Summary
化学的に皮を剥がれ、または透過化、骨格筋線維の収縮特性の分析は、単一の筋細胞のレベルでの筋機能を評価することにより、強力な手段を提供しています。この記事では、製造するのに有効かつ信頼性の高い技術の概要を説明し、試験は、in vitroでの骨格筋線維を透過処理しました。
Introduction
骨格筋の主要な機能は、力を生成することです。筋力は運動神経活動電位、神経筋伝達、筋線維の活動電位、細胞内カルシウムの放出、および規制と収縮タンパク質の系の活性化が含まれる事象の複雑なシーケンスをin vivoで誘発されます。力発生は、この配列の最終的な結果であるので、力の赤字は、個々のステップのうちの1つまたは複数の障害が原因で発生することが。透過処理繊維の準備の重要な属性は、筋原線維装置が残りに関連した唯一の規制および収縮機能を、in vivoでの力発生のために必要な手順のほとんどを排除することです。研究者は、カルシウムとエネルギー（ATP）を活性化の配信の制御を想定しており、それらの天然の共同で、単離された規制や収縮構造の評価を可能にする簡略化したシステムで報われますnfiguration。 in vivoで観察された筋機能の変化を評価する際に透過性骨格筋線維を用いた力の測定は、このように有用です。例えば、私たちは、ミオスタチン欠損マウス1から繊維の力発生能力を特徴づけるために持続的な筋力低下の原因を評価するためにこの技術を使用している慢性腱板涙2,3次を示しました。
現代の透過処理繊維の方法論は、初期の影響力の研究4,5にトレースし、多数の研究グループによって現在使用中であることができます。技術は、文献に記載されているが、それらはまだビデオフォーマットで提示されていません。この記事の目的は、化学的に透過性に骨格筋試料から単繊維の最大の力を発生する能力を測定するための更新、有効かつ信頼性の高い技術を説明することです。これを達成するために、個々の繊維セグメントは、（本明細書で言及しました̶0;繊維」）繊維のプレ透過性バンドルから抽出され、リラックスした溶液、<10nmのカルシウム濃度となっている決定的な特徴を含む実験用チャンバ内に配置されています。繊維は、次に、力変換器の一方の端部と、長さ制御の他方の端部に取り付けられています。最適なサルコメア長で開催された繊維では、最大活性化し、それによって最大の等尺性収縮力を誘発するのに十分なカルシウム濃度を有する活性化溶液に移されます。力データは、取得された格納されたパーソナルコンピュータを用いて分析します。
Protocol
動物やヒトを対象とするすべての手順は、関連するガイドライン、規制、規制当局を基準にしてください。動物の使用およびケアに関するミシガン大学委員会（UCUCA）とミシガン大学医療センター治験審査委員会は、この資料に記載されているすべての動物およびヒトの手順を承認しました。
1.解剖とストレージストック溶液を作ります
注：以下の手順で指定された最終的なボリュームが拡大または縮小、必要に応じてすることができます。
- 千ミリリットルのビーカーに脱イオン水（ASTMタイプ1）の800ミリリットルを追加します。穏やかな撹拌を維持し、脱イオン水に、表1に記載されているすべての化合物を添加し、それらを溶解することができます。
化合物 コンクを希望します。 （M） 式重量（g /モル） 1 L（G）に追加 </ TR>K-プロピオン 0.250 112.17 28.040 イミダゾール 0.040 68.08 2.720 EGTA 0.010 380.40 3.800 のMgCl 2•6H 2 O 0.004 203.31 0.813
表1：解剖およびストレージ原液コンポーネント。
- 脱イオン水1,000 mlの最終容積をもたらします。それはこの時点で溶液をpHに不要であることに注意してください。 4℃での保存溶液を保管してください。
2.ストレージソリューションを作ります
- 貯蔵溶液200mlを行うために、切開および250mlのビーカー中で貯蔵ストック溶液100mlで始まります。最終的なアデノシンをもたらすのに十分なのNa 2 H 2のATPを追加2mmの三リン酸（ATP）濃度。グリセロールで200mlの最終容量をもたらします。水酸化カリウム（KOH）でpH 7.00に調整します。 -20℃での保存液に保管してください。
注：これによりグリセロールの粘性に正確体積分配することは困難です。このため、我々は一般的に重量のグリセロールを追加（グリセロール100mlを約126グラムの重さ）。
3.ソリューションを解剖してください
- ソリューションを解剖の200ミリリットルを作成するには、250mlビーカー中で解剖し、ストレージ原液100mlで始まります。
- 2 mMの最終ATP濃度をもたらすのに十分なのNa 2 H 2 ATPを追加します。 KOHで7.00にpHを調整します。脱イオン水で200mlに最終容量を持参してください。 -80℃で2.5ミリリットルのボリュームとストア内の一定分量。
