Forberede og behandling av tørket blod flekker (DBS) for deres endelige analysen er fortsatt dårlig standardisert for de fleste diagnostiske programmer. For å overvinne dette brist, er en omfattende trinnvis protokoll foreslo og deretter evalueres med hensyn til effektiviteten for å oppdage markører for virusinfeksjoner.
Ideen om å samle blod på et papir og deretter bruke de tørkede blod flekkene (DBS) for diagnoseformål stammer århundre siden. Siden da DBS testing for tiår har vært hovedsakelig fokusert på diagnostisering av smittsomme sykdommer spesielt i ressurs-begrenset innstillinger eller systematisk screening av nyfødte for arvet metabolske forstyrrelser, og bare nylig har en rekke nye og innovative DBS programmer begynt å dukke. I mange år, pre analytisk variabler var bare upassende vurdert i feltet DBS testing og selv i dag, med unntak av nyfødte screening, hele pre analytisk fasen, som består av utarbeidelse og behandling av DBS for deres endelige analysen blitt ikke standardisert. Gitt denne bakgrunnen, foreslås en omfattende trinnvis protokoll, som dekker al avgjørende faser, dvs. samling av blod. utarbeidelse av blod flekker; tørking av blod flekker; lagring og transport av DBS; elueringsrør DBS, og til slutt analyser av DBS eluates. Effektiviteten av denne protokollen ble først evaluert med 1,762 kombinert serum/DBS parene for å avdekke markører for hepatitt B-viruset hepatitt C-virus og humant immunsviktvirus infeksjoner på en automatisert analytisk plattform. Under det andre trinnet, ble protokollen benyttet under en pilotstudie, som ble gjennomført på aktive narkotikabrukere i de tyske byene i Berlin og Essen.
Ideen om å bruke blod samlet på et papir kort laget av cellulose er tilskrevet Ivar Christian Bang (1869-1918), far til moderne klinisk microanalysis1, 2. I 1913, bestemt Bang glukose fra eluates av tørket blod flekker (DBS)3 og senere også nitrogen målinger med metoden Kjeldahl med denne filter papir teknikk2. Deretter flere etterforskere rapporterte om bruk av DBS for serologisk testing for å diagnostisere syfilis2. Så tidlig som i 1924 Chapman oppsummert fordelene DBS testing når han spesielt understreket fire elementer, som er gyldig i dag: (1) sammenlignet med konvensjonelle venipuncture, mindre blodvolum kreves, og dette faktum var viktigst i pediatric diagnostikk; (2) blod samling er enkelt, ikke invasiv og billig; (3) risiko for bakteriell forurensning eller hemolyse er minimal. og (4) DBS kan bevares i lange perioder med nesten ingen forverring av analytter2, 4. Foruten dets bruk i testing for syfilis, ytterligere tidlig programmene av DBS teknikken inkludert, f.ekspåvisning av antistoffer mot meslinger, kusma, poliovirus, parainfluensa virus og respiratorisk syncytial virus (RSV) i 19532 Identifikasjon av Shigella i avføring tørket på filter papir og sendt med vanlig post fra Indonesia til Leiden i Nederland samt gjenkjenning av antistoffer mot Schistosoma i DBS i endemiske områder og analysert mer enn tre måneder senere5 . I 1963 publisert femti år etter Bang opprinnelige kommunikasjon2, 6, Guthrie endelig sin berømte metode for diagnostisering av Fenylketonuri fra DBS ved hælen drittsekk fra nyfødte7, 8.
Men fra den tiden fremover, DBS ble betraktet som vanligvis gjelder for innsamling, lagring og transport og analysere en rekke menneskelige kroppsvæsker5, deres bruk i diagnostikk forble hovedsakelig fokusert på diagnostisering av infeksjoner spesielt i ressurs-begrenset innstillinger og systematisk screening av nyfødte for arvet metabolske forstyrrelser for tiår9, 10. Siden 2005 har imidlertid en rekke nye og innovative DBS programmer har begynt å dukke. Dette resulterte i en nesten eksponentielle økning i antall respektive vitenskapelige publikasjoner på DBS fra ca 50 til nesten 450 årlig i dag. Blant de nye programmene er slike varierte felt som toxico og farmakokinetiske studier, metabolske profilering, terapeutisk medikament overvåking, rettsmedisinske toksikologi eller miljøforurensning kontroll10, 11.
