Att förbereda och bearbetning av torkat blod fläckar (DBS) för deras slutliga analys är fortfarande dåligt standardiserade för de flesta diagnostiska program. För att övervinna denna brist, är ett omfattande stegvisa protokoll föreslog och därefter utvärderas med avseende på dess effektivitet för att upptäcka markörer för virusinfektioner.
Idén att samla in blod på ett papperskort och därefter använda den torkat blod fläckar (DBS) för diagnostiska ändamål påbörjade ett sekel sedan. Sedan dess har DBS testning för årtionden har förblivit huvudsakligen inriktad på diagnos av infektionssjukdomar särskilt i begränsade resurser inställningar eller systematisk screening av nyfödda för ärftliga metabola sjukdomar och bara nyligen har en mängd nya och innovativa DBS program börjat växa fram. Under många år ansågs bara olämpligt före analytiska variabler i fältet av DBS testning och även idag, med undantag för nyfödda screening, den hela pre analytisk fas, som består av beredning och bearbetning av DBS för deras slutliga analysen har inte standardiserats. Mot den bakgrunden föreslås ett omfattande stegvisa protokoll, som omfattar al de grundläggande faserna, dvs insamling av blod; beredning av blod fläckar; torkning av blod fläckar; lagring och transport av DBS; eluering av DBS, och slutligen analyser av DBS eluat. Effektiviteten av detta protokoll utvärderades först med 1 762 kopplat serum/DBS par för att upptäcka markörer för hepatit B, hepatit C virus, och humant immunbrist virusinfektioner på en automatiserad analytisk plattform. I ett andra steg var protokollet utnyttjas under en pilot studie, som genomfördes på aktiva narkotikamissbrukare i de tyska städerna Berlin och Essen.
Idén att använda blod som samlas in på ett papperskort tillverkade av cellulosa tillskrivs Ivar Christian Bang (1869 – 1918), far till moderna kliniska mikroanalys1, 2. 1913, Bang beslutsamma glukos från eluat av torkat blod fläckar (DBS)3 och senare uppträdde även kväve mätningar med Kjeldahl-metoden med denna filterpapper teknik2. Därefter flera utredare rapporterade om användning av DBS för serologiska tester för att diagnostisera syfilis2. Så tidigt som i 1924, Chapman sammanfattas fördelarna med DBS testning när han särskilt betonade fyra poster, som gäller fortfarande idag: (1) jämfört med konventionella venpunktion, mindre blodvolym krävs och detta faktum var viktigast i pediatrisk diagnostik; (2) blod insamling är enkel, icke invasiv, och billig; (3) risken för bakteriell kontamination eller hemolys är minimal. och (4) DBS kan bevaras under långa perioder med nästan ingen försämring av analyter2, 4. Förutom dess användning i test för syfilis, ingår ytterligare tidiga tillämpningar av DBS tekniken, t.ex., påvisande av antikroppar mot mässling, påssjuka, poliovirus, parainfluensa virus och respiratory syncytial virus (RSV) i 19532, identifiering av Shigella i avföring intorkat på filterpapper och levereras med vanlig post från Indonesien till Leiden i Nederländerna samt detektion av antikroppar mot Schistosoma i DBS i endemiska områden och analyseras mer än tre månader senare5 . I 1963 publicerat femtio år efter Bangs ursprungliga meddelande2, 6, Guthrie slutligen sin berömda metod för diagnos av fenylketonuri från DBS erhålls genom en häl prick från nyfödda7, 8.
Även om från den tiden och framåt, DBS betraktades som en allmänt tillämplig metod för att samla in, lagra, transportera och analysera en mängd människors kroppsvätskor5, deras användning i diagnostik var fortfarande huvudsakligen inriktad på diagnos av infektioner särskilt i begränsade resurser inställningar och systematisk screening av nyfödda för ärftliga metabola sjukdomar för årtionden9, 10. Sedan 2005 har dock en mängd nya och innovativa DBS tillämpningar har börjat växa fram. Detta resulterade i en nästan exponentiell ökning i antalet respektive vetenskapliga publikationer på DBS från ca 50 till nästan 450 årligen i dagsläget. Bland de framväxande program är olika områden såsom toxikologisk – och farmakokinetiska studier, metabolisk profilering, terapeutisk övervakning, rättskemi eller miljöförorening kontroll10, 11.
DBS testning har således gjort ett segertåg genom kliniska Laboratoriumdiagnostik under senaste 100 år2. Liksom i klinisk kemi12, dock ansågs under mars före analytiska variabler inte tillräckligt i många år. Ja, även idag, efter sådan framstående verksamhet som CDC: s filterpapper utvärdering projektet13 eller utformningen av en nationell standard för blodinsamling på filterpapper inom ramen av nyfödda screening14, fasen före analytisk är fortfarande i stort sett undervärderade i de flesta av de andra fälten, där DBS testning är tillämpad5, 10.