ブリジ58でソリューションを解剖4.メイク
注：ブリジ58（透過させる）脂質二重層を破壊する非イオン性界面活性剤です。
<オール>5.試験ソリューションを作ります
注：以下はMoisescuとThieleczek 1978から適合されている（6）。テストソリューションの準備の追加コメントのための議論を参照してください。
- 「リラックス」と表示された3つの別々の千ミリリットルビーカー、「プレ活性化」と「アクティブ化」を準備します。各ビーカーに脱イオン水400mlを追加します。
- 適切なビーカーに、表2に示す化合物を追加し、Cと80°〜70℃の間に解決策を加熱します。継続的に攪拌しながら30分間、70〜80℃の溶液温度を維持します。
注：elimiで70〜80℃のアシストの温度活性化溶液中のEGTAと炭酸カルシウムとの反応により形成されたカルボン酸の国家。リラックス溶液及び予備活性化溶液は、一貫性を維持するための活性化溶液と同じように扱われます。
| RELAXINGソリューション | PRE-活性化溶液 | 活性化溶液 | |||||
| 化合物 | 式重量（g /モル） | 所望の濃度（MM） | 必須のマス（G） | 所望の濃度（MM） | 必須のマス（G） | 所望の濃度（MM） | 必須のマス（G） |
| HEPES（酸） | 238.30 | 90.0 | 10.724 | 90.0 | 10.724 | 90.00 | 10.724 |
| 酸化マグネシウム | 40.31 | 10.3 | 0.208 | 8.5 | 0.171 | 8.12 | 0.164 |
| EGTA（酸） | 380.40 | 52.0 | 9.890 | 52.00 | 9.890 | ||
| HDTA（酸） | 348.36 | 50.0 | 8.709 | ||||
| のCaCO 3 | 100.10 | 50.00 | 2.503 | ||||
表2：再laxing、ソリューションコンポーネントを事前に活性化し、活性化します。
- 溶液を室温に冷却し、1 mMの最終のNaN 3濃度をもたらすのに十分なのNaN 3 / KOHを追加します。
注意：NaN 3を（アジ化ナトリウム）は有毒です。この化学物質を処理する前に化学MSDSを参照してください。- 100 mMのアジ化ナトリウム溶液100mlを作るために、1 N KOHの10 mlにNaN 3を0.65gのを追加します。脱イオン水で100mlの最終量に調整します。
- 約7.10 KOHを使用してpHを調整します。
- 次のステップ5.4は、10 mMの最終クレアチンphosophate（CRP）濃度をもたらすために8 mmの最終ATP濃度と十分なのNa 2 CRPをもたらすのに十分なのNa 2 H 2 ATPを追加します。
- 脱イオン水を用いて500ミリリットルの最終容量に各溶液を持参してください。次に持ってKOHを使用し、実験が実行される温度にソリューションを冷却または加熱します7.10のpHは、その温度を維持しながら。
- 最終のプレ活性化溶液を500プレ活性化溶液中の溶液を弛緩1部は、予め活性化溶液を含有するビーカーに溶液を緩和加えるようになっています。 -80℃で2.5ミリリットルのボリュームとストア内の一定分量。
6.縫合糸ループを作ります
- 非滅菌USP 10-0モノフィラメントナイロン縫合糸のストランドで始まります。
- ダブルオーバーハンドノット技術を用いて鎖でループを作成するために鉗子を使用してください。約750ミクロンの直径のサイズに結び目を減らします。ループの直径は、接眼目盛マーキングを用いて顕微鏡下で評価することができます。
- いずれかの側にのみループと小（500μm）の尾を残して余分な縫合糸を除去するためにmicrodissectingはさみを使用してください。完成したループの例が図1に示されています。
- 繰り返しは6.2から6.3まで4まで使用可能なループが行われている手順。ストアシリコーンエラストマーメッキペトルにループ私は、将来の使用のために一品。
注：フォーの縫合糸ループは、試験したすべての繊維のために必要とされます。
7.バンドルサンプル
注：次の手順は、単一の繊維が最終的に抽出され、テストされるから小さい実験「バンドル」に、元のサンプルを解剖するための手順を説明します。すべての回でのサンプルは、注意して扱う必要があります。この説明の目的のために、命令は、調査者が右利きである場合として説明します。
- 目的のサンプルを入手し、解剖が行われる施設に転送します。
注：組織生検の方法は、実験モデルおよび試験デザインに依存して変化します。可能な場合には、筋肉の灌流は、生検の時まで維持されるべきです。 - サンプルが採取部位と解剖部位との間で転送される場合、氷上に維持しながら、冷却した解剖溶液を含有するバイアルにそれを運びます。
