Protocol
Zebrafisk (pärlemor stam) avlades och uppvuxen enligt etablerade protokoll. Alla ansträngningar gjordes för att minimera lidandet, med hjälp av 0,4 mM Tricaine för anestesi och 1 mM Tricaine för dödshjälp. Zebrafisk embryon och larver hanterades i strikt överensstämmelse med god djur praxis som har godkänts av behöriga utskott (MDI biologiska laboratorium djur core IACUC nummer 13-20). Studien godkändes av National Human Genome Research Institute Djurvård och användning kommittén, MDIBL Institutional Assurance # A-3562-01 enligt protokoll # 14-09.
Obs: Avbildningen som fångar fin förnyelse i larvzebrafisk sammanfattas i följande steg:
1. Höjning av Zebrafish till larvstadier
- Samla ägg och placera ca 50 ägg i en 100 x 25 mm petriskål med 0,03% Omedelbar Ocean salt i avjoniserat vatten kompletterat med 0,00004% metylenblått. Inkubera O / N i en 28,5 ° C inkubator. <li> Nästa morgon tar bort de döda embryon med ett glas pipett och skölj äggen i en sil med 0,03% Omedelbar Ocean salt i avjoniserat vatten (benämnd embryo medium).
- sup> Lägg färskt embryo medium till skålen. Vid användning av pigmenterade stammar, valfritt lägga 0,2 mM 1-fenyl-2-tiourea (PTU), som PTU förhindrar melanogenes och sålunda pigmente av larverna. Låt embryona ytterligare utveckla i inkubatorn tills två dagar efter befruktningen eller någon annan önskad larvstadiet.
Anm: medium såsom Ringers 18, Hanks 18, E2 19, E3 20 och Danieau 21 kan föredras.
2. Beredning av Imaging avdelningen
- Metod 1: Imaging kamrar tillverkade av PVC eller Teflon slang (Figur 1)
Obs: Denna metod liknar Concha och Adams (1998) 22.- Förvärva dricksvattenkvalitet plast eller teflon slang från en järnaffär med en 25 mm ytter enda 20 mm innerdiameter. Skär slangen för att göra ringar med cirka 10 mm tjocklek med en jämn yta på varje sida. Använd> 200 grit sandpapper för att jämna kanterna.
- Rengör ringarna med varmt vatten och 70% etanol och låt dem lufttorka.
- Med en pipettspets, applicera silikonfett till en halv av en ring och fäst ringen på en 75 mm x 25 mm täckglas. Alternativt kan du använda en 3 ml spruta fylld med silikonfett i stället för en pipettspets.
Notera: Eftersom det är svårt att sätta in fettet kisel i 3 ml sprutan, lägga fettet kisel till en 30 ml spruta först och använda detta för att fylla 3 ml sprutan.
- Metod 2: Framställning av en petriskål som en avbildning kammare.
- Förvärva 35 eller 60 mm diameter petriskålar med ett täckglas fäst locket (Figur 2A). Alternativt, såsom visas i figur 3 av Distels & Koester (2007) 23, borra en öppning tillräckligt liten för att hgammal ett täckglas i locket på en liten petriskål och applicera silikonfett på utsidan med en 3 ml spruta. Med hjälp av en ren pipettspets försiktigt bifoga en rund eller fyrkantig täck av önskad tjocklek på utsidan (figur 2B).
- För att säkerställa att agarosen som används för montering vistelser stadigt fästa under avbildningsförfarandet, bifoga en fin plastnät inne i ringen. Först skär maskorna gjord av fönsterfilm som erhållits från en järnaffär, i storleken på den inre ringen diametern med fina sax med en vinkel. Skär sedan en liten rektangel> dubbelt så stor som larven i mitten av nätet (Figur 1, 2).
- Applicera fyra små prickar av giftfria silikonfett till gränssnittet mellan täckglas och kammaren ringen (Figur 1A).
- Använd pincett för att fästa den mask stadigt till botten av glaset täckglas.
3. Montering och Imaging av Pre-injkonfiguerad Larva (detta steg är valfritt)
Obs: Detta steg är lämplig för jämförelser mellan den amputerade och regenere fenlängd, eftersom amputation planet efter fin regenere inte känna igen i zebrafisk larver.
