Introduction
Tip I ve III 'interferonlar (IFN) tüm omurgalıların 1 virüs ve diğer patojenik uyarıcılara, mevcut immün yanıt olarak büyük önem taşımaktadır. Bağışıklık ve olmayan bağışıklık hücreleri cevap için, IFN 2 yanı sıra, ifade ve salgılarlar. Gibi paralı-benzeri reseptörler (TLR), SOKMASI ve Rig-I gibi doğuştan gelen bağışıklık sensörler, patojen ilişkili moleküler desenleri (PAMP) 3,4 tespiti üzerine tip I ve III IFN ifadesini neden. İnsanlarda, bir IFN tipi 2,5 kompleks IFNAR 1 / IFNAR2 reseptörü, IFN-β, -ω, -κ ve IFN-α 12 alt tipleri ve bağlama yer alır. Tip III, IFN, IFN-λ1, -λ2 ve -λ3 dahildir ve IL10RB / IL28RA reseptör kompleksi 2 bağlanır. Klasik, tip I ve III IFN ardından STAT1 / STAT2 heterodimerlerini işe ve interferon uyarılmış genlerin (ISG) 6 transkripsiyonunu başlatmak kendi reseptör kompleksleri bağlama. İSG, antiviral ve anti-dan, fonksiyonları çok çeşitli katılanAdaptif immün yanıtı 7 aktivasyonuna çoğalma etkinliği.
patojenler kaçmasına altüst ve IFN sinyal yolunun elemanları kaçırma geliştiğini çok sayıda mekanizma, doğuştan gelen bağışıklık tepkisi 8 IFN'nin önemini göstermektedir. Örneğin, aşı virüsü, bir Yaba-benzeri hastalığı virüsü I ve III IFN proteini 10 yazın önleyen bir glikoprotein salgılar ederken 9 IFN yazın tecrit IFNAR1 homoloji ile bir tuzak reseptörü ifade eder. Ev sahibi savunma rollerine ilave olarak, IFN aynı zamanda, kanser gözetim ve oto-enflamatuar hastalıkların bir dizi implike edilmiştir: göğüs kanseri hücrelerinin IFN ifade susturma immün 11 sınırlayan IFN-α aşırı üretimi sistemik gelişiminde bir mekanizmadır lupus eritematozus 12, ve SOKMASI ve hatalı aktivasyon STING ilişkili vaskülopatisi IFN aşırı miktarda neden sistemik inflamasyona yol açar13. Terapötik olarak IFN multipl skleroz 14 tedavi etmek için kullanılır, örneğin tüylü hücre lösemisi 18 ve kronik miyelojenik lösemi 19 gibi HBV 15 ve HCV 16,17 ve kanser gibi kronik viral enfeksiyonlar. Belirli bir fizyolojik süreç içinde IFN alaka ile ilgili sorular sürekli bu sitokin ailesinin her yerde doğasını ortaya koyuyor.
Özellikle IFN-α alt tipleri, genellikle bir varlık olarak 20-23 yerine bir yakından ilişkili grup, ancak farklı, proteinler olarak kabul edilir Ben IFN, yazın. Omurgalı evrim 24 boyunca varlığı ve IFN-α alt tipleri de dahil olmak üzere birden fazla IFN türlerine sürmesi, bu alt türlerin en azından bir alt kümesi, belirli veya benzersiz bir işleve sahip olduğunu göstermektedir. Bu, IFN ifade tanımlayan desen çözer ve alt tiplerinin 17 arasında bir veya daha fazla özel fonksiyonları karakterize etmeye yardımcı olması mümkündür. t okuyan meydanonların, paylaşılan bu sekans kimliğine dayalı olan I ve III, IFN alt tiplerini yazın: on iki IFN-α alt tipleri> 50% 25 paylaşan ve IFN-λ alt tipleri, amino asit dizileri arasında 81-96% 26 paylaşır. Tarif Mah-PCR deneyinde, moleküler işaret (MB) ve kilitli nükleik asit (LNA) floresan sondalar çok benzer IFN alt tipi dizileri arasında tek baz çifti farklılıkları ayırt ve IFN ifade imza karakterizasyonu için izin verir. Testi Yeni 384 kuyucuklu plak format sırasıyla transkript kopya sayısına ve ΔCq ile analiz için izin kantitatif (transkript standartları) ve yarı-kantitatif (temizlik genler (HKG)) önlemleri içerir. Astar / sonda (Pr / Pb) kurutulması ile mümkün otomatik çok kanallı pipetle ve uzun süreli depolama, kolaylaştırdı Toplu montaj, testin tekrarlanabilirliği, programı, ve pratiklik geliştirmek, plakalar üzerinde ayarlar.
