Подготовка и обработка засохшей крови пятна (DBS) для их окончательного анализа по-прежнему плохо стандартизированы для большинства диагностических приложений. Чтобы преодолеть этот недостаток, всеобъемлющий поэтапный протокол предложил и впоследствии оценивается с точки зрения ее эффективности для обнаружения маркеров вирусных инфекций.
Идея сбора крови на карте бумаги и впоследствии с помощью засохшей крови пятна (DBS) для диагностических целей, возникли столетие назад. С тех пор DBS тестирования для десятилетий остается преимущественно ориентированным на диагностике инфекционных заболеваний, особенно в условиях ограниченных ресурсов или систематического скрининг новорожденных для унаследованных метаболических расстройств и только недавно имеют целый ряд начали появляться новые и инновационные DBS приложений. На протяжении многих лет, предварительно аналитических переменных только ненадлежащим образом рассматривались в области тестирования DBS и даже сегодня, за исключением новорожденных скрининг, весь предварительно аналитический этап, который включает в себя подготовку и обработку DBS для их окончательный анализ не были стандартизированы. Учитывая вышесказанное, всеобъемлющий шаг за шагом протокол, который охватывает Аль основных этапов, предлагается, то есть, сбор крови; подготовка пятна крови; Сушка пятна крови; Хранение и транспортировка DBS; Элюирующий DBS и, наконец, анализ элюаты DBS. Эффективность этого протокола впервые проводилась с 1762 спаренных сыворотка/DBS пар для обнаружения маркеров вирус гепатита B, вируса гепатита С и вирусом иммунодефицита человека инфекций на автоматизированной аналитической платформы. В качестве второго шага протокол был использован во время экспериментального исследования, которое проводилось на активных потребителей наркотиков в городах Германии Берлин и Эссен.
Идея использования крови, собранные на карте бумажные из целлюлозы приписывается Ивар христианских Bang (1869-1918), отец современной клинической микроанализ1, 2. В 1913 году Bang определяется глюкозы из элюаты засохшей крови пятна (DBS)3 и, позднее, также исполнил азота измерений методом Кьельдаля с эта Бумага фильтровальная техника2. Впоследствии несколько следователи сообщили об использовании БД для серологических тестирования для диагностики сифилиса2. Как рано как в 1924, Чепмен обобщены преимущества DBS тестирования когда он особенно подчеркнул четырех пунктов, которые по-прежнему актуальны сегодня: (1) по сравнению с обычными венепункции, требуется меньше объем крови, и этот факт был самым важным в педиатрии Диагностика; (2) крови коллекции простых, не инвазивных и недорогой; (3 риск бактериального загрязнения или гемолиз является минимальным; и (4) DBS могут быть сохранены для длительных периодов с почти не ухудшение аналитов2, 4. Помимо его использования в тестирование на сифилис далее раннего применения метода DBS включали, например, обнаружение антител против кори, эпидемического паротита, полиовирусом, вирус парагриппа и респираторно-синцитиальный вирус (RSV) в 1953 году2, Идентификация шигеллы в фекалиях сушат на фильтровальную бумагу и отправлены по почте из Индонезии в Лейден в Нидерландах, а также выявления антител к Schistosoma в DBS в эндемичных районах и проанализированы более чем на три месяца позже5 . В 1963 году пятьдесят лет спустя после взрыва в оригинальной коммуникации2, 6, Гатри наконец опубликовал его известный метод диагностики фенилкетонурия из БД, получены на пятке укол от новорожденных7, 8.
Хотя с того времени DBS были расценены как часто применяется метод для сбора, хранения, транспортировки и анализа различных жидкостей человеческого организма5, их использование в диагностике по-прежнему преимущественно сосредоточены на диагноз инфекции, особенно в условиях ограниченных ресурсов и систематического скрининга новорожденных для унаследованных метаболических расстройств на протяжении десятилетий9, 10. С 2005 года однако, целый ряд новых и новаторских DBS приложений начали возникать. Это привело к почти экспоненциальное увеличение числа соответствующих научных публикаций по DBS от 50 до почти 450 ежегодно в настоящее время. Среди новых приложений в таких разнообразных областях, как токсико – и фармакокинетические исследования, метаболические профили, терапевтического мониторинга лекарственных препаратов, судебная токсикология или контроля загрязнения окружающей среды10, 11.
Испытания БД таким образом, сделала триумфальное шествие через клинической лабораторной диагностики в течение последних 100 лет2. Как в клинической химии12однако, в марте этого года предварительно аналитических переменных не рассматривались должным образом на протяжении многих лет. Действительно даже сегодня, после таких выдающихся мероприятий, как CDC в фильтровальную бумагу оценки проекта13 или разработке национального стандарта для сбора крови на фильтровальной бумаге в рамках новорожденных, скрининг14, предварительно аналитический этап по-прежнему во многом недооценивается в большинстве других областей, в которых DBS тестирование является прикладной5, 10.