- Förbered en 0,5-1,2% låg smält agaroslösning i embryot medium för immobilisering av provet.
- Värm agaros i en mikrovågsugn och överföra den flytande agaros i 1,5 ml rör som är förvärmda till 42 ° C i ett värmeblock.
- Låt den heta agarosen svalna till 42 ° C, vilket kan bibehållas under flera veckor vid denna temperatur. Försök att undvika att pipettera larverna i agaros över 42 ° C, eftersom detta kommer att skada djuren.
- Söva flera larver med 10 ml 0,4 mM Tricaine (pH 7) i embryo medium i en 60 mm diameter petriskål. Förbered Tricaine enligt zebrafisk Book Recept 18.
- Alternativt kan du använda 10 ml av en 1: 1000 utspädning av 99% 2-fenoxietanol i en 60 mm diameter petriskål. Peta larverna med en maximerad microloader pipettspetsen att bedöma deras anslagskänslighet innan du fortsätter. Använd endast icke-responsiv larver.
- Överför en larv i 42 ° C agaroslösning med hjälp av en glas Pasteur-pipett. Häll inte över överdriven vätska i agarosen, annars agarosen kommer alltför utspädd och inte stelna.
- Kassera den återstående vätskan från pipett och överföra larven med en droppe av agaros i en liten petriskål (35 eller 60 mm diameter). Placera larven på sin sida för avbildning av stjärtfenan.
- Låt agarosen stelna. Bedöm agarosen med en plast pipettspets; spetsen kommer att fördjupa in agarosen om det är för vätska. När agarosen har stelnat, kommer en liten indrag vara synlig vid röra med en pipett spets. Efter stel, lägga Tricaine lösningen och fortsätt till stereomikroskop som kommer att användas senare för time-lapse avbildning.
- Använd ett stereomikroskop med time-lapse programvara. Välj ett lämpligt mål och förstoring, som kommer att användas senare för time-lapse avbildning. Här, använd en 3,5 x, 16 mm arbetsavstånd objektiv på ett stereomikroskop. Som önskas, utnyttja alternativa mikroskop och objektiv men väljer en ordentlig förstoring för att redogöra för potentiella xy-drift och tillväxt av fenan under avbildningsförfarandet.
- Välj kameraläge upptäckt på mikroskopet.
- I programmet, välj "live" läge för att visa larven på skärmen.
- Öppna fönstret "Egenskaper" för att automatiskt upptäcka ljusstyrkan.
- Manuellt justera kontrasten vid mikroskopet trans belysning bas.
- Flytta larven ur synfältet och välj Skuggning funktion för korrigering för att minimera bakgrunds nejise.
- Placera larven tillbaka in i synfältet och ta ett snapshot. Spara bilden.
- Ta agarosen från larven genom att först skrapa agarosen av huvudet. Detta sätt larven kan gled ur agarosen genom att försiktigt dra bort huvudet från den återstående agaros med ett tak microloader pipett spets eller en insekt stift.
- Med ett glas Pasteurpipett överföra larven till frisk Tricaine lösning.
4. Amputering Assay
- Bered en 1,5% -ig lösning med hjälp av embryo medium och häll ett tunt lager i en petriskål. Låt agarosen stelna.
- Enligt ett stereomikroskop, placera larven sidledes på den stelnade agarosen och amputera stjärtfenan med en 23 G sprutnål med lätt tryck (Figur 3A).
5. Montering av Larva för Time-lapse avbildning
- Fortsätt enligt beskrivningen i steg 3,1-3,5 (Figur 3B).
- För att möjliggöra en korrekt sårläkning eller vävnadsregenerering inträffar, försiktigt skrapa bort agarosen omger den distala stjärtfenan använder ett tak microloader pipettspetsen eller en insekt stift. Försök att inte skada fenan upprepade gånger (figur 3C).
- Dekantera den Tricaine lösningen innehållande den avlägsnade agaros och fylla kammaren ring med färsk Tricaine lösning.
