Summary
Analyse av de kontraktile egenskapene til kjemisk flådd, eller permeabiliserte, skjelettmuskelfibrene tilbyr en kraftig metode til å vurdere muskelfunksjon på nivå med singelen muskelcellen. I denne artikkelen skissere vi en gyldig og pålitelig teknikk for å forberede og test permeabilized skjelettmuskelfibre in vitro.
Introduction
Den primære funksjon av skjelettmuskulatur er å generere kraft. Muskelkraften utløses in vivo via en kompleks sekvens av hendelser som omfatter motoriske nerveaksjonspotensialer, neuromuskulær transmisjon, muskelfiberaksjonspotensialer, frigivelse av intracellulært kalsium og aktivering av systemet med regulerende og kontraktile proteiner. Fordi kraftgenerering er det endelige resultat av denne sekvens, kan et underskudd i kraft skyldes svikt i ett eller flere av de individuelle trinnene. En viktig egenskap av permeabilized fiber forberedelse er at det eliminerer de fleste av trinnene som er nødvendig for styrkegenerering in vivo, med bare de regulatoriske og kontraktile funksjoner knyttet til den myofibrillære apparat som gjenstår. Undersøkeren antar kontroll over levering av aktiverende kalsium og energi (ATP), og belønnes med et forenklet system som tillater vurdering av de isolerte regulerings- og kontraktile strukturer i sitt opprinnelige configuration. Målinger av kraft ved hjelp permeabiliserte skjelettmuskelfibre er dermed verdifull når man vurderer endringer i muskelfunksjon observert in vivo. For eksempel har vi brukt denne teknikken for å karakterisere kraft kapasitet på fiber fra myostatin mangelfull mus 1 og å vurdere årsaken til vedvarende muskelsvakhet utstilt etter kronisk rotator cuff tårer 2,3.
Moderne permeabilized fiber metodikk kan spores tilbake til tidlig innflytelsesrike studier 4,5 og er i bruk av en rekke forskningsgrupper. Selv om teknikker er blitt beskrevet i litteraturen, har de ennå ikke blitt presentert i videoformat. Målet med denne artikkelen er å illustrere et oppdatert, gyldig og pålitelig teknikk for å måle maksimal kraft kapasitet på enkeltfibre fra kjemisk permeabiliserte skjelettmuskelprøver. For å oppnå dette, en individuell fibersegmentet (referert til heri som en ̶0, av hvilke fiberen ") ekstrahert fra en forhånds permeabilisert bunt av fibre og plassert i en eksperimentell kammer som inneholder en avslappende løsning, er den definerende trekk en kalsiumkonsentrasjon som er <10 nM. Fiberen blir deretter festet ved en ende til en kraft-transduser, og i den andre enden til en lengde-regulator. Med fiber holdes på et optimalt sarcomere lengde, blir det overført til en aktiverende oppløsning som har en kalsiumkonsentrasjon er tilstrekkelig til å fremkalle maksimal aktivering og derved maksimal isometrisk kontraksjon kraft. Force data er kjøpt, lagret og analysert ved hjelp av en personlig datamaskin.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr eller mennesker, skal utføres i samsvar med relevante retningslinjer, forskrifter og tilsynsorganer. University of Michigan komité for bruk og vedlikehold av dyr (UCUCA) og University of Michigan Medical Center Institutional Review Board godkjent alle dyr og mennesker prosedyrene som er beskrevet i denne artikkelen.
1. Pass Dissecting og lagring lagerløsning
Merk: De endelige volumene som er angitt i følgende instruksjoner kan skaleres opp eller ned etter ønske.
- I et 1000 ml begerglass legg 800 ml avionisert vann (ASTM type 1). Opprettholde en mild oppsikt, legge alle forbindelsene angitt i tabell 1 til avionisert vann og la dem å oppløse.
Compound Ønsket Kons. (M) Formel vekt (g / mol) Legg til en l (g) </ Tr>K-propionate 0.250 112,17 28,040 Imidazol 0,040 68,08 2,720 EGTA 0,010 380,40 3.800 MgCl2 • 6 H 2 O 0,004 203,31 0,813
Tabell 1: dissekere og lagring lager løsningskomponenter.
- Bring til et sluttvolum på 1000 ml med avionisert vann. Legg merke til at det er unødvendig å ph løsningen på dette tidspunktet. Oppbevar stamløsning ved 4 ° C.
