilmemesi bir kurban gibi ek vücut sıvısı / doku karışımı senaryolarda değerlendirilebilir. Mevcut çalışmada geliştirilen bu yaklaşım tek bioparticle düzeyinde analiz izin çünkü Ayrıca, bir aracı, bir surfa bir DNA profili aktaran hangi ikincil transferi 14-19 doğası ve ölçüde daha iyi bir anlayış, kazanmak için kullanılan olabilirBaşka bir yüzey nesnesi veya kişiye 20 ce, nesne ya da kişi. İkinci transfer analizine bir kör-alma, temizleme yaklaşımı ikincil donörden malzeme eser miktarda tespit başarısız olabilir. Burada geliştirilen bir yaklaşım tek veya birkaç bioparticles analiz edilmesini sağlar ve bu nedenle sonuç, birincil verici biyolojik malzemenin bir ezici miktarının mevcudiyetinde karmakarışık değildir. Böyle failin cilt hücrelerinin eser miktarda pozitif tanımlama önemli olabilir nerede vajina dijital penetrasyon içeren gibi cinsel saldırı olgularında iz biyolojik maddenin analizi için etkileri olabilir, bu çalışmada geliştirilen yöntemler cinsel temas kurmak için oluştu.
Jel film örneğinden bioparticles toplanması zor ve karmaşık manipülasyonlar içermeyen iken, SU sağlamak için büyük bir özenle yapılması gerekir, bu prosedürün kritik adımlar vardıraşağı akış reaksiyon kabına bioparticles arasında ccessful transferi. suda çözünür yapıştırıcı ile bioparticles toplanması var, kullanılan yapıştırıcı "top" boyutuna bağlı. yani, yüksek büyütme (~ 200-300X) de stereomikroskopta ilgi sadece bioparticles toplanır emin olmak için (mikroskobik inceledi gerekir biyolojik ve biyolojik olmayan malzeme (örneğin, elyaflar, diğer enkaz) içerebilir ek çevreleyen maddenin toplanması potansiyelidir. istenmeyen ek bioparticles toplanması karıştırılmış DNA profilleri geri neden olabilir. biyolojik olmayan materyalin toplanmasını Birden bioparticles Aynı yapıştırıcı "top" ile tahsil edilmesi durumunda mikro-hacim lizis içine inhibitörleri tanıtmak olabilir / STR reaksiyonları., daha önceden toplanmış bioparticles yapışkan bekâr olmak için bir potansiyel var. Bu sık görülmez, ancak oluşabilir zaman bioparticl büyük sayıdaes toplanır (örneğin, 50) tek bir yapıştırıcı "top" ile. Bioparticles çok sayıda hedef ise, daha az sayıda bioparticles birden koleksiyonları yapılır ama aynı 0.2 ml tüp içine aktarılmıştır önerilir. Bioparticles toplanmıştır sonra, bakım mikroskop aşamasından jel film slayt ve iğnenin ucu rahatsız etmeyecek şekilde 0.2 ml tüp yerleştirilmesi çıkarılması sırasında alınmalıdır. 0.2 ml tüp altındaki amplifikasyon karışımı içine iğne ucunun yerleştirilmesi sırasında, iğnenin ucu tüp yanlarındaki madde kaybını önlemek için, boru tarafı ile temas etmemelidir. Yapıştırıcı çözündürülme tipik hızlı iken (~ 30 sn veya daha az yapışkan "top" boyutuna bağlı olarak) ve can mikroskobik muayenesi sırasında izlenen, iğne ucu yavaş yavaş bu tam emin olmak için amplifikasyon karışımı çıkarılmalıdır çözündürmeyapışkan elde edilmiştir. • Yapışkan tamamen eritilir değilse, iğne tam erimeyi sağlamak için sıvı geri döndürülebilir.
Burada anlatılan protokoller adli biyolojik delillerin gelen bioparticles ve insan hücreleri ile kullanım için optimize edilmiştir. Seçilen liziz tamponu seçilen DNA-STR amplifikasyon kiti ile uyumludur. Uygun alternatif parçalama tamponlar olsa da, alt analizi ile hücre parçalama ve uyumluluk açısından kendi verimlilik kullanıcı tarafından doğrulanması gerekir. Ayrıca, bu protokol açıklanan STR amplifikasyon kiti ve yükseltme döngüsü numarası tek veya birkaç bioparticles ile kullanım için optimize edilmiştir. Rapor artan sağlamlık ve duyarlılığı olan bir yeni nesil STR amplifikasyon kiti seçilmiş ve tek ya da birkaç bioparticles yüksek kaliteli STR geri kazanımı ile sonuçlandığı gösterilmiştir. Birlikte değişen önerilen amplifi ile çok sayıda STR kitleri,katyon döngüsü numaraları, onlar uygun hassasiyeti sahip olmayabilir ve bu nedenle doğru bu protokollerde kullanılmak önce değerlendirilmelidir gerekir mevcuttur.
