Forberedelse og forarbejdning af tørret blod pletter (DBS) for deres endelige analyse er stadig dårligt standardiseret for de fleste diagnostiske programmer. For at overvinde denne mangel, er en omfattende trinvise protokollen foreslog og efterfølgende evalueres med hensyn til dens effektivitet til påvisning af markører for virusinfektioner.
Tanken om at indsamle blod på et papir kort og efterfølgende bruger den tørrede blod pletter (DBS) til diagnosticeringsformål stammer fra et århundrede siden. Siden da, DBS test for årtier har været overvejende fokuseret på diagnosticering af infektiøse sygdomme især i ressource-begrænset indstillinger eller den systematiske screening af nyfødte for arvelige stofskiftesygdomme og først for nylig har en række nye og innovative DBS programmer er begyndt at dukke op. I mange år, før analytiske variabler ansås kun uhensigtsmæssigt i feltet af DBS afprøvning og selv i dag, med undtagelse af nyfødte screening, den hele pre analytiske fase, der omfatter forberedelse og behandling af DBS for deres endelige analyse har ikke været standardiseret. Denne baggrund er en omfattende trinvise protokol, som dækker al de væsentlige faser, foreslået, dvs. samling af blod; forberedelse af blod pletter; tørring af blod pletter; opbevaring og transport af DBS; eluering af DBS, og endelig analyser af DBS eluater. Effektiviteten af denne protokol blev første gang evalueret med 1,762 koblede serum/DBS par til påvisning af markører for hepatitis B virus, hepatitis C-virus, og human immundefekt virusinfektioner på en automatiseret analytiske platform. I et andet trin, blev protokollen udnyttet i løbet af en pilotundersøgelse, som blev gennemført på aktive stofbrugere i de tyske byer i Berlin og i Essen.
Tanken om at bruge blod indsamlet på et papir kort lavet af cellulose er tilskrevet Ivar Christian Bang (1869-1918), far til moderne kliniske mikroanalyser1, 2. I 1913, bestemmes Bang glukose fra eluater af tørrede blod steder (DBS)3 og nyere, optrådte også kvælstof målinger ved hjælp af Kjeldahl-metoden med denne filtrerpapir teknik2. Senere, flere efterforskere rapporteret om brug af DBS serologisk test til at diagnosticere syfilis2. Så tidligt som i 1924, Chapman opsummeret fordele af DBS test når han især understregede fire elementer, som er stadig gyldige i dag: (1) i forhold til konventionelle venepunktur, mindre blodvolumen er påkrævet og dette faktum var vigtigst i pediatric diagnostik; (2) indsamling er enkel, ikke invasiv og billig; (3) risikoen for bakteriel forurening eller hæmolyse er minimal; og (4) DBS kan bevares for lange perioder med næsten ingen forringelse af analysander2, 4. Udover sin brug i test for syfilis, inkluderet yderligere tidlige programmer af DBS teknik, f.eks.påvisning af antistoffer mod mæslinger, fåresyge, poliovirus, parainfluenza virus og respiratorisk syncytial virus (RSV) i 19532, identifikation af Shigella i afføring tørres på filtrerpapir og sendes med almindelig post fra Indonesien til Leiden i Holland samt påvisning af antistoffer mod Schistosoma i DBS taget i endemiske områder og analyseret mere end tre måneder senere5 . I 1963 udgivet halvtreds år efter Bangs oprindelige meddelelse2, 6, Guthrie endelig sin berømte metode til diagnosticering af fenylketonuri fra DBS fremstillet ved en hæl prick fra nyfødte7, 8.