- チルド解剖ソリューションと二から三昆虫の取り付けピン（直径100μm、ステンレス鋼）で5センチシリコーンエラストマーメッキペトリ皿を準備します。
- 皿にサンプルを転送します。サンプルは、必要に応じて複数の解剖溶液を添加することによって沈めていることを確認してください。
- 顕微鏡下でサンプルを検査し、研究者（ 図2）の右肩に向かって繊維の縦軸を整列させるために、それを操作します。そして、コーナー部に固定することによって皿に試料を固定します。
注：これは、サンプルを最大限に活用し、繊維の完全性を保全しますので、この時点でポイントを固定するように、残りの結合組織を使用してください。バンドルは、繊維間のマージンを規定するのを補助するためにわずかな張力で固定することができます。 - 左手に鉗子と右でmicrodissectingはさみで、静かに繊維間の長手方向の縁に沿ってバンドルを解剖開始
注：に応じてその全長は、さらに多数の小さな束に束を分析します。 - そのバンドルの寸法は幅約0.5〜1ミリメートル、長さ≥3ミリメートルを測定することを確認します。 、又は皿の下に定規を置くことによって、接眼レンズ内の目盛りマーキングと顕微鏡を使用して寸法を評価します。
- 解剖プロセスの結果として、鉗子またはピンによって損傷されている任意の組織を除去し、廃棄します。
- バンドル十分な数の解剖やサンプルが枯渇したまでされるまでプロセスを繰り返します。
注：サイズおよび初期試料の状態、筋肉の形態、および研究者のスキルを含む多数の要因に依存する得ることができるバンドル数を。
8.透過性繊維
- 非イオン性界面活性剤」のBrij 58 'との生鮮·冷蔵、解剖溶液2.5 mlを含有するバイアルに解剖溶液からバンドルを転送追加（0.5％、w / v）です。時折、穏やかに撹拌しながら30分間氷上でインキュベートします。バンドルは、インキュベーションを通じて沈めたままであることを確認してください。
- 30分のインキュベーションの終わりに、新鮮な解剖溶液（なしのBrij 58）を含むバイアルにバンドルを転送し、残りの界面活性剤を除去するために穏やかにかつ簡単に攪拌します。
9.ストレージにバンドルを準備
- 冷蔵保存溶液を含むバイアルにバンドルを転送し、4℃で一晩インキュベートします。
10.ストアバンドル
- 十分な個々の0.5mlを解剖プロセス（チューブあたり1束）の間に得られたすべてのバンドルに対応するために、キャップコニカルチューブをネジで次の日、耐えることのできる収納ボックス、-80°Cを準備します。各円錐管は、新鮮なストレージソリューションの200〜400μLで満たされるべきです。
- 個別に標識された円錐形のチューブにバンドルを転送します。バンドルがに固定されていないことを確認してください円錐管の側面又は溶液の表面に浮遊。コニカルチューブに蓋をし、試験の日まで-80℃で試料を保存します。
11.実験装置を準備します
注：カスタム装置は長制御と力変換器、移動チャンバー方式と10Xの解剖顕微鏡を収容する段階で構成されています。マイクロメータ·ドライブのインストールは、ファイバ取付面の正確な操作を可能に。レーザー回折パターンは、サルコメア長さを推定するために使用されます。実験中に生成されたデータは、パーソナルコンピュータに記録されます。実験設定の注釈付きの画像について、図3を参照してください。
- 1バイアルリラックス、プレ活性化し、活性化溶液のそれぞれを解凍し、氷上に維持します。 ATPとCRPは低温に維持されるべきである不安定な化合物であることに注意してください。
- 使用するための顕微鏡、試験装置および関連するコンピュータを準備します。 リラックスした溶液を用いた最初の実験室を埋めます。我々の装置では、第一室は、研究者は、サイドからの繊維を撮影することを可能にするプリズムが含まれています。予備活性化溶液およびソリューションを活性化する第3と第二の実験室を埋めます。
- チャンバ内の温度計の表示が15℃を読み取るように温度を調整します。スレッド2準備縫合糸は、力変換器と長さコントローラ（ 図5A）の両方から延びるステンレス鋼取付面にループします。
12.エキス透過性に単繊維
- 興味のある繊維束を解凍し、新鮮な、冷却リラックス溶液とシリコーンエラストマーメッキペトリ皿に移します。どちらかの端にピンとバンドルを確保し、それが水没していることを確認してください。
- ピンセットを使用して、一方の端部でファイバを把持し、その長手方向軸に沿ってスムーズに抽出始めます。