- Applicera silikonfett till toppen av kammaren ringen och fäst en 75 mm x 25 mm glasskiva. Försök att undvika luftfickor i kammaren, eftersom de kommer att störa bright imaging och uttorka larven över tiden.
- Om du använder en petriskål somen avbildningskammare, applicera silikonfett till den övre kanten av den nedre kammaren och fylla bottenkammaren med Tricaine lösning. Häll försiktigt Tricaine lösningen i locket och vrid locket över att fördjupa larven i Tricaine lösning av bottenkammaren i en liten vinkel för att undvika luftfickor. Kammaren kommer att tätas på grund av fett kisel.
6. Time-lapse Imaging
- Montera en uppvärmd inkubationskammare enligt beskrivningen i 23,24 (Figur 4) .Sätt inkubationskammaren runt mikroskop och slå på värmen. Justera temperaturen till 28 ° C under ca 10-20 min eller tills temperaturen har stabiliserats.
- Öppna den främre delen av den uppvärmda inkubationskammaren och placera avbildning kammare på mikroskop monter med täck vänd uppåt mot målet.
- Placera larv fena på ett sätt som 2/3 av synfältet fortfarande obesatt. Detta säkerställer tillfångatagandet avtillväxt och regenerering av fenan under loppet av avbildningsproceduren utan att behöva ompositionera larven.
- Justera monterade larven till 28 ° C under ~ 30 min före start av inspelning med tidsluckor för att undvika förändringar i brightintensitet eller potentiella förskjutningar av agarosen. Alternativt använder förvärmda buffert för att starta bild efter kortare tidsinställning.
- För att ställa in time-lapse inspelning, öppna 6D Multidimensional Acquisition fönster i AxioVision programvara och välj alternativet z-stack och time-lapse.
- Valfritt) På fliken z-stack och Slice Läge, välj snittjocklek och välj sedan Start / Stop-läge.
- Definiera det övre och det nedre läget i bunten.
- Under fliken tidsförlopp, välj intervall och varaktighet av filmen och sedan starta filmen genom att trycka på startknappen. Vi fann att 30 minuters intervall är tillräckliga och detta intervall genererar inte överdrivet uppgifter; emellertid ShorteR-intervall kan användas.
- Kontrollera positions- och z-stack mått under den första timmen, om larven var inte pre-justerade. Om det behövs, flytta larven igen efter en dag, eftersom larven kan ha skiftat.
- Spara filen i slutet av time-lapse inspelning och fortsätt med efterbearbetning och kvantifieringar som använder tillgängliga bildanalys programvara, till exempel Imaris 25 eller öppen källkod programpaket Image J 26 och Fiji 27.
7. Data Analysis
- Fastställande av fin längd.
- Öppna time-lapse film i bildbehandlingsprogram och spara filerna i det proprietära filformat för att förbättra programvarans prestanda.
- Välj den ortogonala syfte att visa enskilda avsnitt som projicerade stackar. För drift korrigering, enligt Fiji menyn, välj Plugins, då registrering, och "Rätt 3D drift". Detta kommer att öppna ett Fiji fönster och utföra drift korrigeringar. Korrektrotations drift i Imaris Spots funktionen. Alternativt, installera StackReg och TurboReg plugins i Bild J och importera till Fiji. Välj önskad omvandling algoritmen i StackReg plugin.
- För att mäta avstånd (t.ex. sår diameter eller fin längd), välj "Lägg Nya mätpunkter" alternativet i det övre vänstra verktygsfältet.
- Under "Konfigurera listan över synliga Statistik Värden" i det nedre vänstra menyn, välj statistikvärden som ska visas.
- I "Linje Mode 'under fliken Inställningar väljer" Par (AB, CD ...) ".
- I "Etiketter Egenskaper 'välj" Namn "och" Avstånd ", för att visa avståndet mellan punkterna A och B bredvid mätningslinjen.
- Växla till "Redigera" läget och håll nere knappen shift för att välja den första punkten i slutet av notochord. Använd sedan samma konfiguration för att välja den andra punkten i den distala fin marginal.
- Under fliken "Statistik", välj disk knappen (Exportera alla) längst ner till höger för att visa och exportera avståndet i bilden.