DBS testing har dermed gjort en triumphal marsj gjennom clinical laboratory diagnostikk under siste 100 år2. Som klinisk kjemi12, men var under denne mars pre analytisk variabler ikke tilstrekkelig vurdert i mange år. Faktisk, selv i dag, etter eminente aktiviteter som CDC’S filter papir evaluering prosjektet13 eller utformingen av en nasjonal standard for blod samling på filter papir i rammen av nyfødt screening14, pre analytisk fasen er fortsatt i stor grad undervurdert i de fleste av de andre feltene, der DBS testing er brukt5 og 10.
Gitt denne bakgrunnen, en omfattende trinnvis protokoll14-16 for bruk i immunanalyser og molekylære teknikker, som dekker alle de grunnleggende trinnene, foreslås for utarbeidelse og behandling DBS i følgende åpenbaring: (1) samling av blod. (2) utarbeidelse av blod flekker; (3) tørking av blod flekker; (4) lagring og transport; (5) elueringsrør av DBS; og til slutt (6) analyser av DBS eluates. Effektiviteten av protokollen ble først vurdert med 1,762 kombinert serum/DBS parene for å avdekke hepatitt B-viruset (HBV) overflate antigen (HBsAg), antistoffer mot HBV kjerneantigen (anti-HBc), antistoffer mot HBV overflate antigen (anti-HBs), HBV DNA, antistoffer for hepatitt C-viruset (HCV) (anti-HCV) HCV RNA og humant immunsviktvirus (HIV) 1-p24-antigen/anti-HIV 1/2 en helautomatisk plattform eller sensitive kvalitativ nukleinsyre tester. 17. i andre trinnet, protokollen ble benyttet i pilotstudie “narkotika og kronisk smittsomme sykdommer” (“DRUCK studere”) som er utført av det Robert Koch-instituttet i nært samarbeid med de nasjonale referanse for hepatitt C på aktiv narkotikabrukere i de tyske byene i Berlin og Essen18.
DBS er brukt for 100 år2 , men overraskende, det er fortsatt ingen generell enighet om sine forberedelser og behandling. Hittil har en tilstrekkelig standardisering av denne viktige pre analytisk fasen bare blitt oppnådd innen nyfødt screening14, mens en rekke forskjellige protokoller finnes for alle andre programmer av DBS testing5, 16, 23. For å overvinne dette bemerkelsesverdige heterogenitet, er en omfattende trinnvis instruksjon for utarbeidelse og behandling DBS som skal benyttes i immunanalyser og molekylære teknikker presentert i denne kommunikasjonen og evalueres med hensyn til dens effektivitet for å oppdage markører for HBV og HCV HIV-infeksjoner. Fokus for følgende diskusjonen er primært plassert på de ulike trinnene i det foreslåtte protokollen.
I historien om DBS teste mange forskjellige filter papir kortene har vært brukt2 men i dag bare to kommersielle kilder er godkjent av FDA som klasse II medisinsk utstyr for blod samling5, 16. Disse filtersystemer kort er svært jevn og har svært like vannabsorpsjon egenskaper slik at analytisk resultatene fra kapillær blod forberedt på en av dem ikke avviker med mer enn 4%-5%28. Ikke overraskende, Masciotra og kolleger29 derfor oppdaget HIV-1 RNA like godt med en kvalitativ analyse etter elueringsrør fra blod samling kort fra ulike kilder. Gitt disse dataene, kan det nesten utelukkes at noen av avvik observert når testing kombinert serum/DBS par for markører for hepatitt b, hepatitt c og HIV infeksjoner17 ble forårsaket av filterkortet alene. Men når nøyaktig kvantifisering av en analytt er uunnværlig kilde til kildevariasjonen ikke lenger være ubetydelig og mer avanserte teknikker, f.eksperforert DBS (pdb-er) for å microsampling30 eller forberedelse tørket serum flekker må (DSS)31 brukes i stedet for konvensjonelle DBS testing10.