Bu protokol işlemi tarif384 gözlü QRT-PCR testi plakaları insan IFN alt tiplerini (Tablo 1) hedefleme için on yedi farklı Pr / Pb setleri ile (Şekil 1) üretimi için. Pr / Pb hazır kaynak plakaları (Şekil 2), bir robot çok kanallı pipet kullanılarak, otomatik bir işlemde, birden çok 384 oyuklu deney plakaları hazırlamak için kullanılan olarak ayarlayın. Ilk odak insan IFN ifade imzaları çalışmak için bir protokol oluşturmaya ilişkin iken, bu yöntem, aynı zamanda, rhesus macaques uygulanmıştır. Levha düzenleri biraz farklıdır ve Pr / Pb setleri (Tablo 2) belirgin olmasına rağmen, insan ve resus plakalar oluşturmak için genel hazırlama yöntemi aynıdır. Protokolün en az modifikasyon ile, yöntem yakından ilişkili genlerin diğer grupları çalışma testlerin geliştirilmesi için izin vermek için yürütülebilir.
Bkz Şekil 1 ve 2 Aşağıda
Tablo 1 ve 2 Bel görow
Protocol
Standart seri seyreltme hazırlanması 1. (Şekil 3A)
NOT: Pr / Pb grubu tarafından hedef sekansları ihtiva eden doğrusallaştırılmış plazmidin seri seyreltme serisi QRT-PCR deneyi için sayısal standartlar olarak kullanılmıştır. IFN alt tipleri için her standart seri seyreltme seti 90 deney plakaları çalıştırmak için yeterli hacim içerir. Deney için kullanılan standart seyreltme eğrisi dört noktanın 20-32 (Tablo 3), bir dizi Ct değerleri kapsayacak şekilde seçilir.
- Çözülme, girdap ve kısa bir süre için standart (50 pM) ve somon sperm DNA (ssDNA, 10 mg / ml) stok çözelti santrifüj.
- Su 20.3 ml ssDNA'nın 51 ul karıştırarak 17 standart seyreltme setleri için ssDNA / su karışımı hazırlayın.
- Standart seyreltme kümesi için bir 8-tüp PCR şerit etiketleyin.
NOT: stok çözümleri standart seri dilüsyonları hazırlanması 2-3 saat sürer. - F ssDNA / su karışımı 190 ul dağıtınirst şerit boru ve beş kalan tüplere ssDNA / su karışımı 180 ul.
- , Mix ssDNA'nın / su 190 ul tüp 50 pM standart stoktan 10 ul aktararak bir 1:20 seyreltme gerçekleştirin; hızla girdap ve PCR şeridi santrifüj.
- Serinin bir sonraki tüp en son seyreltilmiş tüp 20 ul aktararak 1:10 seyreltme gerçekleştirin; hızla girdap ve PCR şeridi santrifüj.
- Seyreltme serisinin son tüp kadar adımı yineleyin 1.6 standardını aldı.
- Tekrarlayın, her standart için 1,3-1,7 adımları.
Aşağıda Tablo 3 görün
Primer / prob (Pr / Pb) ile Şablonsuz Kontrol 2. Hazırlık (NTC) işleme stok karışımlar (Şekil 3B)
NOT: Her 1.7 ml Pr / Pb stok ve 30 tahlil plakaları yapacak stok karışımı çalışma 128.6 ul yok Şablon Kontrolü (NTC) çalışan set.
- Pr / Pb çalışma stok karışımları set hazırlayın.
DEĞİLE: Pr / Pb seti hazırlanması ve NTC çalışma stok 2-3 saat sürer stok çözümleri karıştırır.- Stok çözeltilerin hazırlanması için, ultra-saf su ile 100 uM primer ve problar yeniden süspanse edin.
- Onyedi 2 ml tüpler kadar Etiket; Deneyde yer alan her Pr / Pb kümesi için bir.
- Çözülme, girdap ve kısa bir süre için primerler (100 uM), sondalar (100 uM) ve ssDNA (10 mg / ml) stok çözelti santrifüj.
- 12.5 ul elektronik çok kanallı pipet kullanarak her bir tüpe ssDNA'nın 2 ul ekleyin. Uygun ileri primer ekle ters primer ve her Pr / Pb stok tüp çalışma ayarlayın soruşturma. Rhesus makak Pr / Pb setleri için insan IFN alt tiplerini ve Tablo 2 hedefleme Pr / Pb setleri için Tablo 1'e bakınız. Her Pr hacmi getirmek için su ekleyin / Pb 200 ul stok tüp çalışan set.
Not: ekleme primerleri, prob hacmi ve su Pr / Pb gerekli nihai reaksiyon konsantrasyonuna bağlıdırset.
- NTC çalışma stok karışımları hazırlayın.
- NTC çalışma hisse senetleri için Etiket iki adet 5-tüp PCR şeritler karıştırır.
- Her Pr / Pb 14.3 ul uygun NTC çalışma stok karışımı tüp set aktarın. NTC kuyuları için Pr / Pb seti kombinasyonları için Tablo 4'e bakın. NTC çalışma Stokta her su ekleyin 128.6 ul son hacim getirmek karıştırır.
- Girdap, kısa bir süre için santrifüj ve ardından buz üzerine ya da uzun süreli depolama için -20 ° C'de karanlıkta tüpleri.
Aşağıda Tablo 4 'e bakınız
- Pr / Pb çalışma stokları set sulandırmak.
- Her Pr / Pb son hacim su 1.5 ml ekleyin NTC çalışma stoğu karışımı için gereklidir, Pr / Pb setleri bir kısım maddelerin ayrılmasından sonra 1.7 ml stok tüp olarak ayarlayın.