- Upprepa mätningarna vid valda tidpunkter genom att flytta reglaget under bilden till höger. Istället för att skapa nya mätpunkter kan de tidigare flyttas genom att först välja den punkt med vänster musknapp, då samtidigt trycka på shift och vänster musknapp på den nya positionen.
- Alternativt att alternativet mätpunkt, utnyttja slice betraktaren att mäta avstånd. I slice visningsläget, bläddra till ett önskat läge och klicka på den första och andra positionen med vänster musknapp. Avståndet visas. Detta alternativ dock inte tillåter dataexport.
- Fastställande fenlängd och området i ImageJ.
- Öppna time-lapse film i ImageJ med hjälp av en plugin som erkänner .zvi filformat. Alternativt, ladda i en QuickTime fil eller tiff sekvens.
Obs: Om du använder ett okomprimerat TIFF-format, gör bildens dimensioner behöver inte anges. - Om du öppnar ett annat filformat utan filinformationen välj 'Set Scale "under menyn" Analyze "för att först definiera bild avstånd och enhet. I "Set Scale menyn", skriv in "Avstånd i pixlar", under typ i "Känd avståndet" för pixelvärdet (detta kan erhållas genom att mäta antalet pixlar på en skala bar som lades till bilden Klicka sedan på Mät för att erhålla resultatet), och "Enhet för längd" (typiskt "um"). Klicka sedan på OK.
- För fin mätningar i området väljer du "Freehand Selection" verktyg i verktygsfältet och skissera fenan området genom att hålla ner vänster musknapp medan du ritar längs konturerna av fenan. För mätningar fenlängd, välj "Straight" linjeverktyg och dra en linje mellan de önskade punkter varamätas.
- Klicka på "Measure" alternativ under "Analyze" för att visa området och längden på fenan. Upprepa detta steg så ofta som behövs för flera punkter i filmen tid.
- Öppna time-lapse film i ImageJ med hjälp av en plugin som erkänner .zvi filformat. Alternativt, ladda i en QuickTime fil eller tiff sekvens.
- Använda statistik programvara kan data grafiskt.
Representative Results
Den presenterade tekniken är lämplig för att belysa vävnadsreparationsdynamik som svar på amputation. Filmen visar att amputation av fenan initialt utlöser en handväska-string effekt, som kännetecknas av sammandragningar via aktin-myosin kablar som finns i fenan gånger 28 (Figur 5 A, B). Samtidigt, celler extruderas från såret (se filmen). Den kontraktion kan således vara ett sätt att fördriva celler som sannolikt är avsedda att genomgå celldöd. Våra resultat visar vidare att utvecklings tillväxten av larven uppträder oberoende av regenerering (film), medan fin förnyelse inte initiera förrän om 14 timmar efter amputation mätt med fin längd och area under tidsförloppet av 36 timmar efter amputation (Figur 5C , D). Den totala regenerativa fin tillväxt efter 1,5 dagar var ca 60% av den ursprungliga fin längd (Figur 5E). Sammantaget visar dessa resultat att amputation tr iggers fena kontraktion, extrudering av celler från såret, och en tidsmässigt fördröjd regenerativt svar. Medan extruderade celler troligen avsedd att genomgå celldöd, måste arten av dessa celler som skall klargöras ytterligare.
