Summary
Bu protokolün amacı floresans ile aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) kullanılarak insan lenfatik malformasyon kiste benzer damarları ve derisini astar lenfatik endotel hücreleri izole etmektir. Daha sonra hücre kültürü ve bu hücrelerin genişlemesi, genetik proteomik, işlevsel ve hücre farklılaşması çalışmaları için deney sofistike yeni bir düzeyde izin verir.
Abstract
Primer lenfödem, lenf malformasyonlar ve lenfatik tümörler gibi lenfatik sistem bozuklukları önemli morbidite nedeni ama az onların biyoloji hakkında bilinen nadir durumlardır. Hastalıklı ve sağlıklı dokudan son derece saf insan lenfatik endotel hücreleri (LECS) Ayırma, genetik, moleküler ve hücresel düzeyde lenfatik endotel çalışmalarını kolaylaştıracaktır. Bu araştırmalar, bu durumların klinik yönetimi değişebilir yeni tedaviler için hedefler ortaya çıkarabilir tahmin edilmektedir. LECS ve lenfatik malformasyon lenfatik endotel hücreleri (LM LECS) sünnet derisi insan izolasyonunu açıklayan bir protokol sunulmuştur. Elde etmek için tek bir hücre süspansiyonu dokusu kıyılmış ve enzimatik dispase II ve kollajenaz II kullanılarak tedavi edildi. Elde edilen tek bir hücre süspansiyonu daha sonra farklılaşması (CD) belirteçleri CD34, CD31, Vasküler Endotelyal Büyüme Faktörü-3 (VEGFR-3) ve podoplanin kümelenmesinde antikorlar ile işaretlenmiştir. Stained canlı hücreler diğer endotelyal ve non-endotel hücrelerinden CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LM LEC nüfusu ayırmak için bir floresan aktif hücre sıralayıcı (FACS) üzerinde sıralanır. kriteri LM LECS kültüre ve daha deneysel kullanım için fibronektin kaplı şişeler üzerinde genişletti.
Introduction
Lenfatik damar sisteminin önemli bir fonksiyonu, lenf, lipidler, proteinler ve hücre bileşenleri içeren bir aşırı interstisyel sıvı emer ve kan venöz sisteme yapmaktır. Lenfatik kapilerlerin bir ağ yabancı antijenlere immün gözetim ve yabancı antijenleri nötralize etmek için beyaz kan hücrelerinin dağıtım önemli bir işlem varlığı için taranmıştır lenf düğümlerine lenf yönlendirir.
tek yönlü lenfatik sistem ilk lenfatik kılcal lenf girişini 1,2 izin özelleşmiş hücre kavşaklar ince duvarlı düz endotel hücreleri süreksiz tek tabaka ile benzersiz bir yapıya sahip dokularda başlar. Bu kılcal artan interstisyel basınç 3 mevcudiyetinde damar çökmesini engellemek için filamanların ankraj ile komşu bağ dokusu matrise bağlıdır. lenfatik kılcal toplama içine boş ilk lenfatik kılcalO büyük lenfatik damarların veya damarlar içine birleşerek. Karşılaştırıldığında lenf damarları daha kalın kap duvarları, ikili lenf valfleri olan ve bir kaç düz kas hücreleri, 4 gömülü olduğu bir süreksiz bir temel zar ile kapatılmış olan toplama lenf kılcal damarlar başlangıç. Düz kas hücrelerinin koordineli açılması ve lenfatik valf kapağı ve daralma lenf 3 akışını kolaylaştırır. Torasik kanal ve sağ lenfatik kanal: İnsanlarda, vücudun çeşitli bölgelerinden lenfatik damarlar iki lenfatik kanallar oluşturacak şekilde birleştirmek lenfatik gövdelerine oluşturmak için katılın. Torasik kanal göğüs altında vücudun sol tarafında ve sağ taraftan lenf drene olurken, baş, boyun ve toraks sağ kol ve sağ taraftan sağ lenfatik kanal drene lenf. Her iki kanallar boyun 5 subklavyen damarlar içine lenf yapıyoruz.
Lenfatik sistem bozuklukları geniş edinilen a halinde gruplandırılmışnd, konjenital (Tablo 1). Edinilen durumların örnekleri lenfanjit ve ikincil lenfödem vardır. Lenfanjit bakteriyel enfeksiyona lenfatik damar iltihabıdır. Etkilenen lenfatikler dilate ve eksuda içeren polimorfonükleer hücreleri ile doldurun. Deride, bu lenf sıklıkla ilişkili lenf düğümüne (lenfadenit) 6 genişlemesi ile birlikte, kırmızı, ağrılı deri altı çizgiler olarak görünür. İkincil lenfödem lenfatik damar veya lenf nodu tıkanıklığı hasar veya tıkanma sonucu olarak ortaya çıkar. Bu hasar veya tıkanma lenf distalinde birikimi kronik ilerleyici şişme yol açar. Gelişmiş ülkelerde, sekonder lenfödem en yaygın metastaz tümörlerin lenf damarlarına veya bölgesel lenf nodları engel ya da anti-kanser tedavisinin bir sonucu olarak, lenf düğümleri, radyasyon sonrası fibroz ve post-enflamatuar trombositemili cerrahi olarak çıkarılması, aşağıdaki habislik ile bağlantılı olanBosis ve skar 7. Dünyanın diğer bölgelerinde, ikincil lenfödem gibi Wuchereria bancrofti 6 olarak parazitik kurtlar neden lenfatik obstrüksiyona sekonder olabilir.
| Lenfatik damar sistemi bozuklukları, | |||
| Edinilen | Doğuştan | ||
| Lenfadenit İkincil lenfödem | İlköğretim Lenfödem 10 | Sporadik Lenfatik Malformasyonlari 13 | Sendromları 13 Lenfatik malformasyonlar İlişkili |
| örneğin Milroy Sendromu Meige Sendromu | Basit: Lenfatik malformasyonlar | örneğin Klippel-Tranaunay Sendromu Parklar Weber Sendromu Sturge-Weber Sendromu | |
| Kombine: Kılcal-lenfatik malformasyonlar Kılcal-lenfatik-venöz malformasyon Kılcal-lenfatik-arteriyovenöz malformasyon Kılcal-lenfatik venöz-arteriyovenöz malformasyon | |||
Lenfatik damar sistemi hastalıklarının Tablo 1. Genel Bakış.