注：に圧縮損傷を鉗子によって生じるファイバの端部は、この領域の収縮特性がテストされませんので、この時点では問題ではありません。繊維と細胞外マトリックスとの間の癒着が過度の緊張をもたらす可能性があるため、最終的にするためにストレッチ誘発損傷をリードし、バンドルからの繊維を抽出する場合には注意が、しかし、注意しなければなりません。かなりの変動は繊維が周囲の細胞外マトリックスに付着する程度の筋肉の間に存在することに注意してください。このようなストレッチによって損傷されていることが疑われている繊維は、廃棄されるべきです。 - （ 図4）に示すように、ピペットチップを変更するには、かみそりの刃またはメスを使用してください。ソリューションをリラックス少量と共に先端に繊維を導入します。リラックスしたソリューションが含まれている実験室にシリコーンエラストマーメッキペトリ皿から単繊維を転送します。
13.マウント単繊維
注：ステップバイステップdepicti上の図5に見ることができます。
- ピンセットでやさしく案内、ピペットチップから繊維を除去し、第1の縫合糸ループを使用して長さコントローラ（左）に固着。
- ピンセットでループを締めるときに、単一の、滑らかな動きを使用してください。等しく逆張力が縫合糸の両端に印加されていることを確認します。
- 最初のループは、長さコントローラ取付面の端から2mmと1mm程度を接続する必要があります。
- 力変換器に向かって光ファイバのもう一方の端を操作する（右）と同じ手順を使用して繊維を固定します。 microdissectingはさみ（ 図5C）を使用して、過剰な縫合糸を取り除きます。
- x座標マイクロドライブ（ 図3A）を用いて、長さコントローラと力変換器アーム間の距離を増加させることによってテンション少量の下に繊維を配置します。
- 最初の上に第2のループを通し、繊維を固定力変換器取付面の端0.2mMの内の点（ 図5D）で。
- microdissectingはさみを使って余分な縫合糸を取り除きます。
- ファイバ取付プロセスは、チャンバからの溶液の損失をもたらすことができます。必要に応じて、溶液の表面が平坦（いずれも凹面にも凸）であることを確認するために、よりリラックスしたソリューションを追加します。レーザー回折を使用して筋節の長さを評価する際に平坦な表面が重要です。
- y軸方向の長さ、コントローラの位置を調整することにより、実験室の側壁に繊維を平行に合わせます。
- プリズム側面図を用いた繊維を調査し、繊維が室の床と平行になるまで、z軸方向の長さ、コントローラの位置を調整します。
ファイバの一方の端部に第着目して、チャンバの床に平行な繊維の位置は、チャンバプリズムことなく達成することができ、T：注意顕微鏡のフォーカスを調整することなく、鶏、そのz軸マイクロドライブを使用して焦点に光ファイバのもう一方の端を持って来ます。 - 繊維は実装工程の結果として、曲げられたねじれたまたは損傷したどのような方法であれば、繊維は廃棄されるべきであり、新たな繊維が取り付けられています。
14.設定の最適サルコメアの長さ
- ファイバが正しくチャンバー内に整列された場合には、顕微鏡の前面に較正されたターゲットスクリーンを挿入し、最初の実験室の上の位置に合わせます。
注：ターゲット画面は、標準的な回折格子の式を用いて較正され、λ= SLのsinθと、SLはサルコメア長であり、θは0°と1°回折ビームとλの間の回折角は、レーザの波長です。 - レーザーをオンにして、レーザはファイバの中心を通過するように、ステージの位置を調整します。
注意：集中レーザー光がTにダメージを与えることができます視力O。レーザーがオンのときに顕微鏡で繊維を可視化しようとしないでください。 - レーザー光を回折し、校正し、ターゲット画面（ 図6）に干渉パタパタを観察するために、レーザービームに対して繊維を置きます。より明確にこのパターンを可視化するためにライトをオフにします。
注：レーザビームの正確な位置決めと、干渉パターンが見られない場合、これは繊維の筋原繊維の成分は異常な/破損していることを示唆している繊維は、新鮮なものと交換する必要があること。 - 回折光の所望の間隔は、ターゲット画面上で観察されるまで、筋節の長さを設定するために、長コントローラX軸マイクロドライブを使用して、繊維の張力を増加または減少させます。
注：繊維の最適なサルコメア長は試料が得られた動物の種類に依存するであろう。 2.7ミクロンのサルコメア長は、一般的に時ロバ最適であることが想定されますヒト組織7,8からの繊維を歌います。 - 最適なサルコメア長が設定された後、2つの最も内側の縫合糸の間の距離を測定します。これは、最も簡単に、チャンバのx軸の動きを制御するマイクロドライブ上のデジタル読み出しを使用して達成されます。接眼レンズの垂直方向の十字線が最も内側の縫合糸の最も内側の境界線上に整列されるように、室を置き、マイクロメータードライブ上のデジタル表示をゼロ。
- 他の最も内側の縫合糸に達するまで顕微鏡にx軸に沿った相対的なステージを翻訳。デジタル表示は、繊維の長さを示します。この値は、ファイバ長、L fとして記録されるべきです。