Figur 1. Imaging kammarringaggregat
(A) visad är en plastring som är fäst vid en täckglas med silikonfett. Ett plastnät är fäst på insidan av kammaren med fyra små punkter av silikonfett. (B) Den kammare som innehåller det monterade larven är fylld med Tricaine lösning och en glasskiva är fäst till toppen. (C) En monterad 2 dagar gammalt larv (pil) visas vid högre förstoring att skildra dess storlek i förhållande till nätet."_blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Imaging kammare montering tillverkad av petriskålar. (A) Visas är en kommersiell glasskiva glas botten petriskål med ett plastnät fäst glastäckglas. (B) Visas egentillverkade petriskål kammare med ett hål borrat i locket och en täck fäst från utsidan med silikonfett. Nätet och larven är monterade inne i kammaren som innehåller Tricaine lösning. För att täta kammaren, är silikonfett appliceras på övre, yttre kanten av den undre kammaren och topplocket bifogas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Schema för amputation och montering av en larv för avbildning. (A) för amputation, placera en sövda larv på ett agaros-överdragna petriskål och amputera stjärtfenan med en sprutnål. (B) För montering, överföra larven med en överföringspipett i ett 1,5 ml rör fyllt med 42 ° C flytande agaros och pipet en droppe innehåller larven in i bildkammaren, orientera fisken och täck stelnat agarosen med embryo medium. (C) Skrapa bort agarosen från stjärtfenan använder ett tak microloader pipettspetsen eller liknande verktyg och ersätta embryo medium med färskt medium. (D) Bild stjärtfenan under ett stereomikroskop. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Själv konstruerat uppvärmda inkubation kammaren. (AC) Visas finns en uppvärmd inkubationskammare av papp, bubbelplast och kardborreband. En trådbunden kupol värmare (ursprungligen för hönsägg inkubation) är fäst till kammaren med hjälp aluminiumtejp. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Fin förnyelse dynamik. (A) Scheme av den utnyttjade stjärtfenan amputation analys och kvantifiering metod för att bestämma fin längd (röd pil) och området (röd kontur av fenan). (B) stjärtfenan amputation utlöser initialt kontraktion av fenan, följt av regenerative vävnad utväxt. Fenan genomgår också utvecklings tillväxt, vilket framgår av ökningen i sidled storlek. (C) Visas är den fin längd som en funktion av tiden, avslöjar en linjär regenerativ tillväxt börjar på ~ 14 hpa. (D) Kvantifiering av fenan området avslöjar en initialt minskar i storlek, vilket kan hänföras till kontraktion av fenan. Efter ~ 14 h, fenan storlek ökar med en linjär hastighet. (E) Jämförelse av fenan längd före amputation och efter 36 tim visar ~ 60% återväxt. Skala bar: 100 um Förkortningar: pre-amp, pre-amputation; timmar efter amputation, hpa; regen, regeneration; amp, amputation Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Film . Fin förnyelse under tidsförloppet av 36h. Visas en stjärtfena av en 2,5-dagars gammal larv under regeneration. Från 30 minuter efter amputation regenerativ tillväxt avbildas i 30 min intervaller på ett stereomikroskop med hjälp av en 3,5x objektiv.
Discussion
Denna metod gör det möjligt att observera sårläkning och vävnadsregenerering i levande zebrafisk larver med in vivo tidsförlopp avbildning på en ljusfältsstereo, med hjälp av en jämförelsevis enkel installation. Denna procedur kräver vissa viktiga aspekter som vi har testat, som optimerar resultatet: 1) Låga agaros koncentrationer (~ 0,5%) kommer att minimera tillväxthinder i ständigt växande larver zebrafisk, 2) Borttagning av agarosen runt fenan är viktigt att inte skymma läkningsprocessen, 3) Svällning agarosen i en plastmask behåller agaros och djur i ett stabilt läge under hela förfarandet, och 4) En riktig temperaturkontrollerad miljö, vilket är viktigt för larv livskraft. Vi har anpassat en uppvärmd inkubationskammare 23,24, som använder bubbelplast som är tejpad på kartong och en trådbunden kupol värmare för att kontrollera temperaturen och ordentlig luftcirkulation med minimala fluktuationer underavbildningsproceduren. Denna enkla och kostnadseffektiva kammare kan framställas för att passa alla mikroskop. En liknande uppvärmd inkubationskammare har också använts för avbildning möss och chick utveckling 24,29.
Vi föreslår att pre-amputerade larver är monterade för en pre-amputation bild, demonterades för amputation, och återmonteras för time-lapse avbildning. Även om det är möjligt att utföra dessa steg i ett enda steg i den slutliga bildkammaren, i vår erfarenhet som vi fann att amputera stjärtfenan på ett täckglas är inte optimalt, eftersom det sliter vävnaden och inte resulterar i ett rent snitt. Agarosen baserade amputation metod med användning av en sprutnål ursprungligen beskrivits av Kawakami och kollegor (2004) 16 och är också, enligt vår erfarenhet, idealisk för att utföra amputationer. Således är det ganska komplicerad serie steg som vi presenterade väl motiverad och säkerställer en optimal regenere utfall.