2. Gjør lagringsløsning
- For å gjøre 200 ml lagringsløsning, begynne med 100 ml dissekere og lagring stamløsning i et 250 ml begerglass. Legg tilstrekkelig Na 2 H 2 ATP for å bringe endelige adenosintrifosfat (ATP) konsentrasjon til 2 mM. Bring til et sluttvolum på 200 ml med glycerol. Juster til pH 7,00 med kaliumhydroksid (KOH). Oppbevar lagringsløsningen ved -20 ° C.
Bemerk: På grunn av den viskøse natur av glycerol kan det være vanskelig å nøyaktig dispensere av volumet. På grunn av dette har vi vanligvis tilsette glycerol på vektbasis (100 ml glycerol veier ca. 126 g).
3. Gjør Dissecting Solution
- For å gjøre 200 ml dissekere oppløsning, begynne med 100 ml dissekere og lagring stamløsning i et 250 ml begerglass.
- Tilsett tilstrekkelig Na 2 H 2 ATP for å bringe slutt ATP-konsentrasjon på 2 mM. Juster pH til 7,00 med KOH. Bring sluttvolumet til 200 ml med avionisert vann. Delmengde i volum på 2,5 ml og oppbevar ved -80 ° C.
4. Lag dissekere Solution med Brij 58
Merk: Brij 58 er et ikke-ionisk vaskemiddel som forstyrrer (permeabilizes) lipidbilagene.
<ol>5. Gjør Testing Solutions
Merk: Følgende er tilpasset fra Moisescu og Thieleczek 1978 (6). Se diskusjon for ytterligere kommentarer om klargjøring testing løsninger.
- Forbered tre separate 1000 ml kanner merket "avslappende", "Pre-aktiverende" og "Aktivering". Legg 400 ml deionisert vann til hver begerglass.
- Legg forbindelsene angitt i tabell 2 til den aktuelle begerglass og deretter varme opp løsningene til mellom 70 ° C og 80 ° C. Opprettholde en løsningstemperatur på 70-80 ° C i 30 minutter under kontinuerlig omrøring.
Merk: En temperatur på 70-80 ° C assists i eliminasjon av karbonsyre dannet ved omsetning av kalsiumkarbonat med EGTA i den aktiverende oppløsning. Den avslappende løsning og pre-aktivering løsninger er behandlet på samme måte som den aktiverende oppløsning for å opprettholde konsistens.
| AVSLAPPENDE LØSNING | PRE-aktiverende oppløsning | Aktiverende oppløsning | |||||
| Compound | Formel vekt (g / mol) | Ønskede konsentrasjon (mM) | Nødvendig Mass (g) | Ønskede konsentrasjon (mM) | Nødvendig Mass (g) | Ønskede konsentrasjon (mM) | Nødvendig Mass (g) |
| HEPES (syre) | 238,30 | 90.0 | 10,724 | 90.0 | 10,724 | 90.00 | 10,724 |
| MgO | 40.31 | 10.3 | 0,208 | 8.5 | 0,171 | 8.12 | 0,164 |
| EGTA (syre) | 380,40 | 52.0 | 9,890 | 52.00 | 9,890 | ||
| HDTA (syre) | 348,36 | 50.0 | 8,709 | ||||
| CaCO 3 | 100,10 | 50.00 | 2,503 | ||||
Tabell 2: Relaxing, pre-aktivering og aktiveløsningskomponenter.
- Avkjøl løsningen til romtemperatur og tilsett tilstrekkelig NaN3 / KOH til å bringe den endelige NaN3 konsentrasjon til 1 mM.
FORSIKTIG: NaN 3 (natriumazid) er giftig. Refererer til de kjemiske datablad før håndtering av dette kjemikaliet.- For å gjøre 100 ml 100 mM natriumazid løsning, tilsett 0,65 g NaN 3 til 10 ml 1 N KOH. Juster til et sluttvolum på 100 ml med avionisert vann.
- Juster pH til omtrent 7,10 ved hjelp av KOH.
- Etter trinn 5.4 tilsett tilstrekkelig Na 2 H 2 ATP for å bringe den endelige konsentrasjon ATP til 8 mm og tilstrekkelig Na 2 CRP til å bringe den endelige kreatin phosophate (CRP) konsentrasjon til 10 mM.
- Bringe hver løsning til sluttvolum på 500 ml ved hjelp av avionisert vann. Chill eller varme opp løsningene til den temperatur ved hvilken eksperimenter vil bli utført, og deretter bruke KOH for å bringepH-verdien til 7,10 og samtidig opprettholde denne temperatur.