Mot den bakgrunden föreslås en omfattande stegvisa protokoll14-16 för användning i immunoanalyser och i molekylära tekniker, som omfattar alla väsentliga steg, för att förbereda och bearbetning DBS i följande meddelande: (1) insamling av blod; (2) förberedelse av blod fläckar; (3) torkning av blod fläckar; (4) lagring och transport. (5) eluering av DBS; och slutligen (6) analyser av DBS eluat. Effektiviteten av protokollet utvärderades först med 1 762 kopplat serum/DBS par för påvisande av hepatit B virus (HBV) ytantigen (HBsAg), antikroppar mot HBV core-antigen (anti-HBc), antikroppar mot HBV ytantigen (anti-HBs), HBV-DNA, antikroppar hepatit C-virus (HCV) (anti-HCV), HCV-RNA och humant immunbristvirus (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 med antingen en helt automatiserad plattform eller känsliga kvalitativa nukleinsyra provningar. 17. i ett andra steg, protokollet utnyttjades i den pilotstudie ”droger och kroniska infektionssjukdomar” (”DRUCK Study”) som genomfördes av Robert Koch-Institutet i nära samarbete med de nationella referenscentrum för hepatit C på aktiv narkotikamissbrukare i de tyska städerna Berlin och Essen18.
DBS har använts i 100 år2 men förvånande nog finns det fortfarande ingen allmän konsensus om deras beredning och bearbetning. Hittills har en tillräcklig standardisering av denna viktiga före analytisk fas endast uppnåtts i fältet för nyfödda screening14, medan en mängd olika protokoll finns för alla andra program för DBS testning5, 16, 23. För att övervinna detta anmärkningsvärt heterogena, en omfattande steg för steg instruktion för att förbereda och bearbetning DBS för att utnyttjas i immunoanalyser och av molekylära tekniker presenteras i detta meddelande och utvärderas med avseende på dess effektivitet för att upptäcka markörer för HBV, HCV och HIV infektioner. Fokus i den följande diskussionen placeras främst på de olika stegen i föreslagna protokollet.
I historien av DBS testa många olika filterpapper kort har varit begagnade2 men idag bara två kommersiella källor är godkända av FDA som medicintekniska produkter i klass II för blood collection5, 16. Dessa filter kort system är mycket jämn och har mycket liknande absorptionsegenskaper så att analytiska resultat från capillary blod beredd på något av dem inte avviker med mer än 4 – 5%28. Inte överraskande, Masciotra och medarbetare29 därför upptäcktes HIV-1 RNA lika bra med en kvalitativ analys efter eluering från blod insamling kort från olika källor. Tanke på dessa uppgifter, kan det nästan utesluta att någon av de skillnader som observerats vid provning tillsammans serum/DBS par för markörer för HBV, HCV och HIV infektioner17 orsakades av valet av filterkortet ensam. Men när exakt kvantifiering av en analyt är oumbärlig, källa-till-source variant kanske inte längre är försumbar och mer sofistikerade tekniker, t.ex., perforerade DBS (PDB-filer) som en metod för microsampling30 eller beredning av torkade serum ställen kanske (DSS)31 som skall tillämpas i stället för konventionella DBS testar10.
Eftersom endast små mängder blod används för DBS testning (en droppe av kapillära blod består av cirka 50 µl)5, 16, variationer i provvolymen är avgörande och, visserligen på åtminstone några av skillnaderna mellan serologiska resultat och deltagarens självrapporterade HBV och HCV status som noterats under lotsning av ”DRUCK studien” är hänförliga till denna variabel. Den enskilt viktigaste faktorn för att minimera ”fluktuationer” av provvolymen är utan tvekan en rätt teknik av kapillära blodinsamling, som endast kan uppnås genom noggrann och pågående utbildning av teknisk personal22. Dessutom som ett mått på kvalitetskontroll, bör alla laboratorier som arbetar med DBS har redan inlett förfaranden för att identifiera och därefter exklusive DBS exemplar som måste anses som ogiltig eller otillfredsställande16.