Lenfatik sistemin konjenital hastalıklar, genetik mutasyonlar, lenfanjiektazi ve lenfatik sistem 8,9 anomalileri neden olduğu düşünülen birincil (idiopatik) lenfödem sayılabilir. Birincil lenfödem muhtemelen de novo mutasyonlar sonucu oluşan veya miras sporadik olabilir. Lenfatik bozukluklar ayrıca izole edilmiş olabilir ya da daha genel bir sendrom 10 bir kısmını ihtiva edebilir. Lenf pediatrik popülasyonda% 97ödem bölgesel lenf drenajı 11 bozan lenfatik damar yapısında anormallikler sporadik. Milroy hastalığı doğumda belirgin ya da kısa bir süre sonra 12 VEGFR-3 genindeki mutasyon neden birincil lenfödem bir örnektir. Çoğunlukla ailesel durumda olmasına rağmen, Milroy hastalığı da Milroy hastalığının 32 aile öyküsü olmayan bebeklerde tespit edilebilir. Herhangi bir lenfödem şiddeti lenf üretimi ve venöz dolaşımı 6 lenf geri taşıma yeteneği miktarına bağlıdır.
Klinik bulgular ve yerinde endotel hücre çoğalmasında dayanarak, lenfatik sistemin anomalileri lenfatik tümörler veya lenfatik malformasyon 13 olarak sınıflandırılır. Kaposiform lenfanjiomatozis bir LEC tümör 14 örneğidir. Lenfatik malformasyonlar embriyonik gelişim sırasında ortaya çıkan ve çocuğa 15,16 oranında büyümeye düşünülmektedir. Onlar nadiren gerileme ama remai edebilirsinizn asemptomatik travma veya enfeksiyon klinik komplikasyonlara yol açan hızlı büyüme çöker kadar. Yukarıda tarif edilen venöz dolaşıma dokudan lenfatik ağ ve lenf iletiminin düzenli yapısı lenfatik sıvı ile dolu kistik anormal yapılar lokalize koleksiyonları oluşan lenfatik malformasyon olarak tedirgin olduğunu. Bu kistik gemiler de fonksiyonel lenfatik vanaları içeren lenfatik dolaşıma bağlı veya olduğunu hiçbir klinik veya deneysel kanıtlar olsa da, onların lenfatik kimlik gibi podoplanin, CD31, Lenf Gemi Endotel Reseptör 1 olarak lenfatik hücre belirteçleri aralığının ifadesi tarafından onaylandıktan (LYVE-1), Prospero homeobox protein 1 (PROX-1) ve VEGFR-3 15,17,18. Bu kistik yapılar, ya küçük (mikrokistik) veya büyük (makrokistik) olabilir, ama en lenfatik malformasyonlar mikrokistik ve makrokistik bileşenleri (Şekil 1) 16 her ikisini de içerir. Ameliyat sonrasında, injection skleroterapi ve / veya radyofrekans lenfatik malformasyonlar genellikle yeniden ortaya çıkması ablasyona.
İnsan lenfatik damarların ve lenfatik malformasyonlar Şekil 1. Morfoloji. Normal insan lenfatik (A) ve podoplanin antikor ile etiketlenmiş lenfatik malformasyon damarları (B ve C) (kahverengi etiket, ok). İnsan lenfatik malformasyon damarları belirgin dilatasyon ve lümen boyutu önemli değişim ile karakterizedir. Bu lokalize anormal kistik yapıları küçük (mikrokistik, *) (B), ya da büyük (makrokistik, #) (C) olabilir. En lenfatik malformasyonlar hem mikrokistik ve makrokistik bileşenleri içerir. rakamın büyük halini görmek için tıklayınız. </ P>
Bazı araştırmacılar lenfatik malformasyonlar LECS anormal büyüme potansiyeli yok ama onun yerine, normal dolaşıma 19 bağlamak için başarısız olan lenfatik damar gelişimsel bozukluğu temsil ileri sürmüşlerdir. Bununla birlikte, LM LECS hızlı çoğalan ve LECS 15 LM LECS bir defekt olduğunu düşündürmektedir sünnet daha apoptoza karşı daha dirençli olduklarını bulduk. LM LECS fare ksenograft modelinde implante edilir, bunlar lenfatik malformasyon 15 hatırlatan yapılar oluştururlar. Bu lenfatik malformasyonlar, fetal gelişim sırasında LM LECS doğan bir veya daha fazla somatik mutasyonlar neden olabilir bir hipotezini desteklemektedir. Gerçekten, son raporlar fosfoinositid 3-kinaz (PIK3CA) geni 20 p110α katalitik alt birim bu tür bir mutasyon tespit ettik.
DNA dizileme teknolojisinin, ilgili mutasyonlar c gelişmeler göz önüne alındığındaOuld daha kolay bu durumların gelecekteki çalışmalara rehberlik, izole LM LECS tanımlanabilir. canlı LECS izolasyonu azalmış besin durumunu veya pro-apoptotik ajanları 15 tepki olarak bu hareketi, çoğalması, tüp oluşturma yeteneği ve hayatta kalma gibi tahlillerde anormal ve normal LECS arasında karşılaştırmalar kolaylaştıracaktır. İzole LECS daha yeni LEC alt popülasyonlarını belirginleştiren, hücreye özgü gen ifadesi ve proteomik çalışmalar yapmak için bize izin ve lenfatik malformasyonlar klinik yönetimi için uygun yeni farmakolojik ajanlar keşfetmek istiyorum.