注：これは、2つの最も内側の縫合糸との間の距離が評価される収縮性組織の機能的な長さを決定することが理解されるべきです。研究者は、この内の寸法（ すなわち、LのF）の一貫性のために努力すべきです一連の実験。
15.見積もり断面積（CSA）
- L fの繊維を維持し、トップとサイドビューの両方からの繊維の中央部の高倍率画像をキャプチャするために、顕微鏡に取り付けられたカメラを使用しています。サイドビュー画像は、チャンバの側面に埋め込まれたプリズムを用いて捕捉することができます。
注意：上部と側面図の間の移行時には、2つの画像が「レジスタ」であり、従って、繊維の同部分の2つの異なるビューを表示することを確実にするためにだけy方向に顕微鏡を移動させることが重要です。 - 調査の後の絶対的な力を正規化するために、この時点で測定値を得ます。これらの測定値を得るための技術は、後述する図7Aおよび図7Bに示されています。
16.引き出す等尺性収縮
注：データは、これらの実験の間に生成するがSを回収し、力応答の取得、表示、保存、および分析のために有利であることができるコンピュータソフトウエアを使用せずに解釈することができます。私たちの研究室によって作成されたカスタムLabVIEWソフトウェアは、これらの機能だけでなく、能力が実験中に、長さ、コントローラのアクションを支配する「モーション列車」を設計することができます。
- リラックス、プレ活性化し、活性化溶液の温度が15℃で安定していることを確認してください。
- 予備活性化溶液を含むチャンバに繊維を移動し、3分間そこインキュベートするチャンバ制御ソフトウェアを使用してください。
注：事前に活性化溶液が弱く活性化溶液への繊維の導入の際に、非常に迅速な活性化及び力開発の結果、のCa 2+のためにバッファリングされています。 - 10秒前活性化溶液とL fで維持ファイバ長内に残存すると、ゼロFOを確立実験レコード内のRCEレベル。
注：長さコントローラの「検索力ゼロ」運動がゼロの力に対応する力変換器レベル（ すなわち繊維が簡単に動きの結果として弛みとなる）を明らかにする。パッシブ力は、ゼロとトランスデューサゼロ化運動の直前に力レベルとの差です。 - 3分の終了時に、活性化溶液を含むチャンバに繊維を移動し、急速な上昇が先行する力の高原によって証明されるように、最大等尺力を開発することができます。
- 最大等尺力に達した後、活性化溶液を含むチャンバ内にゼロの力に対応する力変換器出力を識別するために、長さ·コントローラーを使用しています。
注：ゼロの力に対応する力変換器の出力は、一般的には、各溶液が充填されたチャンバのために異なるため、これが必要です。 - 第2の力の達成次のPLateau、リラックス溶液を含むチャンバに繊維を返します。テストが完了しました。いずれか1つのセッション吸引中にすべてのソリューションを複数のファイバをテストし、新しい、冷却ソリューションを追加します。
注：長期間にわたって最大の収縮を誘発する際にブレンナーのサイクリングプロトコルが考慮されるべきです。このプロトコルは、最大活性化ファイバ9の構造と機械的特性を保存することが示されています。
Representative Results
健康、化学的に透過性に単繊維の形状が均一に表示され、高倍率で見たときに、一貫した線条の間隔を持っている必要があります。鉗子で操作したときに柔軟性がないか、明らかな構造的損傷を持っている繊維は、廃棄されるべきです。
ステップ15の間に採取高倍率のデジタル画像は、繊維の中央部に沿って5対の直径の測定のために分析されます。繊維CSAは、 図7（a）に示すように楕円形の断面を仮定し、5個々のCSAの測定値を平均。 図7Bはまた、1つのビューの繊維寸法は、他のビューでペアリングの寸法と比較して有意に異なることができる方法を説明するのに役立つ（すなわち、クロス推定されていますセクション）は、一般的には、丸くなっていません。
人間の低速および高速の繊維からの代表的な力のトレースは、それぞれ、 図8Aおよび8Bに示されています。 VOLTAG力変換器の電子出力は、テスト中に取得され、データ収集および分析ソフトウェア（LabVIEWの）を使用して（Mn）を強制的に変換される。 図9は、減算することにより算出された最大活性力（F o を ） を評価するために使用する方法を示しれます最適な筋節長で繊維を維持するのに必要な力弛緩状態にある間に（受動的な力、F P）、最大繊維活性化の間に開発され、最大等尺力（合力、F T）から。ゼロの力に対応する力変換器の出力は、一般的に、別の入浴室の各々のために異なるので、我々は簡単で、ゼロ力レベルを捕捉するために、両方のプレ活性化し、活性化溶液中で繊維を緩め実験記録。繊維CSAによる最大活性力の正規化は、特定の力（SF 0）のより有益な値を生成するために使用されます。それは考慮に入れ、繊維のCSAがかかるので、SFのO