- Legg avslappende løsning til begeret inneholdende pre-aktiverende oppløsning, slik at den endelige pre-aktiverende oppløsning er en del avslappende oppløsning i 500 pre-aktiverende oppløsning. Delmengde i volum på 2,5 ml og oppbevar ved -80 ° C.
6. Gjør Suture Loops
- Begynn med en tråd av ikke-sterile USP 10-0 monofilament nylon sutur.
- Bruk pinsett til å lage en løkke med tråden ved hjelp av dobbel halvstikk-knute teknikk. Reduser knute i størrelse til ca 750 mikrometer i diameter. Loop diameter kan vurderes under mikroskop bruker okulartrådkorset tegninger.
- Bruk microdissecting saks for å fjerne overflødig sutur slik at bare sløyfe og små (500 mikrometer) haler på hver side. Et eksempel på en ferdig sløyfe er vist i figur 1.
- Gjenta trinn 06.02 til 06.03 fram til fire brukbare løkker har blitt gjort. Oppbevares looper i en silikon elastomer belagt PetrJeg parabolen for fremtidig bruk.
Merk: Fire sutur sløyfer er nødvendig for hver fiber testet.
7. Bundle Sample
Merk: Følgende trinn beskriver fremgangsmåten for å dissekere den opprinnelige prøven i mindre eksperimentelle 'pakker' som enkeltfibre vil til slutt bli trukket ut og testet. Til alle tider prøven bør behandles med forsiktighet. For formålet med denne beskrivelsen vil bli gitt instruksjoner som om undersøkeren er høyrehendt.
- Skaff prøven av interesse og overføre den til anlegget der disseksjon vil finne sted.
Merk: Metoder for vevsbiopsi vil variere avhengig av eksperimentell modell og studiedesign. Der det er mulig, bør muskel perfusjon opprettholdes fram til tidspunktet for biopsi. - Hvis prøven skal overføres mellom innhøstingen området og dissekere området, transportere den i et hetteglass inneholdende avkjølt dissekere oppløsning mens holdes på is.
- Forberede en 5 cm silikon-belagt petriskål med kjølt dissekere løsning og 02:58 insekt festepinnene (100 mikrometer i diameter, rustfritt stål).
- Overfør prøven til parabolen. Sørg for at prøven forblir under vann ved å legge mer dissekere løsning hvis det er nødvendig.
- Inspisere prøven under mikroskop og manipulere det å justere lengdeaksene til fibrene mot høyre skulder av undersøkeren (figur 2). Deretter forankre prøven til fatet ved å feste i hjørnene.
Merk: Benytt deg av eventuelle gjenværende bindevev som forankringspunkter på denne tiden siden dette vil maksimere prøven bruk og bevare fiber integritet. Bunten kan være låst i svakt strekk for å bistå i å definere inter-fiber marginer. - Med pinsett i venstre og microdissecting saks i retten, begynner forsiktig dissekere en bunt langs lengde marginer mellom fibrene
Merk: Avhengig avtotal lengde, videre dissekere bunten inn i en rekke mindre bunter. - Sikre at bundle dimensjoner måler ca 0,5-1 mm i bredden og ≥3 mm i lengde. Vurdere dimensjonene ved hjelp av et mikroskop med graticule markeringene i okularet, eller ved å plassere en linjal under parabolen.
- Fjern og kast eventuelle vev som er skadet av pinsett eller pinner som følge av dissekere prosessen.
- Gjenta prosessen helt til et tilstrekkelig antall bunter er blitt dissekert eller inntil prøven er oppbrukt.
Merknad: Antall bunter som kan oppnås, vil avhenge av en rekke faktorer, inkludert størrelsen og tilstanden til den første prøven, morfologi av muskelen, og dyktighet av undersøkeren.
8. permeabilize Fibers
- Overfør buntene fra dissekere oppløsning i en ampulle som inneholdt 2,5 ml ferskt, kjølt, dissekere løsning med den ikke-ioniske detergent "Brij 58" tilsettes(0,5%, w / v). Inkuber på is i 30 min med sporadisk, forsiktig omrøring. Sørg for at buntene være neddykket i hele inkubasjon.
- Ved slutten av den 30 min inkubering, overføres buntene til et hetteglass inneholdende frisk dissekere oppløsning (uten Brij 58) og agitere forsiktig og en kort stund for å fjerne eventuelle gjenværende vaskemiddel.