- Girdap, kısa bir süre için santrifüj ve ardından buz üzerine ya da daha uzun süreli depolama için -20 ° C'de karanlıkta tüpleri.
- 384 oyuklu deney plakalarına aliquoting Pr / Pb setleri ve NTC karışımları, 96 oyuklu bir kaynak plaka hazırlanması.
NOT: Pr / Pb çalışmaları stok karışımları kaynak plakasının hazırlanması az 1 saat sürer. Her 96 oyuklu bir kaynak plaka altı 384 oyuklu deney plakaları (Şekil 3C) için yeterlidir.- Kısaca girdap ve Pr / Pb çalışma stokları ve NTC çalışma stok karışımları set santrifüj.
- Soğutulmuş bir 96-çukurlu soğutma bloğu yeni 96-yuvalı plakayı, her Pr / Pb seti için kuyu tayin veya NTC kuyuları (bakınız Şekil 2) alan karıştırın.
- 250 ul bir elektronik çok kanallı pipet kullanılarak 96 oyuklu plakaya su ekleyin: Her Pr su 66 ul koyun / Pb (hedef 17 için 4 gözlük hariç) de ayarlanır. 4 Hedef 17 kuyu suyu 82.5 ul koyun. De her NTC karışımı su 27.5 ul koyun. Doğru Pr / Pb 96-plaka belirlenen kuyu stok çalışan set ekleyin: Doğru Pr / Pb 54 ul (Hedef 17 için 4 kuyular hariç) belirlenen Pr / Pb seti kuyu stok çalışan set dağıtın. Hedef 17 Pr / Pb 67.5 ul dağıtın belirlenen Hedef 17 Pr / Pb seti kuyu stok çalışan set. Belirlenen kuyulara doğru NTC çalışma stok karışımı 22.5 ul ekleyin.
- Içeriği kuyu altındaki sağlamak için 700 x g, 1 dakika için bir yapışkan levha contası ve santrifüj ile 96 oyuklu plaka kapatın.
- 96 oyuklu bir plaka adaptörü kullanılarak vorteks karıştırıcıda 96 oyuklu plaka koyun ve 1000 rpm'de 1 dakika için karıştırın. Santrifüj 700 x g'de 5 dakika boyunca 96 gözlü plaka.
- Aynı gün içinde kullanılması durumunda, aksi kullanılana kadar -20 ° C'de saklayın, 4 ° C'de karanlıkta, 96 oyuklu bir kaynak plaka saklayın.
- Çok kanallı otomatik pipet kullanarak setleri Pr / Pb eklenerek 384 oyuklu deney plakaları hazırlayın.
NOT: 96-kuyu kaynak plaka altı tahlil plakaları hazırlanması 3-4 saat sürer.- Plakaları yapmadan önce, 4 ° C'ye kadar soğutulduktan yuva ön soğuk ve dakika başına 20-25 litre (LPM) arasındaki üfleme hava akımı ile 80 ° C ila 125 ° C arasında levha buharlaştırıcı ve alt ısıtma bloğu önceden ısıtın.
- Otomatik çok kanallı pipet açın ve çift yazılım simgesini tıklatarak IFN tahlil plakaları yapmak için protokol açın.
- Platformu kurulumu için, platform konumuna 1 tamamen dolu pipet ucu kutusu yerleştirmek, pozisyon 4 96-kuyu, kaynak plaka ve pozisyon 6'da yeni bir 384-plaka play butonuna basarak koşmak başlayın.
Not: bir çalışma tamamlandıktan sonra, her bir göze, Pr / Pb karışımı 5 ul ihtiva edecektir.
Not: ssDNA son miktarı 384 oyuklu deney plakasının her çukuruna ilave 0.025 mcg'dır. - Yavaşça kuyu altındaki olan sıvıları sağlamak için düz bir yüzeye 384 oyuklu tahlil plaka dokunun ve bir yapıştırıcı uygulanırplaka mühür.
- Santrifüj 700 x g, 1 dakika için levha. Plaka kurutma makinesi içine 384-iyi tahlil plaka koyun, yapışkan plaka mühür çıkarın ve kuyuların üstünde doğrudan 384-kuyu manifoldu yerleştirin.
- 384 oyuklu deney levhanın içeriği kuru, yeni bir yapışkan levha conta geçerli olduğunda, kullanılana kadar 4 ° C'de karanlıkta folyo, etiket ve mağaza sarın.
Not: Plakalar en az 6 ay için 4 ° C'de saklanabilir. - Adımları tekrarlayın 3.2.3-3.2.6 6 x kadar 384-iyi tahlil plakalar hazırlanır veya 96-kuyu, kaynak plaka sıvı tükenmiş.
- Soğutma yuva kapatın yazılımı kapatın ve otomatik çok kanallı pipet kapatın. Plaka kurutma kapatın.
4. Yükleme ve 384 deney plakası çalıştırma
- Iyi bir HKG, ssDNA, PCR ana karışımı, su ve Pr / Pb grubu oluşur karışımları, iki temizlik gen (HKG) hazırlanması (a kurutuldu 384 oyuklu deney plakası eklenecek
- Her HKG karışımı için 1.5 ml tüp etiketleyin.