Selv om fra dette tidspunkt og fremefter, betragtedes DBS som et almindeligt gældende metode til indsamling, lagring, transport og analysere en bred vifte af menneskelige kropsvæsker5, deres anvendelse i diagnosticering stadig forblev overvejende fokuseret på diagnosticering af infektioner især i ressource-begrænset indstillinger og den systematiske screening af nyfødte for arvelige stofskiftesygdomme i årtier9, 10. Siden 2005 har imidlertid en række nye og innovative DBS applikationer begyndt at dukke op. Dette resulterede i en næsten eksponentiel stigning i antallet af respektive videnskabelige publikationer på DBS fra omkring 50 til næsten 450 årligt på nuværende tidspunkt. Blandt de nye programmer er forskellige områder som toksikologisk – og Farmakokinetiske undersøgelser, metabolisk profilering, terapeutiske drug overvågning, retsmedicinske toksikologi eller miljømæssige forurening kontrol10, 11.
DBS test har således gjort et triumftog march gennem klinisk laboratorie diagnostik i løbet af sidste 100 år2. Som i klinisk kemi12, dog ansås under denne marts pre analytiske variabler ikke tilstrækkeligt i mange år. Ja, selv i dag, efter fremtrædende aktiviteter såsom CDCS filtrerpapir evaluering projekt13 eller formulering af en national standard for blod samling på filtrerpapir inden for rammerne af nyfødte screening14, den pre analytiske fase er stadig i vid udstrækning undervurderet i de fleste andre felter, hvor DBS test er anvendt5, 10.
Denne baggrund en omfattende trinvise protokol14-16 til brug i immunassays og molekylære teknikker, som dækker alle de væsentlige skridt, er foreslået for forberedelse og forarbejdning DBS i følgende meddelelse: (1) samling af blod; (2) udarbejdelse af blod steder; (3) tørring af blod pletter; (4) oplagring og transport; (5) eluering af DBS; og endelig (6) analyser af DBS eluater. Effektiviteten af protokollen blev første gang evalueret med 1,762 koblede serum/DBS par til påvisning af hepatitis B virus (HBV) overflade antigen (HBsAg), antistoffer mod HBV core antigen (anti-HBc), antistoffer mod HBV overflade antigen (anti-HBs), HBV DNA, antistoffer for hepatitis C virus (HCV) (anti-HCV), HCV RNA, og human immundefekt virus (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 ved hjælp af enten en fuldt automatiseret platform eller følsomme kvalitative nukleinsyre tests. 17. i et andet trin, protokollen blev udnyttet i de Pilotundersøgelse “narkotika og kroniske infektionssygdomme” (“DRUCK studere”) som blev gennemført af Robert Koch-instituttet i tæt samarbejde med de nationale Reference Centre for Hepatitis C på aktiv stofmisbrugere i de tyske byer i Berlin og Essen18.
DBS har været anvendt i 100 år2 , men overraskende, er der stadig ingen generel enighed om deres forberedelse og behandling. Til dato, er en tilstrækkelig standardisering af denne vigtige pre analytiske fase kun sket inden for nyfødte screening14, mens en lang række forskellige protokoller findes for alle andre anvendelser af DBS test5, 16, 23. For at overvinde denne bemærkelsesværdige heterogenitet, et omfattende trin for trin instruktion for forberedelse og forarbejdning DBS til at blive udnyttet i immunassays og af molekylærbiologiske teknikker præsenteres i denne meddelelse og evalueret med hensyn til dens effektivitet til påvisning af markører for HBV, HCV og HIV infektioner. Fokus for den følgende diskussion er primært placeret på de forskellige trin i den foreslog protokol.
I historien om DBS teste mange forskellige filtrerpapir kort har været brugt2 , men i dag kun to kommercielle kilder er godkendt af FDA som medicinsk udstyr i klasse II for blod samling5, 16. Disse filter kortsystemer er meget ensartet og har meget lignende absorption egenskaber, så analytiske resultater fra kapillær blod parat på nogen af dem ikke afviger med mere end 4%-5%28. Ikke overraskende, Masciotra og co-arbejdere29 derfor fundet HIV-1 RNA lige godt med en kvalitativ analyse efter eluering fra blod samling kort fra forskellige kilder. Da disse data, kan stort set udelukkes, at nogen af afvigelser observeret ved afprøvning af kombineret serum/DBS par for markører for HBV, HCV og HIV infektioner17 var forårsaget af valget af filterkortet alene. Dog når nøjagtig kvantificering af en analysand er uundværlig, kilde til kildevariationen kan ikke længere være ubetydelig og mere avancerede teknikker, f.eks., perforeret DBS (UDHULING) som en metode til microsampling30 eller præparatet af tørrede serum steder skal (DSS)31 anvendes i stedet for konventionelle DBS test10.