9. Forbered Bunter for Storage
- Overfør buntene til et hetteglass med kjølt lagringsløsning og inkuberes over natten ved 4 ° C.
10. Oppbevar Bundles
- Dagen etter, utarbeide en oppbevaringsboks, som tåler -80 ° C, med nok individuelle 0,5 ml skrukork koniske rør for å imøtekomme alle bunter innhentet under dissekere prosessen (en bunt per rør). Hver konisk rør skal være fylt med 200-400 mL av fersk lagringsløsning.
- Overfør bunter inn i individuelt merkede koniske rør. Sørg for at pakken ikke er fast tilden siden av det koniske rør eller flytende på overflaten av oppløsningen. Sett lokk på koniske rør og lagre prøvene ved -80 ° C inntil dagen for testing.
11. Forbered eksperimentelle enheter
Merk: tilpassede apparat består av en scene som huser en lengde kontroller og krafttransduktor, et bevegelig kammersystem og en 10X disseksjon mikroskop. Mikrometer driv installasjoner tillate nøyaktig manipulering av fiber festeflater. Laser diffraksjonsmønstre benyttes for å estimere sarcomere lengde. Data generert under eksperimentering er spilt inn på en personlig datamaskin. Se Figur 3 for kommenterte bilder av det eksperimentelle oppsettet.
- Tine en ampulle hver av de avslappende, pre-aktivering og aktiverende løsninger og vedlikeholde på is. Legg merke til at ATP og CRP er labile forbindelser som bør opprettholdes på lave temperaturer.
- Klargjør mikroskop, testapparatet og tilhørende datamaskin for bruk. Fyll første eksperimentelle kammer med avslappende løsning. I vår apparat, inneholder det første kammer prismer som tillater undersøkeren å fotografere fiberen fra siden. Fyll den andre eksperimentelle kammer med pre-aktiverende oppløsning og den tredje med aktiverende oppløsning.
- Juster temperaturen, slik at i-kammeret termometer displayet står 15 ° C. Thread to forberedte sutur sløyfer på rustfritt stål festeflater som strekker seg fra både tvangs svinger og lengde-kontrolleren (figur 5A).
12. Utdrag permeabilized Enkelt Fiber
- Tine en fiber bunt av interesse, og overføre til en silikon elastomer-belagt petriskål med fersk, kjølt avslappende løsning. Fest bunt med pinner i hver ende, og sørge for at det er under vann.
- Ved hjelp av tang, griper en fiber i den ene enden og begynner jevnt å trekke ut den langs sin lengdeakse.
Merk: Trykk skade pående av fiberen som følge av pinsetten er ikke et problem på dette tidspunkt fordi de kontraktile egenskaper i dette området ikke vil bli testet. Forsiktighet bør imidlertid utvises forsiktighet ved å trekke ut fibrene fra bunten siden adhesjoner mellom fibrene og den ekstracellulære matriks kan resultere i overdreven spenning, til syvende og sist fører til strekk-indusert skade. Legg merke til at en betydelig variabilitet blant muskler i hvilken grad fibrene holder seg til den omgivende ekstracellulære matriks. Fiber som er mistenkt for å ha blitt skadet av en slik strekning skal kastes. - Bruk et barberblad eller skalpell for å endre en pipette tips som vist i (figur 4). Introduser fiberen til spissen sammen med en liten mengde av avslappende løsning. Overfør enkelt fiber fra silikon-elastomer-belagt petriskål til den eksperimentelle kammer som inneholder den avslappende løsningen.
13. Mount Enkelt Fiber
Merk: En trinn-for-trinn depictipå kan sees i figur 5.
- Guiding forsiktig med pinsett, fjerner fiber fra pipettespiss og feste det til lengden-kontrolleren (til venstre) med den første sutur loop.
- Bruk en enkelt jevn bevegelse når stramme løkken med pinsett. Sørg for at en lik og motsatt spenning påføres hver ende av sutur.
- Den første sløyfen bør knyttes rundt 1 mm til 2 mm fra enden av den lengde-regulator festeflaten.
- Manipulere den andre enden av fiberen mot den kraft-transducer (til høyre) og sikre fiberen ved hjelp av den samme prosedyre. Fjern overflødig sutur ved hjelp av microdissecting saks (figur 5C).
- Plasser fiber under en liten mengde spenning ved å øke avstanden mellom de lengde-regulator og kraft-transduser-armer ved hjelp av X-koordinaten mikrometer stasjon (figur 3A).