Biz daha önce yenidoğan sünnet derisi ve lenfatik malformasyonlar 15 den LECS manyetik boncuk ayrılması dayalı bir LEC izolasyon yöntemi yayınladık. Bu CD31 pozitif seçime CD34 Neg hücre fraksiyonunun tabi tutarak, ardından CD34 ekspresyonunun bulunmaması, göre, vasküler endotel hücrelerinden normal ve hastalıklı LECS ayrılması için bir strateji bildirilmiştir.Bununla birlikte, bu yöntem artık olmayan endotel hücrelerinin mevcudiyeti ile engellenmiştir. Bu daha sonraki bağ dokusu sindirim öncesinde epidermise kaldırarak bağımsız oldu. Bu kirleticiler genellikle daha hızla çoğaldı ve böylece sonunda LEC izolasyon tekrarlamak sonraki girişimlerine rağmen endotel hücre kültürleri overgrew. Gerçekten de,% 5 ile% 2 kadar düşük olmayan endotel hücrelerinin bir başlangıç kirlenmesi LEC nüfusu 15 bastırmak için yeterli olmuştur. Bu LEC hücre verim ve saflık geliştirmek için bir seçenek olarak floresan aktif hücre sıralama yöntemi keşfetmek için bize istenir. Buna ek olarak, CD34, CD31 Düşük Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Sıra LECS tespit etmek seçim markörleri için VEGFR-3 ve podoplanin ilave LEC popülasyonlarının özgüllüğünü geliştirmek için sıralama çok parametre kullanılmıştır.
Bu belirteçler seçme gerekçesi raporlarına dayandığını LECS ve kan vasküler endotelyal ce iseKan, vasküler endotel hücrelerinin 21-23 ile karşılaştırıldığında LLS örneğin CD31 gibi ortak bir çok hücre yüzeyi işaretçileri vardır LECS CD34, podoplanin ve VEGFR-3 hücre yüzeyi marker salgılamasında fenotipik değişim gösterir. CD31 aynı zamanda trombosit endotel hücre adhezyon molekülü 1 (PECAM-1) olarak bilinen bir 130 kDa transmembran glikoproteindir. Bu kan ve lenf damarlarının 21,24,25 her türlü ifade çünkü bir pan-endotelyal hücre belirteci olarak kabul edilir. CD34 en hematopoietik progenitör hücreler üzerinde 110 kDa transmembran glikoprotein mevcut olması ve hücreler, vasküler endotel hücrelerinin ve lenf damarlarına 26 kaynaklanır.
VEGFR-3, vasküler endotelyal büyüme için alıcı, C ve D faktörleri fare embriyo gelişen damarları başlangıçta mevcut olmakla birlikte, transkripsiyon düzenlenir lenf tarifnamede aşağıdaki gibidir (SOX) -18, Cı Hicken SRY ilişkili HMG-kutusu faktörleri o valbumin u pstream.p. romoter t ranscription f aktör 2 (COUPTF-II) ve PROX-1, VEGFR-3 venöz sentezleme kaybolur ve embriyonik LECS 25,27 sınırlı hale gelir. Podoplanin, 38 kDa zar mukoprotein, ilk fare embriyonik gelişim 28 yaklaşık embriyonik lenfatik damarların gün 11 (~ E11.0) üzerine kaydetti ve şiddetle mikrovasküler lenf damarları, lenf malformasyonlar makrokistik lenfatik endotele göre podoplanin ifade ile ifade edilir iken 15 daha değişkendir. Deneyler en azından bazı CD34 Yüksek CD31 Pos endotel hücreleri lenfatik işaretleyici podoplanin 29 ekspres öneririz Flow sitometri. İnsan lenfatik malformasyonlar LYVE-1 ve podoplanin boyama sistematik değerlendirme hem LYVE-1 ilk lenfatik güçlü mevcut olduğu bildirilmiştir, normal dokularda, lenfatik malformasyon endotelyumu 30 boyama etkili olduğunu göstermesine rağmenkılcal endotel ancak azaltılmış ve toplama lenfatik endotele 31 bile yok. Amacımız izole etmek olduğundan hem biz seçtiniz başlangıç ve toplama lenfatik endotel hücreleri, bizim hücre seçimi stratejisinin bir parçası olarak LYVE-1 kullanmak için değil. Son olarak, bu belirteçler kullanılması kararı da mikroskopik görüntülemesi için lenf damarlarına etiketlenmesi için, teşhis amacıyla kullanılır antikorların mevcudiyeti, akış sitometrisi ve imünoflöresan çalışmalar arasındaki ilişki olanak sağlayabilecek bir özelliği dayanıyordu.
Bu makale sünnet derisi ve lenfatik malformasyon gelen CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos LECS başarılı izolasyonu yanı sıra CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotel hücreleri için gerekli doku sindirim yöntemi, hücre boyama ve FACS ayarlarını anlatacağız dokusu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik bildirimi: lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların toplanması için etik onay Kraliyet Çocuk Hastanesi, Melbourne, Avustralya İnsan Araştırmaları Etik Kurullarının alındı. İmzalı rıza ameliyat öncesinde hastanın ebeveynleri alındı. Doku örnekleri seçmeli sünnet geçiren klinik yönetiminin bir parçası olarak cerrahi girişim geçiren İcracı ve hastaların tanısı olan hastalarda toplandı. Tüm deneyler Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi, Avustralya esaslara uygun olarak yapıldı.