Da kun små mængder af blod anvendes til DBS test (en dråbe af kapillær blod består af ca. 50 µl)5, 16, variationer i stikprøven volumen er afgørende og, ganske vist på mindst nogle af uoverensstemmelserne mellem serologiske resultater og deltagerens selvrapporterede HBV og HCV status registreres under lodsning af “DRUCK undersøgelse” kan henføres til denne variabel. Den vigtigste faktor for at minimere “udsving” sample volumen er utvivlsomt en korrekt teknik af kapillær blod collection, som kun kan opnås ved omhyggelig og løbende uddannelse af teknikere22. Desuden, som et mål for kvalitetskontrol, burde alle laboratorier, der arbejder med DBS have allerede indledt procedurer til at identificere og efterfølgende undtagen DBS prøver, der skal betragtes som utilfredsstillende eller ugyldig16.
Undersøgelser udført primært i forbindelse med HIV32 og nyfødte screening33 har vist, at høj luftfugtighed kan føre til en forringelse af analysander, men hidtil ikke har været enighed med hensyn til spørgsmålet om, hvor længe DBS bør være lufttørret . Et interval på mindst 4 hr eller helst O/N foreslås i denne meddelelse, som derfor vedtog betingelser, der blev brugt i langt størstedelen af alle relevante publikationer32, 34 Data på opbevaring af DBS anvendes efterfølgende til HBV og HCV test er modstridende. I 1981, Villa og kollegaer35, der anvendes moderne analyseteknikker, rapporterede, at opbevaring på RT ikke påvirkede resultaterne af HBV analyser i hele observationsperioden 180 dage hvis antistof titers var > 1/1.000, men at DBS blev borderline-positive eller endda negative efter 15 dage når titers i serum var kun 1/100. Opbevaring ved-20 ° C og 4 ° C ikke resultere i en væsentlig forbedring. Derimod en undersøgelse udført 30 år senere36 testet replikater af en HBV-positive prøve, og forfatterne fandt at anti-HBc samt anti-HBs antistoffer var stabilt op til 183 dage på RT, mens HBsAg på samme betingelser blev falsk negative allerede efter 63 dage. Med hensyn til påvisning af HBV DNA fra DBS eluater, koncentrationen af den virale nukleinsyre var stabil i mindst syv dage ved 37 ° C37 eller viste sig for at være “resistent” til opbevaring på RT for op til tre uger38. Undersøgelser for anti-HCV antistoffer ved hjælp af to kommercielt tilgængelige tredje generation immunassays39 fastsatte 117 dage ved hjælp af DBS prøver opbevares ved-20 ° C, 2-8 ° C og 20 – 25 ° C, henholdsvis præcise resultater. Opbevaring ved-20 ° C, men resulterede i den laveste variation af optiske tætheder. Anvendelse af en fjerde generation anti-HCV ELISA, dvs Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, i forbindelse med DBS test, Larrat et al. 40 observeret en skarp nedgang i analytiske specificitet efter lagring DBS eksemplarer i mere end tre dage på RT. På den anden side blev præcis test resultater opnået med den samme kit udnytte prøver deponeret i 60 dage under forskellige betingelser (-20 ° C, 2-8 ° C og 22 – 26 ° C) ved Brandao og co-arbejdere41. Bemærkninger om tilbagegangen af HCV RNA koncentrationer i DBS under forskellige opbevaringsforhold spænder fra ingen væsentlig ændring på RT for op til 1 år42 til en tidobbelt ændring efter fire uger ved stuetemperatur43. Tager denne temmelig modstridende data om stabilitet af HBV og HCV antigener, nukleinsyrer og antistoffer i betragtning, virkede det fornuftigt at trække i den foreslåede protokol til en konsensus, som blev defineret tidligere til opbevaring af DBS prøver anvendes til HIV-testning15, 30: For kortsigtede deposition (op til to uger) antigener, viral nukleinsyre og antistoffer betragtes som stabil på RT, optimal opbevaring i længere perioder er på frosne betingelser.