Vi visade att larval zebrafisk vid 2 dpf kan avbildas upp till 1,5 dagar i agaros och Tricaine lösning. Vi pH-optimerade Tricaine (pH 7) lösning framställd med Instant Ocean salt, vilket inte stör den förlaga hälsa för presenterade bildperioden används. Vi har tidigare dock också visat att användning av Tricaine i Danieau medel tillåter tidsförlopp avbildning av 2,5 dpf larvzebrafisk på en konfokalmikroskop i minst 2 dagar 30. Således kan optimala buffertbetingelser förlänga larv hälsa och längden på avbildning. Alternativt kan lägre Tricaine koncentrationer användas för anestesi, eller 2-fenoxietanol, som vi hittade tolereras väl under larv och vuxenstadier vid 28 ° C under minst 60 timmar.
För att undvika fel i fin förnyelse, vi bort agarosen från stjärtfenan innan avbildning. Våra data visar att inom 1,5 dagar fenan har regener till ca 60%. Denna regenerehastigheten överensstämmer med en tidigare studie som definierar tre dagar is en genomsnittlig tid för stjärtfenan förnyelse i zebrafisk larver upp till 6 dpf 16. Alternativa metoder till agaros skulle emellertid kunna utnyttjas för att montera fisken för avbildning. Till exempel, koagulerar tunn plasma 31 eller fluorerad etylen (FEP) rör belagda med metylcellulosa och fyllda med mycket låga agaros koncentrationer (0,1%) har rekommenderats för ljus plåt mikroskopi 32 och kan vara lämpliga för vår presenterade metoden. Men vi rekommenderar inte metylcellulosa och 0,1% agaros, eftersom de kräver att provet är monterade i botten av kammaren på grund av bristen på solidifiering av dessa medier. Mycket höga halter av metylcellulosa kommer dessutom att generera luftfickor baserat på vår erfarenhet, och dessa kan störa avbildning förfarande. Om dessa medier föredrages med användning av bottenkammaren, är det viktigt att en lämplig arbetsavstånd mellan objektivlinsen och preparatet är närvarande. Det bör noteras att metylcellulosa som ett monteringsmedium rekommenderas endast för upp till 1 dag, eftersom det kan störa larver hälsa 32.
Montering förlagan i locket kan resultera i en långsam gravitationsnedåtglidning. Det rekommenderas därför att avbilda flera sektioner vid varje tidpunkt, som antingen kan projiceras i en enda plan eller bara bilder i fokalplanet kan extraheras för montering av färdiga filmen. Imaging preparatet i botten kammaren skulle kunna vara ett alternativ metod för att undvika potentiell nedåtglidning. Plasmaproppar kan vara användbart för att undvika avdrift, eftersom plasman fastnar på yttre omslutande skikt (EVL, periderm) 31 och därför kan stabilisera preparatet. Detta måste dock testas, samt hur länge larver zebrafisk kan hållas i plasmaproppar utan att störa larver hälsa eller fin förnyelse.
Vår film monterades utnyttjar enskilda avsnitten (26 nm)av en inspelad z-stack, vilket omfattade hela tjockleken på fenan (~ 10 mikrometer) och som stod för potentiell z-drift av fenan under avbildningsförfarandet. För att behålla 3-D-information, är det även möjligt att projicera z-stackar i enstaka bilder. Eftersom detta kan resultera i oskärpa i bilden, kan bright deconvolution önska. Programvara, såsom Deconvolve eller Autoquant X3 skulle kunna utnyttjas för detta ändamål. Alternativt kan matematiska algoritmer (beskrivna i Tadrous 33) appliceras för att erhålla en punkt-spridningsfunktion av högt signal-till-brusförhållande (SNR). Skaffa en hög SNR representerar en av de största hindren i bright deconvolution. Även om denna metod kräver hög kontrast och tunn provtjockleken, skulle det vara lämpligt för avbildning av stjärtfenan på grund av dess reducerade bredd.