Sünnet derisinin ve Lenfatik Malformasyon Dokular Hücre Süspansiyon 1. Hazırlık
- Tamponlar ve Medya hazırlanması.
- EGM-2 medya ısınma ve yavaşça 37 ° C su banyosunda kit bileşenlerini çözülme piyasada mevcut EGM-2 MV Bullet Kit kullanarak tam endotel hücre ortamı hazırlayın. Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde, aseptikEGM-2 medya her bileşeni ekleyin. Tüm bileşenler ortama ilave edilir, 'tam endotel hücre medya' olarak medyaya bakın. Kullanımdan önce muhtevanın karıştırılması için steril 50 ml pipet kullanın.
Not: hücre kültüründe ilgili tüm adımlar bir sınıf II biyolojik tehlike kabini içinde gerçekleştirilir. Bütün çözeltiler, üreticinin talimatlarına uygun olarak 4 ° C'de muhafaza edilir ve kullanımdan önce, oda sıcaklığına kadar ısıtılır. Tam endotel hücre ortamı, hücre kültürü tampon ve enzim çözeltiler kullanımdan önce 20 dakika boyunca 37 ° C'de ısıtılır. - 50 ng / ml VEGF-C ile birlikte endotel hücre ortamı Supplement. Kullanılana kadar 4 ° C 'de 50 ml steril tüp ve deposuna ilave endotelyal hücre ortamı kısım. 4 ° C'de depolanan ortam, en az 4 hafta süreyle stabildir.
- 8,752 g NaCl, 1.416 gr Na 2 HPO çözülmesiyle kalsiyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS) Hazırlama 4 .2H 2 O veSu 1000 ml 0.395 gr KH 2 PO 4. 7.4'e pH ayarlayın. Filtre 4 ° C'de 0.22 mikron filtre ve mağaza kullanarak PBS sterilize edin. (: 100 1 kullanılan) antibiyotik / antimikotik solüsyon ilave Kullanımdan önce.
- Insan fibronektin hazırlanması steril su, 10 ml fibronektin, 1 mg eritin. Mağaza -20 ° C'de 100 ul hacimde çözüm yeniden. Kullanım gün fibronektin kısım 100 ul steril PBS 10 ml üzerinde (10 ug / ml'lik bir son çalışma konsantrasyonu vermek üzere).
- Enzim ortam için, steril PBS içinde% 0.04 Dispase II,% 0.25 kollajenaz II ve 0.01% DNase I içeren bir solüsyon hazırlanır. İlk olarak, steril bir 50 ml tüp içinde dispaz ve kolajenaz, yer ağırlığı PBS gerekli hacmi ilave edin ve eritmek için, 37 ° C'de çalkalama ile 30 dakika boyunca inkübe edin. Bir kez biyogüvenlik kaput filtre sterilize (0.22 mikron filtre) dispase / kollajenaz çözümü, çözünmüş. Aseptik olarak 37 ° C 'de, DNase I depola kadar enzimatik çözeltisini ekleyinkullanın.
NOT: DNase I steril iyofilleştirilmiş toz halinde temin edilebilen bir ticari bir hücre kültürü dereceli reaktifidir.
- EGM-2 medya ısınma ve yavaşça 37 ° C su banyosunda kit bileşenlerini çözülme piyasada mevcut EGM-2 MV Bullet Kit kullanarak tam endotel hücre ortamı hazırlayın. Sınıf II biyogüvenlik kabini içinde, aseptikEGM-2 medya her bileşeni ekleyin. Tüm bileşenler ortama ilave edilir, 'tam endotel hücre medya' olarak medyaya bakın. Kullanımdan önce muhtevanın karıştırılması için steril 50 ml pipet kullanın.
Üstderi ve Lenfatik malformasyonlarından hücre süspansiyonu 2. Hazırlık
- DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik çözelti 10 ml içeren 50 ml'lik bir tüp tartılır. Bu tüp, doku toplanması için kullanılır.
- Lenfatik malformasyon ve üstderi dokuların cerrahi olarak çıkarılması ardından, aseptik hücre kültürü laboratuvarında buz üzerinde tüp ve transfer doku örneği ekleyin.
- Doku içeren tüp tartılır ve doku ağırlığı hesaplayın. Doku sindirmek için gerekli enzimatik solüsyon hacmini hesaplamak için bu ağırlık kullanın.
- Sınıf II biyogüvenlik kabini, 100 mm doku kültürü kabına doku ve medya aktarmak için steril forseps kullanabilir. Ince ~ 1 mm 3 parçaya doku kıyma steril makas kullanın.
- Aktarım kıyılmış doku medya i ile karıştırılırSteril, DMEM /% 2 antibiyotik antimikotik solüsyon ek bir 10 ml içeren 50 ml'lik bir tüp nGoogle'a. Doku yeniden askıya tersine çevirerek karıştırın. 5 dakika boyunca 300 xg'de örnek santrifüjleyin.
- Süpernatantı. Doku ağırlığı üzerine dayalı olarak, önceden ısıtılmış (37 ° C), kolajenaz II kıyılmış 100 mg doku başına düşen / DNase I / II sindirimi Dispase çözeltisi 1 ml. Genel olarak, kıyılmış dokusunun yaklaşık 1 g enzim çözeltisinin 10 ml kullanımı.
- Sabit 200 rpm'de çalkalayarak 20-90 dakika boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde doku inkübe edin. Bu sürenin sonunda, neredeyse tüm doku ince parçalara sindirilir emin olun.