Tek ya da birkaç bioparticles kurtarma STR için tarif edilen yöntemlerden başarılı olarak kullanılmasına rağmen, profil iyileşme başarı oranı% 100 değildir. Bu nedenle, bazı örnekler, sınırlı kısmi DNA profil veya profil gözlenebilir. Bunun nedeni kesin görsel hücresel materyal olarak en bioparticles tespit edilemediği için önlenemez, reaksiyon kabına aktarılmadan önce toplanan bioparticles veya yapıştırıcı örnek malzeme kaybına nükleer malzemenin potansiyel bozulmuş devlet. Bu nedenle, her bir temas DNA madde için tek bioparticle numunesinin analizi tavsiye edilmez. Biz sık sık bireysel jel film örneğinden 20 örnek setleri toplamak ve uygun bir STR profili elde değilse gerekli ek örnek setleri toplamak olacaktır. Tmicrovolume reaksiyonları (bir tek standart reaksiyon hacmi olarak benzer veya daha düşük maliyet için ek örnekleri toplamak için fırsat rağmen koleksiyonları için o sadece sınırlama, jel film örneği (ve analiz muhtemel maliyeti mevcut biyolojik materyalin miktarı örneğin, 25 ul).
geliştirilen DNA profilleme yöntemleri burada açıklamak karakterizasyonu, analiz ve dokunmatik DNA örnekleri elde iz biyolojik maddenin yorumlanmasında bir moleküler temelli yaklaşım sağlar. Bununla birlikte, biyolojik maddenin vericinin verici (örneğin, STR profili) belirlenmesi ve buna ek olarak geri bioparticles elde edilebilir ek genetik bilgi yoktur. menşe doku veya vücut sıvısı kaynağı (örneğin, tükürük karşı deri) Bir suç soruşturması önemli bağlamsal bilgiler sağlayabilir. Böyle bir belirleme olmadan, menşe doku kaynağı belirsizlik explo edilebilirsuç alternatif koşullar gibi kısıtlı erişim vardır (örneğin, vücut sıvısı tevdi edilmiş olabilir nasıl) önerilebilir. Burada tarif edilen bioparticle toplanması ve izole etme protokolleri (örneğin, yanaktan, vajinal), bir doku kaynağı tanımlama kullanım için mikro hacim transkripsiyonu (RT), ters içeren stratejisi (mRNA 21-30 profil) bioparticles veya diğer hücreleri toplamak için kullanılabilir ve amplifikasyon reaksiyonları. Daha fazla optimizasyonu ile de tarama DNA kanıtlardan bioparticles de dahil olmak üzere, aynı örnek, hücre tipi kimlik (RNA) ve STR profil izin vermek için, bir DNA / RNA eş izolasyon stratejisi geliştirilmesi mümkün olabilir.
The authors have nothing to disclose.
The authors would also like to thank all participants who donated samples for this work. This work was funded by the Office of Justice Program, National Institute of Justice, Department of Justice under award number 2010-DN-BX-K139. The funding agencies had no involvement in the study design, in collection, analysis and interpretation of data, or in the writing of the report. Points of view in this document are those of the authors and do not necessarily represent the official positions of the U.S. Department of Justice.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
SealRite 1.5 mL natural microcentrifuge tubes, sterile | USA Scientific | 1615-5510 | numerous altnerative suppliers are available, but tubes should be sterile |
0.2 mL PCR tubes with flat cap, natural | Phenix Research | MPX-200F | or equivalent |
Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 and/or 06-666-11C | |
Alcohol prep pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | alternative is 06-665-24 (Fisher Sci); canister of larger alcohol wipes rather than individual pads |
Sterile water | 18.2 mega-ohm, autoclaved | ||
Glass microscope slides, frosted, 3" x 1": 1mm | Fisher Scientific | 12-544-3 | alternative brands or sizes are acceptable |
Disposable transfer pipet | Fisher Scientific | 13-711-9D | alternatives are acceptable |
Trypan blue solution | Sigma | T8154 | |
Pipets: 0.2-2, 2-20, 10-100, 100-1,1000 mL | various | ||
Sterile, aerosol-resistant pipet tips | various | ||
Mini-centrifuge | various | ||
Stereomicroscope | Leica | M205C | others are suitable, but must be capable of magifications up to 350X |
GeneAmp PCR system 9700 thermal cycle (silver or gold block) | Life Technologies | N8050200 or 4314878 | other models and manufacturers can be used, but performance with the STR amplification kit must be verified |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies | 3130-01 | Alternatives: 310 or 3500 Genetic Aanlyzers (Life Technologies) |
GeneMapper software | Life Technologies | various | Various versions of the software are available and can be used |
WF Gel-Film , x8 retention level | Gel-Pak | WF-40-x8-A | 4" x 4" wafer film; can be ordered in other size specifications |
Double sided tape | various | ||
Glass block, 3" x 1.5" x 3/8" | McCrone Microscopes and Accessories | 370-2 | or equivalent |
Tungsten needle with holder | McCrone Microscopes and Accessories | 106 | |
3M water soluble wave solder tape, 5414 transparent | Allied Electronics | 70113977 | |
Lysis buffer (forensicGEM Saliva, Zygem) | VWR | 95043-992 | Lysis buffer is prepared in 10 ml portions (prepare additional master mix portions as needed to accommodate the desired number of samples). 1.5 ml is used for each sample. To prepare 10 ml of lysis buffer (sufficient for ~6 samples): 6.9 mL sterile water, 2.1 mL 10x buffer – blue, 1 mL forensicGEM. |
STR Amplification kit, AmpFlSTR Identifiler Plus PCR amplification kit | Life Technologies | 4427368 | Alternative STR amplification kits can be used, but performance would have to be verified by user. The amplification mix is prepared as follows (volumes per sample): 2.2 ml PCR reaction mix, 1.1 ml Primer set, 0.2 ml (1U) AmpliTaq Gold DNA polymerase. A master mix sufficient for the desired number of samples should be prepared. 3.5 ml of the prepared mix is added to the 0.2 mL tube for bio-particle collection. |
AmpliTaq Gold DNA polymerase | Life Technologies | N808-0245 | |
HiDi formamide | Life Technologies | 4311320 | |
GeneScan 500 LIZ size standard | Life Technologies | 4322682 | |
96 well optical reaction plates | Life Technologies | N8010560 | |
Plate septa, 96 well | Life Technologies | 4315933 | |
Performance-optimized polymer, POP-7 | Life Technologies | 4363785 | Alternatives such as POP-4 are acceptable |