- Tre andre sløyfen over det første og feste fiberved et punkt innenfor 0,2 mm fra enden av det kraftfesteflaten transduseren (figur 5D).
- Fjern overflødig sutur ved hjelp av microdissecting saks.
- Fiberen feste prosessen kan resultere i tap av oppløsning fra kammeret. Om nødvendig, tilsett mer avslappende løsning for å sikre at overflaten av løsningen er flat (hverken konkav eller konveks). Et flatt underlag er viktig for å vurdere sarcomere lengde ved hjelp av laser diffraksjon.
- Juster fiber parallelt med sideveggene av forsøkskammeret ved å justere posisjonen til den lengde-styreenheten i retning av y-aksen.
- Kartlegge fiber ved hjelp av prismet sideriss og justere posisjonen av lengdekontrollen i retning av z-aksen til fiberen er parallell med gulvet av kammeret.
Note: Posisjonering av fiber parallelt med gulvet av kammeret kan gjennomføres uten kammer prismer ved å fokusere først på den ene enden av fiberen og thøne, uten å justere fokus mikroskop, og bringer den andre enden av fiberen i fokus ved hjelp av sin z-akse mikrometer stasjon. - Dersom fiberen er på noen måte forvridd, vridd eller skadet som følge av monteringsprosessen, bør fiberen kastes og en ny fiber festet.
14. Sett Optimal sarcomere Lengde
- Når fiber er riktig justert i kammeret, setter kalibrert målet skjermen på fremre del av mikroskopet og juster den over første eksperimentelle kammer.
Merk: target-skjermen er kalibrert ved bruk av standard gitterligningen, λ = SL sinØ, hvor SL er sarcomere lengde, er θ diffraksjonsvinkelen mellom 0 ° og 1 ° diffraktert bjelker og λ er bølgelengden til laseren. - Slå på laseren og justere posisjonen av scenen slik at laseren passerer gjennom sentrum av fiberen.
FORSIKTIG: Konsentrert laserlys kan være skadelig to syn. Forsøk aldri å visualisere fiberen gjennom mikroskop når laseren er på. - Plasser fiber i forhold til laserstrålen for å diffract laserlys og observere et interferens patter på den kalibrerte target skjermen (figur 6). Slå av lysene for å visualisere dette mønsteret tydeligere.
Merk: Hvis, med riktig posisjonering av laserstrålen, er ingen interferensmønster sett, tyder dette på at de myofibrillære komponenter i fiberen er unormale / skadet og at fiberen skal erstattes med en ny en. - Hvis du vil angi sarcomere lengde, øke eller redusere strammingen av fiber hjelp lengden-kontrolleren x-aksen mikrometer stasjonen til ønsket avstand av diffrakterte lys er observert på målet skjermen.
Merk: Den optimale sarcomere fiberens lengde vil være avhengig av dyrearten som prøven ble erholdt. En sarcomere lengde på 2,7 mikrometer er allment antatt å være optimal når assessynger fibre fra menneskelig vev 7,8. - Etter optimal sarcomere lengde er satt, måle avstanden mellom de to innerste sting. Dette er lettest gjøres ved hjelp av digital avlesning på mikrometer stasjonen som kontrollerer x-aksen bevegelse av kammeret. Plasser kammeret slik at den vertikale korset av okularet er justert på den innerste grensen av det innerste sutur og nullstille digital avlesning på mikrometer stasjonen.
- Trans scenen langs x-aksen i forhold til mikroskopet til n annen innerste sutur. Det digitale displayet vil indikere lengden av fiberen. Denne verdien skal registreres som fiber lengde, L f.
Merk: Det skal forstås at avstanden mellom de to innerste sting vil bestemme den funksjonelle lengden av den kontraktile vevet som blir undersøkt. Etterforskeren bør strebe etter konsistens i denne dimensjonen (dvs. L f) innenfor enserie eksperimenter.
15. Estimate tverrsnittsareal (CSA)
- Oppretthold fiberen ved L f og bruke mikroskop montert kamera for å fange opp en stor forstørrelse bilde av den sentrale del av fiberen fra både toppen og sideriss. Side view bilder kan tas ved hjelp av prismet innebygd i siden av kammeret.
Merk: Når du skifter mellom topp og side utsikt er det viktig å flytte mikroskopet bare i y-retning for å sikre at de to bildene er "i register", og viser derfor to forskjellige visninger av samme delen av fiber. - Utføre målinger på dette tidspunktet å normalisere absolutt kraft senere i studiet. Teknikkene for å oppnå disse målingene er beskrevet senere og illustrert i figurene 7A og 7B.