Studierna bedrivs främst i samband med HIV32 och nyfödda screening33 har visat att hög luftfuktighet kan leda till en försämring av analyter, men hittills ingen enighet har nåtts när det gäller frågan om hur länge DBS bör vara lufttorkad . Ett intervall på minst 4 tim eller helst O/N föreslås i detta meddelande, som antog därför villkor som användes i den stora majoriteten av alla relevanta publikationer32, 34 Data lagring av DBS som därefter används för HBV och HCV tester är motstridiga. I 1981, Villa och medarbetare35, som tillämpas moderna analystekniker, rapporterade att lagring på RT inte påverkade resultaten av HBV analyser under hela observationsperioden på 180 dagar om antikroppsnivåerna var var > 1/1 000, men att DBS blev borderline-positiv eller rentav negativ efter 15 dagar när titrar i serum var endast 1/100. Lagring vid-20 ° C eller 4 ° C resulterade inte i en väsentlig förbättring. Däremot en studie utförd trettio år senare36 testas replikerar provvikt HBV-positiva, och författarna fann att anti-HBc samt anti-HBs antikroppar var stabil upp till 183 dagar på RT, medan HBsAg på samma villkor blev falskt negativa redan efter 63 dagar. När det gäller identifiering av HBV-DNA från DBS eluat, koncentrationen av den viral nukleinsyra var stabil under minst sju dagar vid 37 ° C37 eller visat sig vara ”resistent” till lagring på RT i upp till tre veckor38. Test för anti-HCV-antikroppar med två kommersiellt tillgängliga tredje generationens immunanalyser39 föreskrivs under 117 dagar använder DBS prover lagras vid-20 ° C, 2 – 8 ° C och 20 – 25 ° C, respektive korrekta resultat. Lagring vid-20 ° C, resulterade dock i lägsta variationen av optiska densiteter. Tillämpa en fjärde generationens anti-HCV-ELISA, dvs Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, i samband med DBS testning, Larrat o.a. 40 observerat en kraftig minskning av analytisk specificitet efter förvaring DBS exemplaren i mer än tre dagar på RT. Däremot, erhölls exakt test resultat med samma kit utnyttja prover deponeras i 60 dagar under olika förhållanden (-20 ° C, 2 – 8 ° C och 22 – 26 ° C) av Brandao och medarbetare41. Observationer på nedgång av HCV-RNA koncentrationer i DBS under olika lagringsförhållanden alltifrån ingen betydande förändring på RT för upp till ett år42 till en tiofaldig förändring efter fyra veckor vid omgivningstemperatur43. Med denna ganska motstridiga uppgifter på stabiliteten av HBV och HCV antigener, nukleinsyror och antikroppar hänsyn, verkade det rimligt att dra tillbaka i föreslagna protokollet till ett samförstånd, som definierades tidigare för lagring av DBS exemplar som ska användas för HIV-testning15, 30: för kortsiktiga nedfall (upp till två veckor) antigener, viral nukleinsyra och antikroppar betraktas som stabil på RT, optimal lagring under längre perioder är frysta villkor.
Som regel tre parametrar bör övervägas när du utformar ett eluering protokoll: (1) eluering bufferten; (2) varaktighet och temperatur på eluering; och (3) den eluering volym23. I majoriteten av alla relevanta publikationer fosfatbuffrad saltlösning (PBS) användes för eluering DBS, och de flesta författarna lagt ett protein, t.ex., bovint serum albumin (BSA) eller Tween 20, ett ytaktivt ämne, för att förbättra analysen signalen genom att stabilisera proteiner, eftersom de går i lösning och samtidigt blockera icke-specifik bindning webbplatser23. Finns endast några rapporter, som direkt jämför olika eluering buffertar i samband med DBS testning. Villar o.a. 36, t.ex., registreras nästan motsvarande eluering kapacitet för alla buffertar används, men PBS/BSA 0,5% resulterade i den lägsta nivån av icke-specifika reaktivitet. En mycket liknande observation gjordes av Croom och medarbetare44 vid applicering i provspädningsmedel av den genetik system rLAV MKB för elueringen av anti-HCV-antikroppar från DBS. Eftersom risken för provet nedbrytning är ytterst låg under de första timmarna efter beredning av DBS (se ovan), beslutades det att ruva fläckarna O/N vid rumstemperatur och att stödja eluering av mild över slut blandning. Denna metod har fördelen att exemplaren stansas ut föregående dag kan direkt överföras till rutinmässiga diagnostiken tidigt nästa morgon23. Volymen av eluering bufferten bör anpassas till de minimala respektive kraven av de analyser som används för efterföljande analyser för att hålla utspädningsfaktorn så låg som möjligt. En noggrann optimering av eluering villkor för varje enskild analyt var dock inte möjligt i den föregående utvärderingen eftersom en hög provkapacitet hade ska garanteras i en relativt kort tid under den ”DRUCK studie”17. Följaktligen användes ganska ofördelaktiga volymen av 1000 µl av PBS-baserad buffert för att slutföra hela eluering processen för alla parametrar i två separata verksamheter.