En klar fördel med den presenterade avbildningsmetod är att det är snabbt anpassningsbar till alla stereomikroskop utrustat med en CCD-kamera ettd tidsförlopp mjukvara och erbjuder ett prisvärt alternativ till dyrare konfokala bildsystem. Även om denna metod inte utnyttjar fluorescens för celldetektering, kan den förlängas för sådana tillämpningar genom att utnyttja ett automatiserat system för slutarkontroll och efterbild deconvolution programvara 34. Detta skulle göra det möjligt för användare att ytterligare följa sårläkning och regenereringsprocesser med enstaka cell eller subcellulär upplösning över längre tidsperioder.
Den optiska klarhet och lätthet med vilken embryonala och larvzebrafisk kan hanteras, och anpassningsförmåga denna metod till varje stereomikroskop gör den lämplig för undervisning grundläggande ryggradsdjur biologi i ett klassrum. Denna metod kan ge studenterna en bättre förståelse av de grundläggande biologiska processer som ligger bakom vävnad reparation och förnyelse. Andra biologiska processer som har tagits med en liknande metod är zebrafisk embryonal utveckling 23,34 och hjärtfunktion (opublicerad). Denna metod erbjuder också möjligheten för uppföljning sårläkning och regenerering i larver som har blivit genetiskt och farmakologiskt manipuleras.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Bullseye Agarose | MidSci | BE-GCA500 | |
| Low-melt agarose | Fisher BioReagents | BP1360-100 | |
| 1-phenyl-2-thiourea | Alfa Aesar | L06690 | |
| Instant Ocean Aquarium Salt | Pet store | ||
| Methylene Blue (0.1% solution) | Sigma | M9140 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10505 | |
| 2-Phenoxyethanol | Sigma-Aldrich | 77699 | |
| Petri Dish 35 x 15 mm | BD Falcon | 351008 | |
| Petri Dish 60 x 15 mm | BD Falcon | 351007 | |
| Petri Dish 100 x 25 mm | BD Falcon | 351013 | |
| 5.75 inch boroschillate glass pipets | Fisher | ||
| 35 mm Glass Top Glass Bottom Dish (Glass: 0.085-0.115mm) | MatTek Corporation | D35-20-0-TOP | |
| Superfrost/Plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Glass coverslips | Electron Microscopy Services | 72191-75 | |
| Glass coverslips | Warner Instruments | CS-18R15 | |
| Phifer Phiferglass Insect Screen Charcoal - 48" | Home Depot | ||
| High vacuum grease | Dow Corning | ||
| Microloader pipette tips 20 µl | Eppendorf | 930001007 | |
| Fine Scissors - Sharply Angled Up | Fine Science Tools | 14037-10 | |
| 3 ml Luer-Lok™ disposable syringe | BD | 309657 | |
| 60 ml Luer-Lok™ disposable syringe | BD | 309653 | |
| 23 G syringe needles | BD | 305145 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Equipment | |||
| LabDoctor Mini Dry Bath | MidSci | ||
| Discovery.V12 compound microscope | Zeiss | ||
| Plan Apo S 3.5X objective | Zeiss | ||
| AxioCam MRm | Zeiss | ||
| Axiovision software, Release 4.8.2SP1 (12-2011) | Zeiss | ||
References
- San Miguel-Ruiz, J. E., García-Arrarás, J. E. Common cellular events occur during wound healing and organ regeneration in the sea cucumber Holothuria glaberrima. BMC Dev Biol. 7, 115 (2007).
- Poss, K. D., Keating, M. T., Nechiporuk, A. Tales of regeneration in zebrafish. Dev Dyn. 226, 202-210 (2003).
- Akimenko, M. A., Marí-Beffa, M., Becerra, J., Old Géraudie, J. Old questions, new tools, and some answers to the mystery of fin regeneration. Dev Dyn. 226, 190-201 (2003).
- Slack, J. M. Regeneration research today. Dev Dyn. 226, 162-166 (2003).
- Seifert, A. W., et al. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys). Nature. 489, 561-565 (2012).
- Goss, R. J., Grimes, L. N. Epidermal downgrowths in regenerating rabbit ear holes. J Morphol. 146, 533-542 (1975).
- Williams-Boyce, P. K., Daniel, J. C. Comparison of ear tissue regeneration in mammals. J Anat. 149, 55-63 (1986).