- 84.9 ul su ile ssDNA (10 mg / ml), 2 ul seyreltin. Seyreltilmiş ssDNA 2 ul, su içinde 11.8 ul, ana karışımı 23 ul ve HKG Pr / Pr, her tüp, girdap ve kısa bir süre için santrifüj ayarlı doğru 20x 9.2 ul ekleyin.
- İnsan tahlil için hkg olarak gliseraldehid-3-fosfat dehidrogenaz (GAPDH) ve ubikuitin C (UBC) kullanın (Malzeme Tablo). Rhesus deneyi için hkg olarak GAPDH ve 18S ribozomal RNA kullanın.
Not: deneyi gerçekleştirmek için kullanılan HKG esnektir ve bir hücre tipi için uygun genler yansıtmalıdır test edilen GAPDH, UBC ve 18S yaygın olarak kullanılan hkg örnektir;. Diğer HKG daha uygun olabilir.
- Örnek ve positi hazırlanmasıde numune veya pozitif kontrol cDNA ana karışımı, su ve oluşan karışımları, kontrol ettik, kurutulmuş bir 384-oyuklu bir deney plakasına eklendi edilmesi. Örnek hazırlayın ve yeterli miktarda pozitif kontrol karışımları 21 plakalı kuyuları (Şekil 3D) dağıtmak için.
- CDNA sentezi önce, bir DNaz sindirim adım ile RNA örnekleri hazırlamak için üreticinin talimatlarını izleyin.
- Üreticinin talimatlarını takip RNaz H (her bir örnek için, 24 ul nihai hacim) ile işlenerek ve ardından RNA'nın en az 500 ng cDNA sentezi, önceden örnekleri ve pozitif kontrol hazırlayın. Kullanılana kadar -20 ° C 'de hazırlanmış cDNA saklayın. Çözülme, girdap, kısaca örnek cDNA santrifüj.
- Ana karışımı 78.8 ul ve her 24 ul numune ve pozitif kontrol tüpüne su 54.8 ul ekleyin.
- Kısaca girdap ve tüpler santrifüj.
- Standartları hazırlayın ve NTC iyi con karıştırırana karışımı su ve aşağıdakilerden oluşan bir kuru 384 oyuklu bir deney plakası (Şekil 3D) eklenmesi. Standartlar iyice karıştırın için, 1.5 ml tüp master karışımı 275 ul su 165 ul ekleyin. NTC iyice karıştırın için, 1.5 ml tüp master karışımı 52.5 ul su 52.5 ul ekleyin. Kısaca girdap ve tüpler santrifüj.
- Karışımları ve numune yükleme için bir kuru 384 oyuklu deney plakası hazırlayın.
- 700 x g, 1 dakika için kurutulmuştur 384 oyuklu deney 4 ° C plaka ve santrifüj çıkarın.
- , Soğutulmuş 384 soğutma bloğuna plaka koyun yapışkan plaka mühür kaldırmak ve çeşitli karışımlar ve örnekler (Şekil 1) pipetle nereye belirtmek için plaka kuyu özetlemektedir.
- Standart iyi karışımı, standartlara 384-iyi tahlil plaka yükleyin, NTC iyi örnekleri, pozitif kontrol ve HKG karışımı (Şekil 3E) karıştırın. Vortex ve kısaca santrifüj tüm çözümler plaka dağıtım önce.
- Standartların 6 ul iyi 30 ul elektronik çok kanallı pipet ile her bir standart kuyusuna karıştırın dağıtın. 12.5 ul elektronik çok kanallı pipet ile iyi belirlenmiş doğru standart seri seyreltme 1.5 ul koyun.
- NTC 7.5 ul iyi 30 ul elektronik çok kanallı pipet ile de her NTC karıştırmak dağıtın. 30 ul bir elektronik çok kanallı pipet ile belirlenmiş oyuklara örnek 7.5 ul koyun. 12.5 ul elektronik çok kanallı pipet ile belirlenen kuyu karıştırır HKG Pr / Pb 2.5 ul koyun.
- 30 ul elektronik çok kanallı pipet ile artık su ve usta karışımı karışımı 7.5 ul ile herhangi bir boş kuyu doldurun; Su 7,5 ul yalnız de çalışacaktır.
- 700 x g, 1 dakika için bir optik yapıştırıcı film ve santrifüj ile 384 oyuklu tahlil plaka kapatın. 2600 rpm'de 2 dakika boyunca vorteks karıştırıcıda mühürlü 384 oyuklu plaka vorteksve x, g 700 ° C'de 5 dakika boyunca santrifüj.
- , Mah-PCR makinesinde mühürlü 384-kuyu tahlil plaka koyun tahlil düzeni için şablonu açın ve çalıştırın başlar.
NOT: Sonuçlar bir tablo olarak ya da analiz için bir metin dosyası olarak ihraç edilebilir. - Deney için, aşağıdaki en iyi termal döngü reaksiyon koşulları kullanarak, i) 50 ° C sıcaklıkta 2 dk, ii) 95 ° C sıcaklıkta 10 dakika süre ile, iii) 25 s için 95 ° C, iv) ile, 1 dakika için 59 ° C. Tekrar 40 döngü için iii ve iv adımları.