Not: birincil dokular etkiler, hücre hayatta kalması ile ilgili izolasyon zamanda kolajenaz ve dispase hücrelerin maruz kalma. Biz fibrotik lenfatik malformasyon örnekleri sindirim 60-90 dk gerektirebilir oysa çoğu yenidoğan sünnet derisi örnekleri optimal sindirim 20-30 dk gerektiren deneysel bulduk. LM LEC verims Mevcut fibrozis miktarı etkilenir, daha fibröz doku muhtemelen kolajenaz II ve dispase II uzun süre maruz kalmanın zararlı etkilerine daha az hücre elde edilmiştir. - Sindirme işlemini takiben, biyo-güvenlik kabinine tüp transferi ve steril bir 50 ml tüp içine yerleştirilmiş, bir 70 mikron süzgecinden Sindirilmiş doku çözeltisi geçmektedir. Hücre dışı matriks sadece küçük izleri gözlenmektedir kadar lastik piston ile 3 ml şırınga pistonu kullanarak, kalan doku eziyet.
- Elekten geçirilmesi ve enzimleri inaktive yapışmış hücreler geri enzim orta ayrışan hacmine endotel hücre ortamı eşdeğer bir hacmi ile hücre süzgecinden yıkayın. Örneğin, kıyılmış doku sindirmek için enzim orta ayrışan 2 ml için, enzimleri inaktive endotel hücre orta 2 ml ekleyin.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de hücre çözümü Santrifüj ve süpernatant aspire. R> 10 ml PBS hücreler, e-askıya. 300 xg'de Santrifüj hücreleri5 dakika boyunca, daha sonra iki kez hücre yıkama tekrarlayın süpernatant kaldırmak. > Endotel hücre ortamının 20 ml hücre pelletini. Tripan mavisi daha sonra, tohum ile hücre sayımı, 2 x 10> 150 cm 6 hücre> 2 şişeye endotel hücre ortamının 20 ml lik bir nihai hacim içinde, fibronektin ile önceden kaplanmış. Nemlendirilmiş kuluçka makinesi içinde% 5 CO> 2 37 ° C 'de kültür.>
Not: Bu, tripan mavisi eksklüzyonu ile tahmin edildiği üzere çekirdekli hücrelerin% 75 -90% Doku sindirimi hayatta beklenmektedir. Başlangıç hücre sayısı, hücre süspansiyonu içinde tüm çekirdekli hücreleri (yani keratinositler, lökositlerin, makrofajların, bağ dokusu hücreleri ve kan daman hücrelerinin) yansıtır. 5-7 gün hücre sayımı, ekli atlattı ve hücre kültürü sırasında çoğaldı hücreleri yansıtır. Fibronektin ile doku kültürü şişeleri Kaplama ayrıca müteakip LEC ve LM LEC sağkalım geliştirir. - Gece boyunca inkübasyondan sonra, P ile üç yıkamadan uzak bağlanmamış hücreleri yıkamakBS /% 1 antibiyotik-antimikotik çözelti ve taze endotel hücre ortamı ilave edin. Etkin bir şişede bulunan bağlanmamış hücreleri ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için üç yıkar yürütmek. Her ikinci gün medya değiştirin. Hücreler 5-7 gün sonra ~% 80 konfluent olacaktır.
Akım Sitometrisi için Lenfatik Endotel Hücre Yüzey markerleri Hücreleri 3. Antikor Boyama
- Hücreler PBS ile% 80 izdiham, aspire orta ve durulama hücrelerini ulaşmıştır sonra.
- Örneğin 150 cm, 37 ° C'de 5-7 dakika boyunca 2 şişesi başına Accutase hücre ayrılma çözeltisi 7 ml ile inkübe edilmesi ile yapışmayan hücreler ayırın.
- Hasat Ayrılan hücreler, endotelyal hücre ortamının 3 hacim ilave edilerek hücre kopması çözeltisi inaktive ve yeni bir steril tüpe hücre süspansiyonu aktarın.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de hücreleri santrifüjleyin.
- Süpernatant aspire ve PBS 5 ml hücreleri yeniden askıya. 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri, s kaldırmakupernatant daha sonra hücre yıkama tekrarlayın. PBS 5 ml hücrelerin yeniden askıya.
- Canlı hücre sayısını. % 0.4 tripan mavisi 90 ul hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın. Bu süspansiyonun Transferi 10 ul sayım için hemasitometre.
NOT: Nihai hücre verimi işlenmiş örneklem büyüklüğü bağlıdır. canlı hücreler 7 x 10 5-1,2 x 10 6 150 cm2 şişeye aralıkları her zamanki hücre verimi. - Hücre boyama antikor çözeltileri hazırlanır.
Not: Aşağıdaki seyreltmeler 100 ul'lik bir boyama hacminde 1 x 10 6 lekeleme için titre edildi.- Seyreltik PE konjuge fare anti insan VEGFR-3 (01:50); PE-Cy7 konjüge fare anti insan konjuge CD34 (1: 200); APC-konjuge fare anti-insan CD31 (1: 100) ve Alexa 488-konjüge sıçan anti insan podoplanin (1: 200), 100 ul, doku numune başına steril% 5 FBS / PBS solüsyonu, toplam hacim içinde. Hazırlanması aşağıdakıAntikor çözeltisi, kullanılana kadar buz üzerinde tutun. Aynı şekilde kapılar akış sitometrisi ayarını kolaylaştıracak seyreltilmiş izotip kontrol antikor karışımı hazırlandı.
- Antikorların bağlanma, spesifik olmayan azaltmak için, santrifüj hücreler 2 dakika boyunca 300 x g'de, yüzer madde daha sonra steril bir% 5 FBS / numune başına PBS çözeltisi lekeli 100 ul hücrelerin süspansiyonu çıkarın. 4 ° C'de 20 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri.