Учитывая вышесказанное, для подготовки и обработки DBS в следующем сообщении предлагается всеобъемлющий поэтапный протокол14-16 для использования в иммуноанализа и молекулярных методов, которая охватывает все основные шаги,: (1) Сбор крови; (2) подготовка пятна крови; (3) высыхания пятна крови; (4) для хранения и транспортировки; (5) элюции DBS; и наконец (6) анализ элюаты DBS. Сначала оценивать эффективность протокола с 1762 спаренных сыворотка/DBS пар для выявления гепатита B вирус (HBV) поверхностный антиген (HBsAg), антитела к ГВ основных антигена (анти HBc), антитела гепатита в поверхностный антиген (анти HBs), HBV ДНК, антитела вирус гепатита С (HCV) (анти HCV) РНК ВГС и вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) 1-p24-антиген/анти-ВИЧ 1/2 с использованием чувствительных качественные нуклеиновых кислот или полностью автоматизированная платформа тестов. 17. в качестве второго шага, протокол был использован в экспериментальное исследование «наркотики и хронические инфекционные заболевания» («DRUCK исследование») который был проведен по института Роберта Коха-в тесном сотрудничестве с национальным центром ссылки для гепатита С на активных инъекционных наркотиков в городах Германии Берлин и Эссен18.
DBS были использованы для 100 лет2 но, удивительно, есть еще нет общего консенсуса об их подготовке и обработке. На сегодняшний день, достаточно стандартизации этого важного предварительного аналитического этапа только был достигнут в области обследования новорожденных14, тогда как для всех других приложений DBS тестирование5, 16, 23существует целый ряд различных протоколов. Для преодоления этой замечательной неоднородности, всеобъемлющий шаг за шагом инструкции для подготовки и обработки DBS использоваться в иммуноанализа и молекулярных методов представлена в этой связи и оценивается с точки зрения ее эффективности для обнаружения маркеров инфекции ВГВ, ВГС и ВИЧ. После обсуждения прежде всего акцент на различные этапы предлагаемый протокол.
В истории DBS тестирования многих различных фильтровальная бумага карты были используется2 , но сегодня только два коммерческих источников утвержденных FDA как класс II медицинские приборы для сбора крови5, 16. Эти системы карточка фильтра очень равномерное и имеют очень похожие характеристики поглощения, так что аналитические результаты, полученные от капиллярной крови, приготовленные на любой из них не отличается более чем на 4%-5%28. Не удивительно, Masciotra и коллегами29 поэтому обнаружено РНК ВИЧ-1 одинаково хорошо с качественного анализа после элюции от крови коллекции карт из разных источников. Учитывая эти данные, он может быть практически исключены что любых несоответствий, наблюдается при тестировании сочетании сыворотка/DBS пар для маркеров ВГВ, ВГС и ВИЧ инфекции17 было вызвано выбор фильтра карты только. Однако когда необходима точная количественная оценка аналита, источник исходный вариант больше не может быть незначительным и более изощренные методы, например, перфорированные DBS (PDBS) как метод для microsampling30 или подготовки сушеная сыворотка пятен (DSS)31 , возможно, придется применять вместо обычных DBS тестирования10.
Поскольку только небольшое количество крови используются для тестирования баз данных (одна капля капиллярной крови состоит из примерно 50 мкл)5, 16, колебания в объеме образца имеют решающее значение и, по общему признанию, по крайней мере некоторые из расхождений между серологических результатов и участника самостоятельно HBV и HCV статус, записанный во время пилотирование «Исследование DRUCK» объясняются этой переменной. Самым важным фактором для минимизации объема образца «колебания», несомненно, правильная техника сбора капиллярной крови, что может быть достигнуто только путем тщательного и непрерывной подготовки технического персонала22. Кроме того, в качестве меры контроля качества все лаборатории, работа с БД должен уже инициировали процедуры для выявления и впоследствии исключая DBS образцы, которые должны рассматриваться как неудовлетворительное или недопустимый16.