クラフリンらから健康な成人の繊維の代表的な特性。人間のために2011年10、Mendias らマウスとGumucio ら 2011 1。ラットの2012年2 表3に示すデータはすべて使用して生成された表3に詳述されています。この資料に記載された技術。
| 人間 （外側広筋） | マウス （EDL） | ラット （棘） | ||||
| 男性 | 女性 | 男性 | 男性 | |||
| タイプ1 | タイプ2A | タイプ1 | タイプ2A | （型付きではありません） | （型付きではありません） | |
| CSA（μmの2） | 6900 - 4880 | 8380 - 5270 | 5470 - 3870 | 5610 - 4010 | 3080 - 1850 | 8010 - 5290 |
| FのO（MN） | 0.79から1.17 | 1.02から1.54 | 0.64から0.97 | 0.71から1.07 | 0.14から0.25 | 0.55から0.97 |
| SFのO（キロパスカル） | 142から182 | 165から210 | 156から193 | 172から214 | 67から94 | 102から131 |
| N | 129 | 160 | 149 | 207 | 37 | 94 |
人間広筋からの健康な成人の繊維の表3.一般的な特性は10 lateralis、マウス長指伸筋1およびラット棘は2筋肉。最適な筋節の長さは、両方のマウスのためのヒト繊維7,8 2.7ミクロンと2.5ミクロン（36に設定しました37）およびラット繊維（38）。実験L Fの範囲 （25 番目と75 番目の四分位数）は、それぞれ1.39〜1.73ミリメートル、1.17〜1.53ミリメートルとヒト、マウス、ラットのための1.32〜1.59ミリメートルでした。示された範囲は、25 番目と75 番目の四分位数を示し、nは試験された繊維の数です。
テスト中に経験した最も一般的な問題は、力RESPONSになる縫合糸ループスリップを含み、このような図10（a）に示すような「キャッチ」し、急に向かってまたは（中断）に戻る力応答をもたらす繊維の部分的または完全な厚さの涙、ゼロの電子繊維はまだ解決策を活性化中に浸漬されている間（ 図10B）。スリップ、涙やブレークが実験中に発生した場合、繊維の失敗の記録を維持することも11有益であることができるが、繊維が破棄されるべきであり、データは除外しました。発生する可能性のある他の否定的な結果は、事前活性化溶液（ 図10C）にある間に繊維の早期活性化です。予備活性化溶液中の部分的な活性化は、（ すなわち、中のカルシウム濃度の意図しない上昇よくプレ活性化）有意な交差ウェル汚染を示唆しています。この例では、すべての浴は、吸引されるべきであり、脱イオン水で十分にすすぎました。チャンバ間の分割面を乾燥することもrecommenですこれらの領域中の水分や結露などのDEDは風呂の間、溶液のウィッキングにつながる可能性があります。データを含めるか除外するかどうかは、最終的には実験的な焦点に依存し、調査を設計する際にこのように考慮されるべきです。
図1：縫合糸ループ（10-0モノフィラメントナイロン縫合糸）。
図2：バンドル切開鉗子は左手にあるが、顕微解剖はさみは右手にあります。赤い線は、繊維の縦軸と手首とはさみの良好な姿勢を示しています。
図3： G>（A）試験装置。 （a）は、透明な底部との実験室。 （b）は長さコントローラ。 （C）フォース·トランスデューサ。 （d）の光源。デジタル表示（e）の長さコントローラのxyzマイクロドライブ。デジタル表示（F）ステージマイクロドライブ。 （G）フォーストランスデューサのxyzマイクロドライブ。 （H）に較正レーザー回折ターゲットスクリーンのためのプラットフォーム。 （I）除振台。 （B）は、実験室のクローズアップビュー。 （j）の長コントローラから延びるステンレス取付面。 （k）は 、力変換器から延びるステンレス取付面。 （L）サイドビュープリズム。 （m）は 、熱電冷却モジュール用ハウジング。室TEを報告するための（n）の熱電対mperature。
図4：実験室に解剖皿から繊維を転送するために使用される改変された100μlのピペットチップ。
図5：実験装置の上に単繊維のマ ウント（A）を調製した縫合糸ループは、ステンレス製の取付面にねじ込ま。 （B）光ファイバは、実験室に移しました。 （C）光ファイバを除去し、過剰な縫合糸で縫合糸ループの最初のペアによってステンレス鋼取付面に固定します。縫合糸ループの（D）第二の対は、第1の縫合糸ループの上にねじ山及び場所に結びました。
図6：サルコメア長さを較正ターゲットスクリーン上にレーザー干渉パターンを投影することによって評価される（a）は、レーザ光 源。 （b）のミラー。 （c）の画面を対象とします。 （d）のレーザー干渉パターン。