Som regel tre parametre bør overvejes, når du udformer en eluering protokol: (1) eluering buffer; (2) varighed og temperaturen af eluering; og (3) eluering bind23. I langt størstedelen af alle relevante publikationer fosfatbufferet saltopløsning (PBS) blev brugt til eluerer DBS, og de fleste forfattere tilføjet et protein, fx, bovint serumalbumin (BSA) eller Tween 20, et overfladeaktivt stof, for at forbedre analysen signal ved at stabilisere proteiner, som de går ind i løsning, og samtidig blokere ikke-specifik binding websteder23. Kun et par rapporter, der direkte sammenligner forskellige eluering buffere i forbindelse med DBS test, er tilgængelige. Villar et al. 36, fxindspillet næsten tilsvarende eluering kapacitet for alle buffere anvendes, men PBS/BSA 0,5% resulterede i det laveste niveau af uspecifik reaktivitet. En meget lignende observation blev foretaget af Croom og co-arbejdere44 når du anvender prøvefortynder af genetik systemer rLAV VVM for eluering af anti-HCV antistoffer fra DBS. Da risikoen for prøve nedbrydning er overordentlig lav i de første timer efter tilberedning af DBS (se ovenfor), blev det besluttet at udruge steder O/N ved stuetemperatur og støtte den eluering af blid slut over blanding. Denne fremgangsmåde har den fordel, at prøver hulles ud den foregående dag kan direkte overføres til rutinemæssig diagnostik tidligt næste morgen23. Mængden af eluering buffer bør tilpasses til de minimale respektive krav af assays bruges til efterfølgende analyser for at holde fortyndingsfaktoren så lavt som muligt. En omhyggelig optimering af eluering betingelserne for hver enkelt analysand var imidlertid ikke muligt i den forudgående evaluering, fordi enårlig høj prøven skulle sikres i en forholdsvis kort tid under “DRUCK undersøgelse”17. Derfor, den temmelig ugunstige volumen af 1.000 µl af PBS-baseret buffer blev brugt for at fuldføre hele eluering proces for alle parametre i to separate handlinger.