Исследования, проведенные главным образом в контексте ВИЧ32 и33 обследования новорожденных показали, что высокая влажность может привести к деградации аналитов, но до сих пор не достигнут консенсус в вопросе о как долго DBS должен быть воздушно-сухой . Интервал по крайней мере 4 hr или предпочтительно O/N предлагается в этой связи, которая таким образом принял условия, которые были использованы в подавляющем большинстве всех соответствующих публикаций32, 34 данные о хранении DBS впоследствии использоваться для HBV и HCV тестирование являются противоречивыми. В 1981 году, Вилла и коллег35, который применил современных аналитических методов, сообщили, что хранения на RT не затрагивает результаты анализов ГВ в течение весь период наблюдений 180 дней, если титры антител были > 1/1000, но что DBS После 15 дней, когда титры в сыворотке были лишь 1/100 стал граница положительных или даже отрицательным. Для хранения от-20 ° C или 4 ° C не привели в существенном улучшении. Напротив исследование, проведенное тридцать лет позже36 испытания реплицирует HBV-положительных образца, и авторы нашли что анти HBc, а антител анти HBs были стабильными до 183 дней на RT, тогда как HBsAg при тех же условиях стала ложно отрицательные уже после 63 дней. Что касается обнаружения HBV ДНК от DBS элюаты, концентрацию вирусной нуклеиновой кислоты был стабильным, по крайней мере за семь дней на37 37 ° C или оказался «резистентность» к хранения на RT на срок до трех недель38. Тестирование на наличие антител анти HCV, используя два коммерчески доступных третьего поколения, предоставленные иммуноанализа39 точные результаты в течение 117 дней, с использованием образцов DBS температуре-20 ° C, 2-8 ° C и 20-25 ° C, соответственно. Хранения при температуре-20 ° C, однако, привели к низкой вариации оптических плотностей. Применяя четвертого поколения анти HCV ELISA, т.е. Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, в контексте DBS, тестирование, Larrat и др. 40 наблюдается резкое снижение аналитической специфика после хранения образцов баз данных для более чем трех дней на RT. С другой стороны были получены точные результаты тестирования с тот же комплект, используя образцы, сданный Брандау и коллег4160 дней в различных условиях (-20 ° C, 2-8 ° C и 22-26 ° C). Замечания на снижение концентрации РНК ВГС в БД при различных условиях хранения варьируются от без существенного изменения в РТ на срок до одного года42 десятикратное изменение после четырех недель при температуре43. Принимая этот довольно противоречивые данные о стабильности HBV и HCV антигены, нуклеиновых кислот и антител в расчет, представляется разумным втягивается в предлагаемом протоколе к консенсусу, который был определен ранее для хранения образцов DBS использоваться для ВИЧ тестирование15, 30: для краткосрочных осаждения (до двух недель) антигены, нуклеиновой кислоты вируса и антител рассматриваются как стабильной на RT, тогда как на замороженных условий оптимального хранения для более длительных периодов.
Как правило, три параметра должны учитываться при проектировании элюции протокол: (1) Элюирующий буфер; (2 продолжительность и температура элюции; и (3) объем элюции23. В подавляющем большинстве всех соответствующих публикаций фосфат амортизированное saline (PBS) был использован для элюирующие DBS, и большинство авторов добавил белка, например, бычьим сывороточным альбумином (БСА) или Tween-20, ПАВ, с целью улучшения анализа сигнала путем стабилизации белки, как они идут в раствор и одновременно блокировки неспецифической привязки сайтов23. Лишь в нескольких докладах, которые непосредственно сравнить различные элюции буферов в контексте DBS тестирования, доступны. Виллар и др. 36, например, записанная почти эквивалент элюции потенциала для всех буферов, но PBS/BSA 0,5% привело к в наименьший уровень неспецифической реактивности. Очень аналогичное замечание было высказано Крум и коллег44 при применении образца растворитель объектиивные генетики систем ОВОС для Элюирование антител анти HCV из БД. Поскольку риск деградации образца является чрезвычайно низким, в первые часы после подготовки БД (см. выше), было решено для инкубации пятна O/N при комнатной температуре и поддержать процесс элюции смешивая нежный-над конца. Этот подход имеет то преимущество, что образцы перфорированные из предыдущих день могут быть непосредственно переданы рутинной диагностики рано следующим утром23. Объем буфера должны быть адаптированы к минимальным требованиям соответствующих анализов, используется для последующего анализа с целью снизить коэффициент разрежения. Однако тщательной оптимизации элюции условий для каждого единого аналита не удалось в предыдущей оценке, потому что высокая производительность гарантируется в сравнительно короткое время во время «DRUCK исследование»17. Следовательно довольно неблагоприятных объем 1000 мкл буфера на основе PBS была использована для завершения процесса весь элюции для всех параметров в двух отдельных операций.