図7：最適な筋節長（人間= 2.7ミクロン）で繊維断面積の（A）決意。楕円形の断面を想定すると、CSAは、繊維中央部に沿って5箇所のそれぞれについて計算され、5個々の測定値の平均を繊維CSAとして報告されます。図2aは、トップビューの直径を表し、あります楕円の一方の軸は、図2（b）は側面直径を表し、楕円の他方の軸です。 （B）は上面と側面の両方で撮影した5相当径測定のそれぞれを示す代表的なファイバ像。
図8：健康なヒト外側広筋からの代表的な力トレースは筋線維をlateralis（A）1繊維（CSA：5710μm2で、FのO：0.89 MnおよびSFのO：156キロパスカル）を入力します。。 （B）は図2（a）繊維（：9510μm2で、F O：1.66 MnおよびSFのO：174キロパスカルCSA）を入力します。繊維ミオシン重鎖タイプは、電気泳動分離及び銀染色技術22を使用することによって決定しました。
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図9：最大活性力（F 0）の計算前活性化溶液中に開始長コントローラのたるみ誘導移動中の繊維の力応答の（a）の拡大図。 F Pは、安静時に繊維と2.7ミクロンの筋節の長さを維持するために必要な力です。 （b）は長さコントローラたるみ誘導運動の拡大図。 F P -そのF 0 = F Tに注意してください。
図10：力の立ち上がり時に力トレースで「キャッチ」によって証明（A）縫合糸ループスリップ、。ループは、繊維を活性化する前に、安全であるかどうかを確認してください。 （B）活性化中の繊維の休憩。縫合糸ループの場所の間に乏しい繊維の完全性や積極的な繊維処理が原因である可能性がありメント。原因のCa 2+とのプレ活性化チャンバーの汚染を（C）早期の部分的な繊維の活性化。
Discussion
透過性の単一骨格筋線維の収縮特性の評価は、コンテキストの多種多様な筋機能を調査するために使用されます。例としては、繊維構造と機能に12、運動10,13,14、宇宙飛行15、傷害2,3,16、薬物治療17,18、疾患19および遺伝子操作20,21の老化の影響を評価した研究があります。による直接ネイティブ構成で筋原線維の収縮性能を評価する能力に、この技術は、信号伝送と励起誘発性カルシウム放出神経筋に存在する潜在的な交絡効果の筋原繊維の機能は存在しないの理解を形成するのに魅力的なプラットフォームを提供します研究中のシステムに含まれています。また、単繊維の機能テストは、これらのような収縮タンパク質同定の結果を補完するために使用することができ免疫組織化学またはゲル電気泳動+ウエスタンブロット22を経て得られました。
骨格筋の主要な機能の一つは、力を生成することです。したがって、SF 0、収縮システムの固有の力発生能力の尺度は、筋肉の生理学に大きな関心があります。 SF o の信頼性の推定値は、繊維CSAとF Oの両方の正確な措置を必要とします。繊維は、断面において、一般的に、円形でもない、またその長さに沿ってCSAが均一であるので、CSAを推定する際に、細心の注意を払うべきです。この目的のために、測定は、90°で分離された2つの観点から、それぞれの位置で、繊維の長さに沿ったいくつかの場所で作られています。 F o の信頼性の尺度は、カルシウム濃度Tと活性化溶液を用い、厚い及び薄いフィラメントの重なりを最大にするために、筋節の長さを調整する、受動的な力を占めを含むいくつかの詳細に注意を必要とします最大活性化ハット結果は、所望の実験温度に維持し、実験の日の前の繊維の最適な保存条件（温度及び時間）を維持します。
ここで説明する手順は、最大等尺性力を評価するための手順を説明しているが、それは骨格筋線維の他の重要な機能の品質を評価することがしばしば望ましいです。これは、繊維の追加の機械的操作を含むように実験プロトコルを拡張することによって達成することができます。例えば、繊維は、異なる負荷の一連に対して短縮する速度の測定は、力のパワーおよび速度パワー関係は10,23,24を計算することが可能な力-速度関係の決意を可能にします。また、無負荷短縮の速度は、弛み誘発短縮一連の工程を適用することから成る「たるみ試験」25、及びmeasuriを用いることによって決定することができますたるみを除去するために、ファイバによって必要な時間をngの。頻繁に報告されている別の運動パラメータが一時的にすべてのクロスブリッジ26を切り離し機械的摂動次力再開発のためのK TR、速度定数です。最後に、カルシウム濃度と活性力発生（「強制-PCAの関係」）との間の関係は、多くの場合、興味18であり、収縮を活性化するための閾値以下の範囲のカルシウム濃度を有する一連の溶液に繊維を曝すことによって決定することができます最大活性化とそのための最大の力（FのO）を誘発するのに十分なものにシステム。