- 5 dakika boyunca 300 xg'de Santrifüj hücreleri, konjuge antikor kokteyli hücreleri askıya sonra yeniden süpernatant kaldırmak. Ayrıca 100 ul izotip kontrol antikor karışımı hücreleri (1 x 10 5) daha küçük bir kısım leke. 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe hücreleri.
- , Bağlanmamış antikor kaldırmak 5 dakika boyunca 300 xg'de FBS / PBS çözüme ve Santrifüj hücreleri% 2 2 ml ekleyin. Süpernatantı aspire ve yıkama tekrarlayın.
- Izotip kontrolü ve antikor lekeli örnek hücre pelletini / ml propidyum io 0.5 mg 300 ul sıralanacakdide /% 2 FBS / PBS solüsyonu. Sıralama kadar buz üzerinde tüpler yerleştirin.
4. Hücre Ayırma
- Cihazı kurmak için aşağıdaki malzemeleri kullanın; örneğin Accudrop flüoresan boncuklar gibi ticari olarak temin edilebilen, floresan parçacıkların, fosfat-tamponlu tuzlu su bazlı kılıf sıvısı ve bırakma geciktirme boncuklar gibi hizalama boncuklar.
- Çok parametreli floresans ile aktive edilen hücre tasnif cihazı üzerinde saflaştırılmış insan LECS izole edin. Cihazı Kurma ve üreticinin önerilerine göre hizalayın. Buna ek olarak, tazminat matris oluşturmak için her tür tek leke tazminat kontrolleri çalıştırmak ve böylece bu tür PE-Cy kanal içine PE olarak fluorochromes emisyon yoluyla önemli kanama ortadan kaldırmak için.
NOT: 100 mikron nozul kullanılır ve hücreler endotel hücre ortama sıralanır eğer hücreler sıralanmış FACS daha yüksek bir oranda izolasyon hayatta.
5. Hücre Kültürü Mesaj FACS sıralaing
- 5 dakika boyunca 300 xg'de sıralama, santrifüj hücreleri ardından. Süpernatantı aspire ve (hücrenin tohum için kullanılan balonun bağlı olarak) medya 5-10 ml hücreleri tekrar süspansiyon. En az 50.000 hücre kriteri ise, hücreler fibronektin kaplı 25 cm2 şişeye kültürlenmiştir.
- Aksi takdirde, kültür% 5 CO2, hava ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 37 ° C'de 75 cm2 fibronektin kaplı şişede hücreleri. 2 gün sonra ortam değiştirin.
NOT: Ortam değişiklikleri arasındaki süreyi uzatmak olmayan endotel hücrelerinin hayatta lehine görünüyor çünkü Hücre ortamı her ikinci gün değiştirilir. Hücreler daha fazla genişleme 15 ilk bölünmüş zaman PROX-1, VEGFR-3, podoplanin, CD34 ve CD31: Biz belirteçlerin immünohistokimyasal algılama kullanarak lenfatik endotel hücre fenotipi doğrulamak.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Başlangıç Doku sindirimi takiben, bölünmemiş örneklerin kültür 24 saat sonra, ayrı bir endotel hücre kolonileri bir araya fibroblast benzeri hücreler ve yumuşak kas hücreleri (Şekil 2A) gözlenebilir. Izlenerek ayırma ve hücre kültüründe 24 saat sonra CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Sıra hücreleri ekleyin ve tipik arnavut morfolojisi (Şekil 2B ve C) göstermektedir. Yukarıda tarif edilen FACS yöntemi kullanarak, biz CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos endotel hücreleri onları% 99.8 saflık hücreleri kadar arındırmak ve ayırt edebiliyoruz. Strateji yolluk ve Şekil 3'te sunulmuştur sıralama Temsilcisi sonuçları. Bu konular manyetik boncuk izolasyon yöntemini kullanırken yaşadı karar vermiştir. Bugüne kadar, biz LM LECS ve LEC üstderi, bu geçişten sonra geçiş 13'e kadar bu hücreler geçişli vars morfolojik değişiklikler ve düşük hücre bölünmesi eşliğinde yaşlanma başlar.
Şekil 2. Üstderi LECS ve LM-LEC. Yirmi dört saat sonra, enzimatik sindirim, sıralanmamış endotelial hücrelere (ok) ve non-endotelyal hücreler (A), her ikisini de içerir. CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos FACS hücre izolasyonu takiben, LECS (B) ve LM-LECS (C) sünnet olmayan endotel hücreleri yoksun ve Arnavut kaldırımlı morfolojisi korumak. rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .
Hücre vasküler sıralama ve lenfatik endotel hücre için yolluk stratejileri sıralama Şekil 3. Floresan aktive hücres. (A), canlı hücreler, sırasıyla birinci VEGFR-3 ve podoplanin gating sıralamak vasküler (B) ve lenfatik endotel (C) hücreleri ile, CD34 ve CD31 ekspresyonu üzerindeki kapı takip edilir. >% 98 vasküler endotelyal hücre fenotipi sıralanmış CD34 Yüksek CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos hücreleri gösterir (D) Yeniden analizi. CD34 Düşük CD31 Pos VEGFR-3 Pos podoplanin Pos fenotip sıralanır (E) LEC hücreler de>% 98 saf bulunmaktadır. rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
LECS sıvı homeostazı, yabancı antijenler ve emilim ve bazı besin taşımaya bağışıklık karşılığının muhafaza edilmesinde önemli bir rol oynamaktadır. LEC homeostazı, örneğin bakteriyel enfeksiyonlar ve tümör metastazı gibi hastalık süreçlerinde etkilenebilir fakat LECS etkilenen hastalar için işlevsiz lenfatik damarların oluşumu ve önemli hastalıklara yol açtığı somatik mutasyonlara gelişebilir. In vivo implantasyonu ve ex vivo deney yoluyla lenfatik malformasyon etiyolojisi daha anlayışa ve yeni tedavi seçenekleri keşfetmek için, öncelikle CD34 Neg CD31 Pos seçim stratejisi 15 kullanılarak manyetik boncuk seçim stratejisine dayalı bir LEC izolasyon yöntemi geliştirdi. Bununla birlikte, elde edilen kültürler genellikle çıkarılması zor olan endotel hücreleri dışındaki hücre içermektedir. Daha sonra, yöntem CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 P ifade eden LECS sıralamak için FACS kullanılarak rafine edilmişos podoplanin Pos fenotip. Bu yaklaşım sonrası sıralama çeke <olmayan CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos hücrelerinin% 0.5 içeren nispeten homojen LEC kültürleri sonuçlandı. Pratik açıdan, FACS ile hücrelerin sıralama avantajı <% 0.5 dışı LECS varlığı bu azaltılmasıdır. Kültürlü LECS ve LM LECS tipik bir Arnavut kaldırımı morfoloji ve geçit 13 civarında yaşlanmış olur.