Siden bare små mengder av blod brukes for DBS testing (en dråpe kapillær blod består av ca. 50 µl)5, 16, variasjoner i prøven volumet er avgjørende, og riktignok på minst noen av avvik mellom serologisk resultater og deltakerens egenrapporterte HBV og HCV-status under føring av “DRUCK studien” er knyttet til denne variabelen. Den viktigste faktoren for å minimere “kursbevgelsene” av prøven er utvilsomt en riktig kapillær blod samling, som bare kan oppnås av forsiktig og kontinuerlig opplæring av de tekniske personell22. Som et mål på kvalitetskontroll, bør alle laboratorier arbeider med DBS ha allerede innviet prosedyrer for identifisering og deretter ekskludere DBS prøver som må vurderes utilfredsstillende eller ugyldig16.
Studier gjennomført i sammenheng med HIV32 og nyfødt screening33 har vist at høy luftfuktighet kan føre til en degradering av analytter, men hittil ingen konsensus er nådd om spørsmålet om hvor lenge DBS skal lufttørket . Et intervall på minst 4 t eller helst O/N foreslås i denne kommunikasjon, som derfor vedtatt forholdene som ble brukt i det store flertallet av alle relevante publikasjoner32, 34 på lagring av DBS skal brukes senere for HBV og HCV testing er i konflikt. I 1981, Villa og kolleger35, som brukt moderne analytiske teknikker, rapporterte at lagring på RT ikke påvirke resultatene av HBV analyser i hele observasjon løpet av 180 dager hvis antistoff titers > 1/1000, men at DBS ble borderline-positive eller negative selv etter 15 dager da titers i serum var bare 1/100. Lagring på 20 ° C eller 4 ° C resulterte ikke i en betydelig forbedring. Derimot en studie utført tretti år senere36 testet gjentak av HBV-positive en prøve, og forfatterne funnet at anti-HBc så vel som anti-HBs antistoffer var stabile i opptil 183 dager på RT, mens HBsAg oppstiller ble USANN-negativ allerede etter 63 dager. Med hensyn til HBV DNA oppdagelsen fra DBS eluates, konsentrasjonen av viral nukleinsyre var stabil i minst syv dager på 37 ° C37 eller viste “motstandsdyktig” til lagring på RT tre uker38. Testing for anti-HCV-antistoffer bruker to kommersielt tilgjengelig tredje generasjon immunanalyser39 gitt nøyaktige resultater for 117 dager DBS utvalg lagret på 20 ° C, 2-8 ° C og 20-25 ° C, henholdsvis. Lagring på 20 ° C, men resulterte i laveste varianten av optisk tetthet. Bruke en fjerde generasjon anti-HCV ELISA, dvs Monolisa HCV-Ag-Ab-ULTRA, i sammenheng med DBS testing, Larrat et al. 40 observert en skarp nedgang i analytisk spesifisitet når de DBS prøvene i mer enn tre dager på RT. På den annen side, ble presise testing resultater oppnådd med samme kit utnytte prøver avsatt i 60 dager under ulike forhold (20 ° C, 2-8 ° C og 22-26 ° C) av Brandao og kolleger41. Observasjoner på tilbakegang for HCV RNA i DBS under ulike lagringsforhold varierer fra ingen betydelig endring på RT for opptil ett år42 til en tidoblet etter fire uker omgivelsestemperatur43. Ta denne ganske motstridende data på stabiliteten av HBV og HCV antigener, atomer syren og antistoffer hensyn, virket det fornuftig å trekke i foreslåtte protokollen til en konsensus, som ble definert tidligere for lagring av DBS brukes til HIV-testing15, 30: til kortsiktige deponering (opptil to uker) antigener og viral nukleinsyre antistoffer regnes som stabil på RT, mens optimal lagring for lengre perioder på frosne forhold.