- Bir elektronik tablo uygulaması yazılımı içine Mah-PCR platformu ham veri verir. Lineer gözlemlemek için bir standart eğri olarak belirlenen her 4 nokta standardı çizilir. ΔCq hesaplayarak veya dört nokta standart eğrileri 27 dayalı kopya sayısına göre analizi yapın.
Aşağıda Şekil 3 görün
Representative Results
QRT-PCR deneyi, hücre tipleri ve çeşitli bağlamlarda da tip I ve III, IFN salgılanma modellerini analiz etmek için uygulanabilir tarif. Örneğin, insan tip I ve III, IFN ekspresyon profili 6 donör Toll benzeri reseptör ligandları ile uyarılan periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) analiz edilmiştir; poli I: C (25 ug / ml) LPS (10 ng / ml), imikimod (10 uM) ve CpG oligonükleotitleri (1 uM) (Şekil 4). Veriler elektronik tablo uygulama yazılımı kullanılarak analiz ve protein dizisinin 27 filogenetik ağacın göre saat yönünde düzenlenmiş IFN-α alt tipleri ile radar grafikleri olarak sunuldu. insan IFN ifade radar çizelgeleri tahlil tasarımına dahil analiz iki farklı yöntem kullanılarak hesaplanan bir günlük ölçekte sunulmuştur: HKG (ΔCq) normalize mutlak Cq değeri, toplam RNA mikrogram (mcg) başına şablon kopya sayısı . Kopya sayısı değerleri sonuçları o hesaplanır fa transkript standart eğri. Eldeki TLR agonistleri tarafından ortaya çıkarılan insan IFN ekspresyon profili bağ spesifik olduğunu gösterir.
Aşağıda Şekil 4 görün
Insan IFN ifade imzalar için gösterildiği gibi, türleri ifade imzaları, rhesus makak I ve III IFN ayrıca belirli TLR ligandı vardı. 3 saat (Şekil 5) C (50 ug / ml) LPS (10 ug / ml), Imiquimod (10 ug / ml): 3 vericiden elde edilen PBMC, poli I ile uyarıldı. Başlangıçta uyarılmamış hücrelerde IFN alt tipi ifadesi düşük oldu. C: IFN-y alt tiplerinin sınırlı sayıda LPS ve poli I yanıt olarak ifade edildi. Bunun aksine, imikuimod yanıt olarak IFN ifade yüksek ve alt tip ifade genişti. Üç TLR agonistleri 28 IFN-β ve IFN-λ1 ifadesi geliştirilmiştir.
Aşağıda Şekil 5'e bakınız
her zaman ">
Şekil 1:. Yedi Pr / Pb setleri ile 384 deney plakası için düzeni hedef numarası, Pr / Pb işaret eder. dört nokta standart eğrileri (koyu gri üçgen) sütunlar 1-5 eklenir. HKG Pr / Pb setleri (Beyaz arka plan), sütunlar 6 ve 7 geri kalan sütun 8-24 ilave yedi Pr / Pb kümelerinin biri için spesifiktirler. Örnekler sütun, 6-24 (siyah oklar), satırlar AP eklenir. sütunun 5 altındaki iki kuyu (O5, P5) sadece su ve ana karışımı alırsınız. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2:. Onyedi Pr / Pb setleri ile 96 kuyu kaynak plaka için düzeni Hedef numarası Pr / Pb anlamına gelirset. Bir Pr / Pb seti birden kuyulara ilave edildiğinde siyah oklar temsil eder. NTC karışımlar belirlenen kuyuları (koyu gri arka plan) eklenir. diyagonal çizgiler ile iki kuyu (F3, G3) kullanılmamaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: Mah-PCR testi protokolü belirli adımların şematik diyagramı AE protokolü bölümlerini seçin.. (A) Aşama 1: Standart seri seyreltileri hazırlanması. (B) 2. Adım: Pr / Pb ve NTC çalışma stok karışımlarının hazırlanması. (C) Aşama 3.1: Hi / Pb setleri ve NTC karışımları, 96 oyuklu bir çalışma stokları plakasının hazırlanması. (D) Kademe 4,1-3: 384 oyuklu tahlil plaka yüklenmesi için karışımların hazırlanması. (Avustralya, Brezilya Ve Kuzey Amerika Ülkelerinin Kullandığı Saat Uygulamasıep 4.5: 384 oyuklu tahlil plaka yükleme. Diyagramları sağ alt köşesine sol üst okunur. Interferon (IFN) tahlil için Reaktifler -20 o C'de saklanır ve sol sütunda listelenen; protokol çizgiler ayrı eylemler. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. Periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde insan IFN ifade imza (PBMC), Toll benzeri reseptör ligandları ile uyarıldı ve RNA QRT-PCR analizi için hasat edildi stimülasyon PBMC için kullanılan Toll benzeri reseptör ligandlarına karşılık olarak değişmektedir. Tepe cevapları geometrik ortalamaları I poli: C (25 ug / ml) ile 8 saat (kırmızı kareler), LPS (10 ng / ml), 4 saat (yeşil üçgenler), imikimod (10 uM), 16 saatte ( mor elmaslar) CpG (1 uM)16 saat (siyah daireler) ve 16 saat sonra uyarılmamış kontrol (mavi daireler) 6 vericiden (solda) HKG UBC ΔCq ifadesi bir fonksiyonu olarak günlük 10 cetvelinde gösterilir, ya da RNA ug başına kopya sayısı olarak (sağ) . IFN-α alt türleri, amino asit dizi benzerliği olan filogenetik arsa göre sıralanır. Bu rakam aslında İmmünoloji ve Hücre Biyolojisi 27 yayımlanmıştır.