Bu çalışmada hücre yüzey belirteçleri bir paketi (CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos) kendi ifadesine dayalı normal ve anormal dokuların izolasyonu ve zenginleştirilmiş LECS kültürü için bir akış sitometri tabanlı protokol tanımlanmıştır. Hücreler, in vitro büyütme ile 5-7 gün, izolasyon anında dokularda sıklıklarına göre LEC ciddi ölçüde zengin sonuçlanan bir aşamasını takiben primer dokulardan kriteri edildi. S sırasındaurgery biz birkaç mikrogram gelen ağırlık gram onlarca arasında değişen dokuları edinin. Bu doku, mevcut lenfatik malformasyon damarları, doku yara ve lenfatik malformasyon kist trombüslerinin varlığı hacmine göre Bileşiminde büyük ölçüde değişebilir. Tüm bu bileşenler hastalıklı doku izole edilebilir kaç hücre etkileyecektir. Dolayısıyla başlangıç hücre sayısı birkaç milyon hücrelere birkaç bin hücrelerden uzanabilir. Benzer şekilde, bu hücre süspansiyonunun bileşimi etkiler ve sıralanmış hücre sayısı aynı zamanda, bir numuneden diğerine farklılık anlamına hücre sayıları başlangıç olacaktır.
LM LECS% 0.8 den% 12.43 arasında değişmektedir ise kültür içinde 5-7 gün sonra ayıklanmamış sünnet derisi örneklerinde LECS sıklığı, 0.52 ila% 4.7% arasında değişmektedir. LEC kültürleri oluşan>% 99 CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos hücreleri yeniden analiz sıralama sonrası ve bakımı tipik cobbleston sonraolmayan endotel unsurlar tarafından büyümesi olmadan geçit yaşlılık ~ 13 kadar kültür e morfolojisi.
Başlangıçtaki Doku sindirimi takip eden ve üstderi veya lenfatik malformasyon hücrelerden verimi genellikle düşüktür, çünkü ayırma hücreleri ex vivo olarak genişletmek için gereklidir. Böylece, lenfatik endotel hücreleri önceden genişleme i n vitro fare odasını tohum için gerekli ~ 2x10 6 hücre üretimi sağlar. Bu 5-7 gün bir in vitro genişlemesi aşamasını gerektirir. Bu hücre kültürü, birincil hücrelerde fenotipik değişikliklerin neden olabileceğini kabul birlikte, bu kültürlenmiş hücreler, bir fare zenograf modelinde 15 lenfatik malformasyon benzeri yapılar oluşturmak için kapasitelerini muhafaza göstermiştir.
FACS hücreleri sıralarken başarı derecesini belirlemek protokolü kapsamında birçok kritik adımlar vardır. En kritik aşama kolajenaz hücrelerin maruz kalma zamanıAşama 2.7'de tarif edildiği gibi primer dokulardan izolasyonu sırasında dispaz. Bu, yalnızca bir miktar, mevcut değil, aynı zamanda kullanılan enzimlerin parti halinde doku türü etkilenmez. Buna ek olarak, hücre popülasyonları için kullanılan floresan etiketli antikorlar titre tercihen monoklonal gerekmektedir. Biz tripsin / EDTA, EDTA, TrypLE Select ve hücre dekolmanı çözüm olarak birkaç farklı hücre dekolmanı çözümleri test. Biz EDTA sık sık kalan hücreleri ve artık hücre kümeleri ayırmak için uzun bir süre için kullanılmak üzere olduğunu buldu. Bunun tersine, tek hücre süspansiyonları, tripsin / EDTA, hücre kopması çözeltisi ve TrypLE seç inkübasyondan 3-5 dakika içinde elde edilmiştir. Biz, enzim çözeltilerinin herhangi biri ile tedavi sonrası CD31, CD34, podoplanin ve VEGFR-3 ekspresyonunda belirgin bir fark bulundu. Tek lekeli örnekleri de örtüşmeyen bu florokrom emisyon spektrumları sağlamak için her türlü sıralama deney yapılmalıdır veBu nedenle yanlış okumalar verin. Bu kritik adımlar da hücre protokolü değişiklikler sıralama flow sitometri sırasında gerekli ya da sorun olabilecek adımları oluşturmaktadır.