Detta synsätt en å ena sidan misslyckas ”helt i anti-HBc/anti-HBs systemet för de individer infekterade med HIV på grund av de låga antikropp koncentrationerna; … och det krävs molekylär biologiska förfaranden med optimal Analytisk känslighet när det gäller HBV DNA och HCV RNA tester ”. 17 däremot, hög elutionsvolymen visade sig vara på något sätt ofördelaktig för bestämning av HBsAg, anti-HCV- och anti-hiv av Kit används i hela utvärderingen. ”Upptäckten av HBsAg positiva material från helblod eluat lyckades med en känslighet på 98,6% i lika hög grad som i tidigare studier, som delvis hade använt en mycket mindre elutionsvolymen 100 µl, 250 µl, eller 600 µl eller 500 µl”17 ,36, 45, 46. Känsligheten hos 97,8% fastställts i utredningen av 179 serum/DBS par för anti-HCV-antikroppar motsvarade resultaten av redan befintliga rapporter24, 44, 47, 48, 49, som hade arbetat med en elutionsvolymen som var lägre med en faktor på 5 till 10. ”Dessutom protokollen för anti-HCV-upptäckt hade varit korrekt optimerad… genom att föreskriva egna brytpunkterna”17, 24, 48, 49 ”eller genom att öka de prov volymerna från 20 µl till 100 µl”. 17, 49 slutligen den analytisk specificitet och känslighet (100% vardera) fastställts för anti-hiv upptäckt var lika eller bättre än prestandaegenskaper för andra immunanalyser specifikt anpassat till DBS testning50, 51 ”eller en stegvis förfarandet med kombinerad användning av flera anti-HIV tester ”17,52. ”De, faktiskt, även överskridit prestanda rekordet av en analysmetod som hade varit speciellt utvecklad och optimerad för detektion av anti-HIV-antikroppar i DBS eluat (Q-förhindra HIV 1 + 2 DBS kit)”. 17, 53
Sammantaget den omfattande stegvisa protokoll som presenteras i detta meddelande visade sig vara ett genomförbart och användarvänligt verktyg för att förbereda och bearbetning DBS och kan således användas på ett tillförlitligt sätt i diagnostiska virologi. Det tillåter metoder använder automation 54 och på grund av dess utmärkta prestanda har potential att fungera som en slags fundament-stena för ett framtida allmänt accepterad konsensus protokoll i fältet global DBS tester i laboratorium medicin.
The authors have nothing to disclose.
Detta meddelande bygger på de resultat som tidigare publicerats i Virology Journal17 i öppen åtkomstläge enligt villkoren i Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) med BioMed Central som en licenstagaren. Författarna tacksamt erkänna det fruktbart samarbetet inom ramen för lotsning studien ”droger och kroniska infektionssjukdomar” (”DRUCK Study”) med U. Marcus, W. Cai, W. Zhang och R. Zimmermann från Robert Koch-Institutet (Berlin, Tyskland) och är tacksam till S. Moyrer för att ta fotografier monterade i figur 1 samt om D. F. Whybrew, Ph.D, (Göttingen, Tyskland) för att korrigera den manuskriptet. De uttrycker också sin uppskattning för skickliga tekniskt bistånd till J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. di, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter och K. Seidel. Denna studie stöddes delvis av ett bidrag på det tyska hälsoministeriet att den nationella referenscentrum för hepatit C.
Latex rubber gloves | Hartmann | #4049500041515 | |
70% isopropyl alcohol | Bode Chemie | #9768050 | |
Mulifly safety cannula | Sarstedt | #85.1638 | |
EDTA blood collection tube | Sarstedt | #02.1066.001 | |
Adhesive bandage | Hartmann | #2994163 | |
Dry gauze pad | Hartmann | #143213 | |
Singel-use safety lancet | Owen Mumford | #3802421 | |
Test Card | Whatman/sigmaaldrich | #10534612 | Filter paper card Grade 903 |
Disposable pipette tips | Starlab | #S1126-7810, #S1120-8810 | |
Zipper bag | Flexico | #20219 | |
Mini desiccant bag | Tropack | #- | |
Disposable Punch | pfmmedical | #48601 | 6.0 mm Disposable Biopsy Punch |
Disposable Forceps | Servoprax | #H7301 | |
12 Well Cell Culture Plate | Greiner | #665180 | |
PBS Buffer | Gibco | #14190-136 | |
Tween 20 | Applichem | #A1389.0500 | |
Sodium Azide | Merck | #66880250 | |
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | #30120086 | |
ARCHITECT HBsAg (Qunatitative) | Abbott | #6C3642 | |
ARCHITECT anti-HBc II | Abbott | #8L4425 | |
ARCHITECT anti-HBs | Abbott | #7C1825 | |
ARCHITECT anti-HCV | Abbott | #6C3725 | |
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo | Abbott | #4J2727 | |
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit | Roche | #6374891001 | |
artus HBV LC PCR Kit | Qiagen | #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests) | |
VERSANT HCV TMA Assay IVD | Siemens Healthcare | #2554311 |