- Allan, C. H., et al. Tissue response and Msx1 expression after human fetal digit tip amputation in vitro. Wound Repair Regen. 14, 398-404 (2006).
- Borgens, R. B. Mice regrow the tips of their foretoes. Science. 217, 747-750 (1982).
- Han, M., Yang, X., Lee, J., Allan, C. H., Muneoka, K. Development and regeneration of the neonatal digit tip in mice. Dev Biol. 315, 125-135 (2008).
- Muneoka, K., Allan, C. H., Yang, X., Lee, J., Han, M. Mammalian regeneration and regenerative medicine. Birth Defects Res C Embryo Today. 84, 265-280 (2008).
- Takeo, M., et al. Wnt activation in nail epithelium couples nail growth to digit regeneration. Nature. 499, 228-232 (2013).
- Akimenko, M. A., Johnson, S. L., Westerfield, M., Ekker, M. Differential induction of four msx homeobox genes during fin development and regeneration in zebrafish. Development. 121, 347-357 (1995).
- Reginelli, A. D., Wang, Y. Q., Sassoon, D., Muneoka, K. Digit tip regeneration correlates with regions of Msx1 (Hox 7) expression in fetal and newborn mice. Development. 121, 1065-1076 (1995).
- Brien, G. S., et al. Coordinate development of skin cells and cutaneous sensory axons in zebrafish. Journal of Comparative Neurology. 520, 816-831 (2012).
- Kawakami, A., Fukazawa, T., Takeda, H. Early fin primordia of zebrafish larvae regenerate by a similar growth control mechanism with adult regeneration. Dev Dyn. 231, 693-699 (2004).
- Yoshinari, N., Ishida, T., Kudo, A., Kawakami, A. Gene expression and functional analysis of zebrafish larval fin fold regeneration. Dev Biol. 325, 71-81 (2009).
- Westerfield, M. The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio). , 4th, Univ of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Detrich, H. W., Westerfield, M., Zon, L. I. The Zebrafish: Cellular and Developmental Biology, part A. Preface. Methods Cell Biol. 100 (13), (2010).
- Dahm, N. -V. a Zebrafish: A Practical Approach, Issue 975. , reprint, Oxford University Press. 303 (2002).
- The Zebrafish: 2nd Edition Genetics, Genomics and Informatics. Detrich, H., Westerfield, M., Zon, L. , 2nd, (2005).
- Concha, M. L., Adams, R. J. Oriented cell divisions and cellular morphogenesis in the zebrafish gastrula and neurula: a time-lapse analysis. Development. 125, 983-994 (1998).
- Distel, M., Köster, R. W. In vivo time-lapse imaging of zebrafish embryonic development. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Kulesa, P. M., Kasemeier-Kulesa, J. C. Construction of a Heated Incubation Chamber around a Microscope Stage for Time-Lapse Imaging. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Bitplane. Imaris V 6.1.0 Reference Manual. , (2008).
- Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. , Biophotonics International. 36-42 (2004).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9, 676-682 (2012).
- Mateus, R., et al. In vivo cell and tissue dynamics underlying zebrafish fin fold regeneration. PLoS One. 7, e51766 (2012).
- Jones, E. A., et al. et al.Dynamic in vivo imaging of postimplantation mammalian embryos using whole embryo culture. Genesis. 34, 228-235 (2002).
- Rieger, S., Senghaas, N., Walch, A., Köster, R. W. Cadherin-2 controls directional chain migration of cerebellar granule neurons. PLoS Biol. 7, e1000240 (2009).
- Langenberg, T., Brand, M., Cooper, M. S. Imaging brain development and organogenesis in zebrafish using immobilized embryonic explants. Dev Dyn. 228, 464-474 (2003).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139, 3242-3247 (2012).
- Tadrous, P. J. A method of PSF generation for 3D brightfield deconvolution. J Microsc. 237, 192-199 (2010).
- Distel, M., Babaryka, A., Köster, R. W. Multicolor in vivo time-lapse imaging at cellular resolution by stereomicroscopy. Dev Dyn. 235, 1100-1106 (2006).