Denne tilgang, en den ene side mislykkes “helt i den anti-HBc/anti-HBs system for personer smittet med HIV på grund af de lave antistof koncentrationer; … og det krævede Molekylær biologiske procedurer med optimal analytiske følsomhed med hensyn til HBV DNA og HCV RNA tests. ” 17 på den anden side høj eluering volumen viste sig på ingen måde ufordelagtige for bestemmelse af HBsAg, anti-HCV og anti-HIV af kits bruges i hele evalueringen. “Påvisning af HBsAg positive materialer fra fuldblod eluater lykkedes med en følsomhed på 98,6% til en tilsvarende høj grad som i tidligere undersøgelser, som delvis havde brugt en meget mindre eluering volumen af 100 µl, 250 µl, eller 600 µl og 500 µl”17 ,36, 45, 46. Følsomheden af 97.8% fastsat i undersøgelsen af 179 serum/DBS par for anti-HCV antistoffer svarede til resultater af allerede eksisterende rapporter24, 44, 47, 48, 49, som havde arbejdet med en eluering volumen, der var lavere med en faktor på 5 til 10. “Derudover protokoller for anti-HCV påvisning havde været passende optimeret… af varepartierne deres egen cut-off point”17, 24, 48, 49 “eller ved at øge prøve diskenheder fra 20 µl til 100 µl.” 17, 49 endelig analytiske specificitet og følsomhed (100%) etableret for anti-HIV opdagelse var lig eller overlegen i forhold til karakteristika for andre immunassays specifikt Tilpasset DBS test50, 51 ydeevne “eller en trinvis proceduren med den kombinerede brug af flere anti-HIV-test”17,52. “De, ja, også overskredet effektivitetsdata for en analyse, der er blevet specielt udviklet og optimeret til påvisning af anti-HIV antistoffer i DBS eluater (Q-forhindre HIV 1 + 2 DBS kit).” 17, 53
Tilsammen, den omfattende trinvise protokollen præsenteres i denne meddelelse viste sig for at være et realistisk og brugervenligt værktøj til forberedelse og behandling af DBS og kan således anvendes pålideligt i diagnostisk virologi. Det tillader tilgange ved hjælp af automatisering 54 og på grund af dets fremragende egenskaber har potentiale til at tjene som en slags grundstenen til en kommende generelt accepteret konsensus protokol i feltet global DBS test i laboratorium medicin.
The authors have nothing to disclose.
Denne meddelelse bygger på resultaterne tidligere offentliggjort i virologi Journal17 i åben adgang mode under vilkårene i Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) med BioMed Central som en licenstageren. Forfatterne taknemmeligt anerkender det frugtbare samarbejde inden for rammerne af lodstjeneste undersøgelsen “Narkotika og kroniske infektionssygdomme” (“DRUCK studere”) med U. Marcus, W. Cai, W. Zhang og R. Zimmermann fra Robert Koch-Institut (Berlin, Tyskland) og er taknemmelige for S. Moyrer for at tage fotografier samles i figur 1 samt om D. F. Whybrew, ph.d., (Göttingen, Tyskland) til at korrigere den håndskriftet. De også udtrykke deres påskønnelse af dygtige tekniske bistand til J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter og K. Seidel. Denne undersøgelse var delvist understøttet af et tilskud af det tyske sundhedsministerium til det nationale referencecenter for Hepatitis C.
Latex rubber gloves | Hartmann | #4049500041515 | |
70% isopropyl alcohol | Bode Chemie | #9768050 | |
Mulifly safety cannula | Sarstedt | #85.1638 | |
EDTA blood collection tube | Sarstedt | #02.1066.001 | |
Adhesive bandage | Hartmann | #2994163 | |
Dry gauze pad | Hartmann | #143213 | |
Singel-use safety lancet | Owen Mumford | #3802421 | |
Test Card | Whatman/sigmaaldrich | #10534612 | Filter paper card Grade 903 |
Disposable pipette tips | Starlab | #S1126-7810, #S1120-8810 | |
Zipper bag | Flexico | #20219 | |
Mini desiccant bag | Tropack | #- | |
Disposable Punch | pfmmedical | #48601 | 6.0 mm Disposable Biopsy Punch |
Disposable Forceps | Servoprax | #H7301 | |
12 Well Cell Culture Plate | Greiner | #665180 | |
PBS Buffer | Gibco | #14190-136 | |
Tween 20 | Applichem | #A1389.0500 | |
Sodium Azide | Merck | #66880250 | |
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | #30120086 | |
ARCHITECT HBsAg (Qunatitative) | Abbott | #6C3642 | |
ARCHITECT anti-HBc II | Abbott | #8L4425 | |
ARCHITECT anti-HBs | Abbott | #7C1825 | |
ARCHITECT anti-HCV | Abbott | #6C3725 | |
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo | Abbott | #4J2727 | |
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit | Roche | #6374891001 | |
artus HBV LC PCR Kit | Qiagen | #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests) | |
VERSANT HCV TMA Assay IVD | Siemens Healthcare | #2554311 |