Şekil 5:. Periferal kan tek-çekirdekli hücrelerinde Rhesus macaque IFN ifade imza (PBMC) (kare, baklava ve üçgeni tarafından belirlenmiş), üç resus makakların uyarım PBMC için kullanılan Toll benzeri reseptör ligandlarına tepki olarak farklı bütün kandan izole edildi ve C (50 ug / ml) ya da imikuimod (10 ug / ml) lipopolisakkarit (LPS) (10 ug / ml), poli I ile uyarılır. Hücreler ope (0 saat sonra hasat edildin şekiller) veya IFN ifade ölçümü için TLR stimülasyonu (kapalı şekillerin 3 saat sonra). Tip I, II ve III 'IFN transkript seviyeleri (solda) HKG GAPDH ΔCq ifadesi bir fonksiyonu olarak ya da kopya sayısı / ug RNA (sağ) olarak günlük 10 ölçekte gösterilir. Bu rakam aslında İnterferon Dergisi ve Sitokin Araştırma 28 yayımlanmıştır.
Tablo 1:. İnsan IFN astar / prob seti dizileri ve reaksiyon bilgileri bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Tablo 2:. Rhesus makak IFN astar / prob seti dizileri ve reaksiyon bilgileri bu tablonun büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Plazmid konsantrasyonu (FM) | ||||
| Bir | B | C | D | |
| IFN-α1 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α2 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α4 | 2500 | 250 | 25 | 2.5 |
| IFN-α5 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α6 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α7 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α8 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α10 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α14 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α16 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-α17 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-α21 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-λ1 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-λ2 | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-λ3 | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
| IFN-β | 25 | 2.5 | 0.25 | 0.025 |
| IFN-ω | 250 | 25 | 2.5 | 0.25 |
Tablo 3: Standart seyreltme seti konsantrasyon bilgileri.
| IFN Pr / Pb Setleri eklendi | Su hacmi ilave (mi) | |
| NTC 1 | IFN-β, -ω, -λ3 | 85.7 |
| NTC 2 | IFN-α1, -α5 | 100.0 |
| NTC 3 | IFN-α2 | 114.3 |
| NTC 4 | IFN-α4 | 114.3 |
| NTC 5 | IFN-α7 | 114.3 |
| NTC 6 | IFN-α6, -α8, -α10 | 85.7 |
| NTC 7 | IFN-α14, -α16 | 100.0 |
| NTC 8 | IFN-α17 | 114.3 |
| NTC 9 | IFN-α21, -λ1 | 100.0 |
| NTC 10 | IFN-λ2 | 114.3 |
Tablo 4: NTC çalışma stok bilgileri karıştırır.
Discussion
Bu rapor, tasarım, toplu üretim ve bir araştırma laboratuar ortamında yüksek olarak benzer genlerin bir dizi transkripsiyonunu ölçmek için bir deney analizinin doğru bir yaklaşımı tarif eder. Burada bildirilen yüksek verimli QRT-PCR testi IFN ve ölçer - yüksek özgüllük ile λ alt tipleri. Bu yöntem iki temel yönlerini, bir homolog gen ailesinin üyeleri ve Pr / Pb setleri ile önceden yüklenmiş, güvenilir ve tutarlı 384 tahlil plakaları oluşturulması için bir üretim platformu gelişimi arasında ayrım Pr / Pb setleri tasarımı içerir. Mah-PCR probları kendi özgünlüklerini 29 artırılmasına yönelik yapısal (MB) veya kimyasal (LNA) yaklaşımı içermektedir. Rhesus tahlilinde (Tablo 2) astar setlerinin ikisi için, amplifikasyon refraktör mutasyon sistem (ARMS) daha fazla özgüllük, 30 geliştirmek için primer diziler dahil edilmiştir. Bu Enha için ekson-ekson bağlantı yerleri hedef, genel olarak en iyi ikentip I genler intronlan eksikliği IFN çünkü Mah-PCR reaksiyonunun nce özgüllüğü, bu mümkün değildi. Bu nedenle, genomik DNA, PCR reaksiyonunda amplifiye edilecek ve RNA ekstraksiyonu sonra DNase muamelesi ile bozulmuş olması gerekir.