Som regel tre parametere bør vurderes når du utformer en elueringsrør protokoll: (1) elueringsbufferen; (2) varighet og temperaturen i elueringsrørets; og (3) elueringsrør volum23. I det store flertallet av alle relevante publikasjoner fosfat-bufret saltvann (PBS) ble brukt for eluting DBS, og de fleste forfattere lagt et protein, f.eks, storfe serum albumin (BSA) eller mellom 20, avspenningmiddel, for å forbedre analysen signalet ved å stabilisere proteiner, som de går, og samtidig blokkerer uspesifisert bindende områder23. Bare noen rapporter, som direkte sammenligner forskjellige elueringsrør buffere i sammenheng med DBS testing, er tilgjengelige. Villar et al. 36, f.eksregistrert nesten tilsvarende elueringsrør kapasiteter for alle buffere brukt, men PBS/BSA 0,5% førte til det laveste nivået på uspesifisert reaktivitet. En svært lik observasjon ble gjort av Croom og kolleger44 når du bruker prøvefortynner av genetikk systemer rLAV EIA for tilsettes av anti-HCV-antistoffer fra DBS. Siden risikoen for eksempel fornedrelse er svært lav i de første timene etter utarbeidelse av DBS (se ovenfor), ble det besluttet å ruge flekker O/N ved omgivelsestemperatur og støtte elueringsrør prosessen ved å forsiktig over-gjennomgående blande. Dette har fordelen at prøver slo den forrige dag kan direkte overføres til rutinemessig diagnostikk tidlig neste morgen23. Volumet av elueringsbufferen bør være tilpasset de respektive minimumskrav av analyser brukes for senere analyser for å holde fortynningsfaktoren for så lavt som mulig. Men var en forsiktig optimalisering av elueringsrør betingelsene for hver enkelt analytt ikke mulig i foregående evalueringen fordi en høy eksempel gjennomstrømning måtte garanteres på forholdsvis kort tid under “DRUCK Study”17. Derfor ble heller ugunstige volumet av 1000 µl PBS-baserte bufferen brukt for å fullføre hele elueringsrør for alle parametere i to separate operasjoner.
Denne tilnærmingen en ene mislykkes “helt i anti-HBc/anti-HBs systemet for personer smittet med HIV på grunn av de lave antistoff konsentrasjonene; … og det kreves molekylær biologiske prosedyrer med optimal analytisk følsomhet med hensyn til HBV DNA og HCV RNA tester. ” 17 derimot, høy elueringsrør volumet viste skal på ingen måte ugunstig for fastsettelse av HBsAg, anti-HCV og anti-HIV av settene brukes i evalueringen. “Gjenkjenning av HBsAg positiv materiale fra fullblod eluates lyktes med en følsomhet på 98.6% til en tilsvarende høy grad i tidligere studier som hadde delvis brukt et mye mindre elueringsrør volum 100 µl, 250 µl, eller 600 µl eller 500 µl”17 ,36, 45, 46. Følsomheten til 97.8% bestemmes i etterforskningen av 179 serum/DBS for anti-HCV-antistoffer tilsvarte resultatene av allerede eksisterende rapporter24, 44, 47, 48, 49, som hadde jobbet med et elueringsrør volum som var lavere med en faktor på 5 til 10. “I tillegg protokollene for anti-HCV oppdaging hadde vært riktig optimalisert… av fastsette egne cut-off poeng”17, 24, 48, 49 “eller ved å øke utvalget volumene fra 20 µl til 100 µl.” 17: 49 endelig den analytiske spesifisitet og følsomhet (100% hver) etablert for anti-HIV gjenkjenning var lik eller bedre enn ytelsesegenskapene til andre immunanalyser spesielt tilpasset DBS testing50, 51 “eller en gradvis prosedyre med kombinert bruk av flere anti-HIV tester”17,52. “De faktisk også overskredet resultater posten av analysen som ble spesielt utviklet og optimalisert for påvisning av anti-HIV antistoffer i DBS eluates (Q-hindre HIV-1 + 2 DBS kit).” 17, 53
Samlet omfattende trinnvis protokollen presentert i dette viste seg for å være en mulig og brukervennlig verktøy for utarbeidelse og behandling DBS og kan dermed brukes pålitelig i diagnostiske virologi. Den lar tilnærminger bruke automatisering 54 og på grunn av gode resultatene egenskaper har potensial til å tjene som en slags grunnsteinen for en fremtidig allment aksepterte konsensus protokollen innen globale DBS testing i laboratorier medisin.