Этот подход одной стороны не «полностью в системе анти HBc/anti-HBs для тех лиц, инфицированных ВИЧ, из-за низкой антитела концентрации; … и она требует молекулярные биологические процедуры с оптимальным Аналитическая чувствительность в отношении HBV ДНК и РНК ВГС испытаний.» 17 с другой стороны, высокая элюции объем оказался никоим образом неблагоприятное для определения HBsAg, анти HCV и анти-ВИЧ, наборы, используемые при оценке. «Определение HBsAg положительных материалы из цельной крови элюаты удалось с чувствительностью 98,6% аналогично высокой степени как и в предыдущих исследований, которые частично использованы гораздо меньший объем элюции 100 мкл, 250 мкл, или 600 мкл или 500 мкл»17 ,36, 45, 46. Чувствительность 97,8%, определяется в ходе расследования 179 сыворотка/DBS пар для антител анти HCV соответствует результаты уже существующих сообщает24, 44, 47, 48, 49, который работал с Томом элюции, который был ниже ПДК от 5 до 10. «Кроме того, протоколы для обнаружения анти ВГС надлежащим образом оптимизирована…, устанавливая их собственных точек отсчета»,17, 24, 48, 49 «или путем увеличения объемов образца от 20 мкл до 100 мкл.» 17, 49 наконец, аналитическая специфичность и чувствительность (100%), установленные для обнаружения анти-ВИЧ были равными или превосходит характеристики производительности других immunoassays, специально адаптированных к DBS тестирования50, 51 «или поэтапный процедура с комбинированным использованием несколько анти-ВИЧ тестов»17,52. «Они, действительно, также превысил рекорд производительности assay который были специально разработаны и оптимизированы для обнаружения антител анти-ВИЧ в DBS элюаты (Q-предотвращение ВИЧ 1 + 2 Комплект DBS).» 17, 53
Вместе взятые, всеобъемлющий шаг за шагом протокол, представленный в этой связи оказался осуществимым и удобный инструмент для подготовки и обработки DBS и таким образом, можно надежно в диагностической вирусологии. Это позволяет подходы с использованием автоматизации 54 и из-за его отличные ходовые характеристики имеет потенциал, чтобы служить своего рода учредительств камень для будущего консенсуса общепринятых протокола в глобальной области DBS тестирования в лаборатории медицины.
The authors have nothing to disclose.
Это сообщение основано на ранее опубликованные в17 вирусологии журнал в режиме открытого доступа на условиях лицензии Creative Commons Attribution (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) с BioMed Central как результаты Лицензиата. Авторы с благодарностью признаем плодотворное сотрудничество в рамках эксперимента в исследовании «Наркотики и хронические инфекционные заболевания» («DRUCK исследование») с U. Маркус, W. Цай, W. Чжан и р. Циммерманн от института Роберта Коха-(Берлин, Германия) и благодарны S. Moyrer для принимая фотографии собраны в Рисунок 1 а также D. F. Whybrew, К.т.н., (Гёттинген, Германия) для исправления рукопись. Они также выражают свою признательность за умелое технической помощи J. Акерман, э. Bayrambasi, U. Бюттнера, S. Dziubek, I. Jakobsche, б. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Меткалф, J. Piejek, S. Саар, м. Шретер и K. Seidel. Это исследование было частично поддерживается Грант немецкого министерства здравоохранения Национальный справочный центр для гепатита с.
Latex rubber gloves | Hartmann | #4049500041515 | |
70% isopropyl alcohol | Bode Chemie | #9768050 | |
Mulifly safety cannula | Sarstedt | #85.1638 | |
EDTA blood collection tube | Sarstedt | #02.1066.001 | |
Adhesive bandage | Hartmann | #2994163 | |
Dry gauze pad | Hartmann | #143213 | |
Singel-use safety lancet | Owen Mumford | #3802421 | |
Test Card | Whatman/sigmaaldrich | #10534612 | Filter paper card Grade 903 |
Disposable pipette tips | Starlab | #S1126-7810, #S1120-8810 | |
Zipper bag | Flexico | #20219 | |
Mini desiccant bag | Tropack | #- | |
Disposable Punch | pfmmedical | #48601 | 6.0 mm Disposable Biopsy Punch |
Disposable Forceps | Servoprax | #H7301 | |
12 Well Cell Culture Plate | Greiner | #665180 | |
PBS Buffer | Gibco | #14190-136 | |
Tween 20 | Applichem | #A1389.0500 | |
Sodium Azide | Merck | #66880250 | |
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | #30120086 | |
ARCHITECT HBsAg (Qunatitative) | Abbott | #6C3642 | |
ARCHITECT anti-HBc II | Abbott | #8L4425 | |
ARCHITECT anti-HBs | Abbott | #7C1825 | |
ARCHITECT anti-HCV | Abbott | #6C3725 | |
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo | Abbott | #4J2727 | |
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit | Roche | #6374891001 | |
artus HBV LC PCR Kit | Qiagen | #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests) | |
VERSANT HCV TMA Assay IVD | Siemens Healthcare | #2554311 |