Pr / Pb kümeleri için, hedef bölge, her bir IFN için olgun peptide ait kodlama bölgeleri ile sınırlandırılmıştır. IFN-α alt türlerine, özellikle olgun peptid bölgesi arasında yüksek dizi benzerliği nedeniyle, özgüllük sağlamak için duyarlılık uzlaşma bazen gerekli oldu. Bu özellikle diğer IFN-α alt tiplerine karşı karşılaştırıldığında olgun peptid transkript sadece dört benzersiz üsleri olan IFN-α17, böyleydi. Hedefleme, IFN-α17 sondasına özgüllük sınırlayan çok sayıda alt-tiplerinin transkript bağlanan primerler gerekmez. Bunun bir sonucu olarak, PCR reaksiyonu, böylece, PCR reaktifleri ve loweri önemli bir yüzdesini alıcı IFN-α17 başka alt tipi artıracaktırIFN-α17 için spesifik sonda floresan sinyalinin genliği ng. Böyle IFN gibi son derece benzer genler için duyarlı ve özgül Pr / Pb setleri tasarımı yönelik ek bir zorluk Gen bankasındaki açıklamalı dizileri tasarım sırasında tam veya kapsamlı olmayabilir olasılığıdır. Yine, bu yeni açıklamalı dizileri mükemmel tasarımı sırasında veritabanında dizisinin sürümü ile aynı hizaya etmeyen IFN-α17 için bir meydan okuma oldu. Pr tasarlarken Bu nedenle, / Pb yoğun çalışma yapılmamıştır genler için ayarlar, periyodik bir hedef genin son açıklamalı dizisini kontrol etmek akıllıca olacaktır. Son olarak, Pr / Pb setleri Kopyası çıkarılan ancak çevrilmeyen edilebilir pseudogenleri amplifiye emin olmak için gereklidir.
Pr / Pb setleri tasarladıktan sonra, bir sonraki zorluk yedi farklı Pr / Pb PCR koşulları optimize ediyor, bir 384-plaka üzerinde ayarlar. Transkript standartları impor olanBir Pr / Pb kümesi özgünlüğünü test ve çok sayıda farklı PCR reaksiyonlarının Mah-PCR koşulları uyumlaştırılması için gerekli hale de tant. Transkript standartlarına karşı Pr / Pb seti test verimliliği ve hassasiyetini kurar; yüksek oranda benzer pseudogenleri ifade plazmidleri Pr / Pb seçici olarak işlevsel bir genin transkripsiyonunu ölçer sağlamak için gerekli olabilir. transkript standartları da bir ev bakıcısı geni (ΔCq) yarı-nicel analiz nisbetle ek olarak, analiz, bir sayısal aracı (transkript sayısı) bulunur.
Birden fazla 384 oyuklu deney plakaları bir 96-çukurlu bir kaynak plaka Robotik çok kanallı pipet hassas ve inter-plak sonuçları tutarlılığını arttırır. Yapar plaka içine tevzi reaktif kurutma gibi somon sperm DNA (ssDNA), stabilize eder ve uzun süreli depolama için Pr / Pb setleri koruyan bir taşıyıcı madde olarak kullanılır. Plakaları Kurutma de reaksiyon hacmi azaltırda değerli örnekleri korur ve pahalı reaktiflerin kullanımını azaltır tekrarlanabilir sonuçlar için gerekli. Bu adımlarda, plakaların toplu fazla altı ay için hassasiyet ve tutarlılık sağlamak monte edilir.
Plaka hazırlığı takiben, kalite kontrol önlemleri plakaların bir toplu tutarlılığını kontrol etmek önemlidir. Bu amaçla, standart bir ek dört set bir plaka üzerinde çalışır. "5x standart" plaka performansını izler ve bireysel levhanın standartları karşılaştırıldığında hangi bir veri kümesi oluşturur. Her bir standardın on 10-kat seyreltme deney tasarımı sırasında kullanılır, alan hususlar dört nokta, her bir deney plakası üzerindeki standart eğri için kullanılır ve 5x standart levha olduğu gerektirir. Buna ek olarak, bir pozitif kontrol plakası geçerliliğini sağlamak için her bir plaka üzerine dahil edilmelidir.
Tipik olarak, Pr / Pb s birinden altı tahlil plakaları hazırlamak için 3-4 saat sürerource plaka; Bir araştırma laboratuvarında tek bir gün içinde on iki tabak hazırlamak için mümkündür. Her insan IFN alt tipi tahlil plakası onyedi Pr / Pb setleri inceler ve on beş deneysel örnekleri ağırlayacak beri, montaj bir gün 3,060 deneysel veri noktalarına kadar üretmek için kapasiteye sahip plakaların bir toplu üretir. Mah-PCR platformu Ham veri işlenir ve otomatik olarak önceden tasarlanmış bir analiz şablonu doldurmak için bir elektronik tablo uygulaması yazılımı programlama komut dosyalarını kullanarak monte edilebilir. Bu yöntem eller veri girişi, böylece önlenmesi kopyalama hatalarını en aza indirir ve araştırmacı veri analizi ziyade veri derleme odaklanmasını sağlar. Burada tarif edildiği gibi, bu, yüksek verimli QRT-PCR deneyi, insan ya da resus makak örneklerde interferon alt tiplerinin ekspresyonunu ölçmek için uygulanabilir ve diğer türler ya da homolog gen kümeleri için kullanmak üzere adapte edilebilir. plaka düzeni esnekliği kullanıcı astar değiştirmenize olanak sağlar / sonda genlerini terzi setleribelirli bir hücre tipi veya model sistem doğru faiz. Bu deney, bağışıklık tepkisi önemli olan sinyal mekanizmaları aydınlatmak için patojenler okuyan hücre kültürü modelleri ya da hastalık modelleri bağlamında, hasta numunelerinde IFN sentezleme imza ölçülmesi için tatbik edilebilir.