上記の機器の多くは単繊維の収縮性を評価するために必要とされているが、他の機器では絶対に必要というわけではありません。長さコントローラは、例えば、繊維の急速なまたは正確な延長または短縮を必要とする任意の実験プロトコルのために不可欠です、（力レコード内のゼロ力レベルはまだいくつかの手段によって識別されなければならないが）が、最大等尺性力を評価するために絶対に必要ではありません。実験室内に繊維を配置するときの断面積を評価するのに有用ながら、側面からの繊維の観察を可能にするプリズムは、絶対に必要ではありません。さらに、種々の実験の溶液に繊維を露出させるための代替手段は、チャンバーの手動操作系または溶液の迅速な充填および排出を可能にする単一のチャンバを工夫するなど、使用することができます。このような15°Cのサブ生理学的実験の温度は一般的に機械的な測定1,2,3,5,8,12,17,27の再現性を改善するために使用される最後に、それは他の温度23に有効なデータを生成することができます溶液特性（ 等カルシウム濃度、pH）に対する温度の影響を考慮する限り、28。 試験液の組成は、ここで説明する透過処理繊維技術の最も重要な側面の一つです。溶液組成物に関する検討事項は複雑であり、この記事の範囲を超えています。プロトコルセクションの手順5で説明したソリューションは、一定のイオン強度、陽イオン組成、および浸透圧6,29を維持しながら解決策を活性化に事前に活性化からの転送時に、透過性繊維の急速な活性化に重点を置いて設計されています。溶液組成物への他のアプローチは、他の研究グループによる顕著な成功を収めて使用され、一般的に公開された結合定数と計算ツール27,30,31を利用することがされています。様々な活性化溶液中のカルシウムイオンの濃度は、このような力-PCAの評価として最大下の活性化を含む研究において特に重要です。そのようなもののような繊維が完全に活性化された実験について説明しますDここで、活性化溶液中のカルシウム濃度は、典型的には、その正確な知識があまり重要で作る最大の力を達成するために必要な余裕によって越えます。クレアチンリン酸の添加は、そうでない場合は、収縮活性に関連するであろうintramyofibrillar ATPおよびADPの変動を緩衝するために重要です。クレアチンキナーゼは、ADPのクレアチンリン酸からのリン酸転移を触媒するために必要とされます。高温での作業や高速ファイバ32の高速短縮を測定するなど、高いATP離職率につながる実験条件の下では、クレアチンキナーゼは、繊維に結合したままで、内因性のクレアチンキナーゼを補充するために溶液に添加されなければなりません。あまり厳しい実験条件のために、ATP再生系27はあまり重要です。
透過性単繊維技術の制限は、以下のものが挙げられます。これらのテストによって生成されたデータは、定義します実験装置に取り付けられた特定の筋原繊維ユニットの収縮特性。したがって、これは、セグメントが順番に、筋肉内の繊維の総数のごく一部を表す、取得された全体多核繊維のごく一部を捕捉します。研究者らは、このように、慎重に実験から引き出された任意の結論をサポートするために必要なサンプリングを検討する必要があります。さらに、繊維機能の運動トレーニングの介入の影響を評価する評価した繊維が実際にトレーニング中に動員されたことを前提としています。プロトコルは、繊維の自然な細胞内環境を模倣しようとしたが、筋細胞膜の透過化処理は、非特異的であり、必ずしも可溶性の細胞内成分が自由に入浴液中に拡散することができます。膜透過性のさらなる結果は、繊維体積33に腫脹によって証明浸透圧バランスの変化です。ザ繊維の膨潤は、筋フィラメントシステム34,35の減少カルシウム感受性の結果、アクチンとミオシンフィラメントの間の距離が大きくなりますが、大規模な、浸透活性化合物34の導入によって逆転させることができます。考慮すべき最後の制限は、実験装置に繊維を取り付けるために使用される技術の結果です。これは、常に機能欠損に出席して、取付点で近くフィラメントシステム内の空間的関係を歪める必要です。具体的には、時の繊維および取り付け点に隣接する領域は、機能的に侵害され、それによって、測定システムへの人為シリーズ弾性を貢献しています。
要約すると、我々は、 インビトロで化学的に透過性骨格筋線維の力発生能力を評価する手段を記載しています。この記事の焦点は、最大等尺性力の評価になっているがgeneratinヒト骨格筋線維gの容量、実験的なアプローチは、修飾された哺乳動物または他の種の範囲にわたって速度パラメータとの関係の多様を決定するために拡張することができます。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
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