The authors have nothing to disclose.
Denne meldingen er basert på resultatene tidligere publisert i virologi Journal17 i åpne-tilgangsmodus under betingelsene i Creative Commons Attribution License (http://creativecommons.org/licenses/by/2.0) med BioMed Central som en Lisenstaker. Forfatterne takknemlig anerkjenner fruktbart samarbeid i rammen av pilotering studien “Narkotika og kronisk smittsomme sykdommer” (“DRUCK studere”) med U. Marcus, W. Cai, W. Zhang og R. Zimmermann fra Robert Koch-instituttet (Berlin, Tyskland) og er takknemlig til S. Moyrer for tar bildene samlet i figur 1 samt om D. F. Whybrew, Ph.D, (Göttingen, Tyskland) for å korrigere det manuskriptet. De også uttrykke sin takknemlighet for dyktige kundestøtte J. Ackermann, E. Bayrambasi, U. Büttner, S. Dziubek, I. Jakobsche, B. Krellenberg, H. Krohn, P. Kusimski, A. Metcalf, J. Piejek, S. Saar, M. Schröter og K. Seidel. Denne studien var støttes delvis av et tilskudd på tysk Helsedepartementet nasjonale referanse sentrum for hepatitt C.
Latex rubber gloves | Hartmann | #4049500041515 | |
70% isopropyl alcohol | Bode Chemie | #9768050 | |
Mulifly safety cannula | Sarstedt | #85.1638 | |
EDTA blood collection tube | Sarstedt | #02.1066.001 | |
Adhesive bandage | Hartmann | #2994163 | |
Dry gauze pad | Hartmann | #143213 | |
Singel-use safety lancet | Owen Mumford | #3802421 | |
Test Card | Whatman/sigmaaldrich | #10534612 | Filter paper card Grade 903 |
Disposable pipette tips | Starlab | #S1126-7810, #S1120-8810 | |
Zipper bag | Flexico | #20219 | |
Mini desiccant bag | Tropack | #- | |
Disposable Punch | pfmmedical | #48601 | 6.0 mm Disposable Biopsy Punch |
Disposable Forceps | Servoprax | #H7301 | |
12 Well Cell Culture Plate | Greiner | #665180 | |
PBS Buffer | Gibco | #14190-136 | |
Tween 20 | Applichem | #A1389.0500 | |
Sodium Azide | Merck | #66880250 | |
Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | #30120086 | |
ARCHITECT HBsAg (Qunatitative) | Abbott | #6C3642 | |
ARCHITECT anti-HBc II | Abbott | #8L4425 | |
ARCHITECT anti-HBs | Abbott | #7C1825 | |
ARCHITECT anti-HCV | Abbott | #6C3725 | |
ARCHITECT HIV Ag/Ab Combo | Abbott | #4J2727 | |
MagNA Pure 96 DNA and Viral NA Large Volume Kit | Roche | #6374891001 | |
artus HBV LC PCR Kit | Qiagen | #4506063 (24 tests), #4506065 (96 tests) | |
VERSANT HCV TMA Assay IVD | Siemens Healthcare | #2554311 |