Acknowledgments
Bu çalışma CBER / FDA NIAID / NIH Kurumlararası Anlaşma YI-AI-6153-01, FDA / CBER içi fonlar ve FDA Tıbbi Önlemler Girişimi tarafından desteklenmiştir. TCT, MNB, VPM, LMS ve KDK ABD Enerji Departmen ve ABD arasında bir Kurumlararası anlaşma yoluyla Fen Eğitimi için, Oak Ridge Enstitüsü tarafından uygulanan Biyolojik Değerlendirme ve Araştırma Merkezi'nde araştırma Katılım Programı için randevu tarafından desteklenen Gıda ve İlaç İdaresi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 ml PCR Tube Strips | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | E0030 124 286 | |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 0.5-12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-139 | *Discontinued |
| 12-channel 384 Equalizer Electronic Pipette, 1-30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-137 | *Discontinued |
| 12-channel Electronic Pipette, 5-250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-118 | *Discontinued |
| 2.0 ml Micro Centrifuge tube, sterile | Celltreat Scientific Products (Shirley, MA, USA) | 229446 | |
| 8-channel Electronic Pipette, 15-1250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-115 | *Discontinued |
| Disposable Reagent Reservoirs | VWR International (Radnor, PA, USA) | 89094-668 | 25mL reservoirs with 2 dividers |
| E-Centrifuge | Wealtec Corp. (Sparks, NV, USA) | 1090003 | |
| Eukaryotic 18S rRNA (18S) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs99999901_s1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Fixed Speed Mini Vortexer | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 02-215-360 | |
| Gas Permeable Adhesive Plate Seal | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB-0580 | Disposable plate seal used during the plate preparation process |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | Human HKG Primer/probe set |
| Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Rh02621745_g1 | Rhesus HKG Primer/probe set |
| Hudson Solo automated multichannel pipettor | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800200 | Modified with a 384-well cooling nest |
| Linearized plasmids (IFN genes) | Aldevron (Fargo, ND, USA) | Custom Order | Item 3000, 3580; used for assay standards |
| LNA inhibitors | Exiqon (Woburn, MA, USA) | Custom Order | Item 500100 |
| LNA Probes | Sigma-Proligo (St. Louis, MO, USA) | Custom Order | Material number VC00023 |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 12.5 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-193 | |
| Matrix Filtered Pipet Tips, 30 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-196 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 1,250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-160 | |
| Matrix TallTip Extended Length Pipet Tips, 250 ul | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 14-387-152 | |
| MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate with Barcode | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4309849 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | N8010560 | |
| MicroAmp Optical Adhesive Film | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4311971 | Adhesive film used for sealing the plate prior to the qRT-PCR run |
| Microsoft Excel 2010 Spreadsheet | Microsoft (Redmond, WA, USA) | Office 2010 | Visual Basic programming language |
| MixMate Vortex Mixer | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | 5353 000.014 | 2 dimensional plate vortex apparatus |
| Molecular Beacon Probes | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| PCR Cooler, iceless cold storage system for 96 well plates and PCR tubes | Eppendorf (Westbury, NY, USA) | Z606634-1EA | |
| Plate Dryer (manifold) | Mechanical and Electrical Design Fabrications, NIH Office of Research Services (Bethesda, MD, USA) | Custom Order | |
| Primer sets | FBR (Silver Spring, MD, USA) | Custom Order | |
| pUC57 plasmid DNA | Genescript (Piscataway, NJ, USA) | SD1176 | |
| Rnase-Free 1.5 ml Microfuge Tubes | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | AM12400 | |
| RNase-free DNase Set (50) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 79254 | |
| RNase H | New England Biolabs (Ipswitch, MA, USA) | M0297L | |
| RNeasy Mini Kit (250) | Qiagen (Valencia, CA, USA) | 74106 | |
| Robot Tips (clear tip pre-sterilized pipet tips) | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | 800350-S | |
| Salmon Sperm DNA Solution | Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) | 15632-011 | |
| SoftLinx Version V | Hudson Robotics (Springfield, NJ, USA) | Custom Order | Software for programming pipetting steps |
| TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x), no AmpErase UNG | Life Technologies (Grand Island, NY, USA) | 4352042 | |
| ABgene Adhesive Plate Seals | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB0580 | |
| Ubiquitin C (UBC) | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | Hs01871556_s1 | Human HKG Primer/probe set |
| Verso cDNA synthesis Kit | Thermo-Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | AB1453B | |
| ViiA 7 Real-Time PCR System | Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) | 4453536 | |
| Water-Ultra Pure | Quality Biological, INC. (Gaithersburg, MD, USA) | 351-029-101 | |
| Zipvap 384 (plate dryer heating element) | Glas-Col LLC (Terre Haute, IN, USA) | 384-109A | Plate Dryer |
References
- Yan, N., Chen, Z. J.
- Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
- Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
- Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
- Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
- Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
- Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
- Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
- Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
- Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
- Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
- Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
- Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
- Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
- Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
- Heathcote, J., Main, J.
- Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
- Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
- Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
- Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
- Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
- Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
- Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
- Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
- Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
- Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933 (2009).
- Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
- Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
- Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
- Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).