LECS 15 arasında, daha önce yayınlanan bir manyetik boncuk izolasyonu ile karşılaştırıldığında, FACS ile izole LECS avantajı, aşağıdakileri kapsar: heterojen bir numune içinde, yüksek saflıkta ve kesikli hücre alt ve nadir popülasyonlarının belirlenmesi Hücrelerin daha hızlı izolasyonu. FACS tabanlı LEC ve LM LEC izolasyon önemli sınırlamalar etrafında hücre sıralama sonuçlarını izleyen doğrulama için kullanılabilir hücrelerin sayısını sınırlı etrafında döner. Her girişim bizim deneyleri ve alet set-up standardize etmek yapılırken ek olarak, bu aynı parametreler mutlaka başka laboratuvarlarda tekrarlanabilir olmayabilir. Bu nedenle sonuç olarak, bazı farklılıklar oluşabilir. Buna ek olarak, lenfatik biyologların karşı karşıya kaldığı sorunlardan bir hücre spesifik belirteçler olmamasıdırBu ilk kapiller LEC belirteçleri ve kılcal LEC belirteçleri toplamak ayırt ederim. Bu aşamada, henüz sağlıklı LECS ve LM LECS ayırt ediyorum LEC belirteçleri belirlenememiştir. Lenfatik malformasyon dokusu da içerdiğinden lenf damarlarına (Şekil 1A) normal görünümlü, ortaya çıkan CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos normal LECS oranı yanı sıra hastalıklı fenotip olanlar içerecektir. Gelecekteki çalışmalar inceleyerek LEC ve LM LEC gen ifadesi ve proteomik aynı dokuda LECS LM LECS ayırt olabilir daha spesifik LM LEC belirteçler bize doğru yönlendirmek mümkün olabilir.
Gelecekte, biz de sünnet derisi ve lenfatik malformasyonlar LEC nüfusun seyrek alt kümeleri tanımlamak için girişimde FACS ve bu yeni LEC belirteçler kullanmaya bekliyoruz. Bu bize, bu hücre popülasyonlarının izole etmek ve lenf gelişiminde rollerini incelemek için izin verecekhatic damar sistemi ve lenfatik malformasyon.
CD34 Düşük CD31 Pos VEGR3 Pos podoplanin Pos dayalı Yalıtımlı LECS ve LM LECS anlamlı olmayan endotelyal hücre kontaminasyonu azalır. Ayrıca, FACS teknoloji bize CD31, podoplanin ve VEGFR-3 hücre yüzey belirteçleri ifadesi dayalı alt tiplere LECS ayırmak ve hücre soyu kalkınma bağlamında, bu anlamanızı sağlar. Hastalıklı LECS için, bu in vitro ve hayvan ksenogref modellerinde çeşitli hücre uyaranlara yanıt LEC hastalıklar ve LEC kapasitesini neden olan genlerin üzerinde daha fazla ışık tutacak hücreye özel çalışmalar için izin verir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Baker Vakfı ve Zerina Lokmic desteğiyle Kraliyet Çocuk Vakfı 'Bilim Kardeşlik Kadınları' kabul etmek istiyorum. Andrew G. Elefanty ve Edouard G. Stanley NHMRC Kıdemli Araştırma Fellows vardır. Onların laboratuarlarında çalışmak NHMRC ve Kök Hücre Avustralya tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies (Gibco) | 11965-092 | Used to collect tissue samples from the operating theatre. |
| EGM-2 MV Bullet Kit | Lonza | CC-3202 | EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid. |
| VEGF-C | R&D Systems | 2179-VC-025 | Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/ml VEGF-C |
| Antibiotic-antimycotic solution (100x) | Life Technologies (Gibco) | 15240-062 | This solution contains 10,000 U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution. |
| Fibronectin from human plasma | Sigma-Aldrich | F2006 | Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 °C and maintained sterile. Use 7 ml to coat 150 cm2 flask. |
| StemPro Accutase Cell dissociation reagent | Life Technologies (Gibco) | A11105-01 | StemPro®Accutase® is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment. |
| 0.4% Trypan Blue dye | Life Technologies (Gibco) | 15250-061 | Used as a viability stain. |
| Dispase II | Roche Applied Biosciences | 4942078001 | Used at 0.04% |
| Collagenase II | Worthington Lab | 4176 | Used at 0.25% |
| DNase I | Roche Applied Biosciences | 11284932001 | Used at 0.01% |
| 70 mm nylon cell strainers | BD Falcon | 352350 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59 | BioLegend | 356204 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581 | BioLegend | 343516 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59 | BioLegend | 303116, | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated rat anti human Podoplanin, clone NC-80. | BioLegend | 337006 | Used at 1:200 dilution |
| PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400112 | Used at 1:50 dilution |
| PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400126 | Used at 1:200 dilution |
| APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21 | BioLegend | 400120 | Used at 1:100 dilution |
| Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758 | BioLegend | 400525 | Used at 1:200 dilution |
References
- Baluk, P., et al. Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels. J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).
- Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation. Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).
- Zawieja, D. C.
- Witte, M. H., et al. Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology. Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).
- Andrade, M., Jacomo, A.
- Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, Elsevier Saunders. Robbins. (2009).
- Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps. Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).
- Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , University Press. Oxford. 1059-1076 (2013).
- Mulliken & Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, University Press. Oxford. 562-594 (2013).
- Bellini, C., Hennekam, R. C. Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).
- Schook, C. C., et al. Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients. Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).
- Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M.
- for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification. Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).
- Croteau, S. E., et al. Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly. J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).
- Lokmic, Z., et al. Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model. Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).
- Smith, R. J.
- Chen, E. Y., et al. Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations. Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).
- Norgall, S., et al. Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas. BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).
- Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J.
- Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , Melbourne, Australia. (2014).
- Baluk, P., McDonald, D. M. Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis. Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M.
- Lokmic, Z., Mitchell, G. M. Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels. Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).
- Hagerling, R., et al. A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy. EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).
- Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function. Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).
- Breiteneder-Geleff, S., et al. Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium. Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).
- Kaipainen, A., et al. Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).
- Schacht, V., et al. T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema. EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).
- Kriehuber, E., et al. Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages. J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).
- Florez-Vargas, A., et al. Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations. Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).
- Makinen, T., et al. PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature. Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).
- Connell, F. C., et al. Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas. Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).