16. Elicit isometrisk kontraksjon
Merk: Mens data generert i løpet av disse eksperiments kan samles og tolkes uten bruk av en datamaskin, programvare som gjør det mulig for kjøpet, display, lagring og analyse av de kraftresponser er fordelaktig. Skikken LabVIEW programvare laget av vårt laboratorium gjør at disse funksjoner samt evnen til å designe "bevegelige tog 'som styrer handlingen av lengden-kontrolleren under et eksperiment.
- Bekrefte at temperaturen i den avslappende, pre-aktivering og aktiverende oppløsninger er stabile ved 15 ° C.
- Bruk kammeret kontrollprogramvaren for å bevege fiberen til kammeret inneholdende den pre-aktiverende oppløsning og inkuberes der i 3 min.
Merk: pre-aktiverende oppløsning svakt bufret for Ca 2+, noe som resulterer i en meget rask aktivering og kraft utvikling ved innføring av fiberen til den aktiverende oppløsning. - Med 10 sek igjen i pre-aktiverende oppløsning og fiberlengden holdes ved L f, etablere en null foRCE nivå i forsøks posten.
Merk: "Finn Force Zero bevegelse av lengde-kontrolleren avslører kraft-transduser nivå som tilsvarer null styrke (dvs. fiber blir kort slakk som følge av bevegelsen). Passiv kraft er forskjellen mellom det null og kraftnivået like før transduseren-nullstilling bevegelse. - Ved slutten av 3 min, flytter fiber til kammeret som inneholder den aktiverende oppløsning og tillate maksimal isometrisk kraft for å utvikle seg som vist ved et platå i kraft som blir etterfulgt av en rask økning.
- Etter å ha nådd maksimal isometrisk kraft, bruke lengden-kontrolleren for å identifisere den kraft-transduktor-utgangen som tilsvarer null kraft i kammeret som inneholder den aktiverende oppløsning.
Merk: Dette er nødvendig fordi den kraft-transduktor-utgangen som tilsvarer null kraft er generelt forskjellig for hver løsning fylte kammer. - Etter oppnåelse av en andre kraft plateau, returnere fiber til kammeret inneholdende den avslappende løsningen. Testing er nå fullført. For å teste flere fibrene under ett session aspirer alle løsninger og legge til nye, kjølt løsninger.
Merk: Brenner sykkel protokoller bør vurderes når utløse maksimal riene over en lengre periode. Denne protokollen har vist seg å bevare strukturelle og mekaniske egenskaper i den maksimalt aktivert fiber 9.
Representative Results
Helsekost, kjemisk permeabiliserte enkeltfibre skal vises ensartet i form og har konsekvent striation avstands sett under høy forstørrelse. Fiber som er lite fleksible når manipulert med pinsett eller har åpenbare strukturelle skader skal kastes.
Høy forstørrelse digitale bilder tatt under trinn 15 blir analysert for fem sammenkoblede diameter målinger langs midsection av fiber. Fiber CSA er beregnet å anta en elliptisk tverrsnitt og i snitt fem individuelle CSA målinger som vist i figur 7A. Figur 7B tjener også til å illustrere hvordan fiberdimensjoner i en vis kan være vesentlig forskjellig sammenlignet med parede dimensjoner i den andre visningen (dvs. kryss Seksjonene er ikke generelt rundt).
Representative kraft traser fra humane langsomme og raske fibre er vist i figurene 8A og 8B, respektivt. Høyspentee utgangen fra kraft-transduseren er ervervet under en test og konvertert til kraften (Mn) ved hjelp av datainnsamling og analyse-programvare (LabVIEW). Figur 9 illustrerer fremgangsmåten som brukes til å vurdere maksimale virksomme kraft (F o), som er beregnet ved å subtrahere den kraft som kreves for å holde fiberen på optimal sarcomere lengde, mens i en avslappet tilstand (passiv kraft, F P), fra den største isometrisk kraft som utvikles under maksimal fiberaktivering (total kraft F T). Siden utgangen til kraft-transduser som tilsvarer null kraft er generelt forskjellig for hver av de forskjellige bade kamrene vi kort slakke fiber både i pre-aktiverende og aktivering løsninger for å fange null-kraft nivå i eksperimentell posten. Normalisering av den maksimale virksomme kraft av CSA fiber blir brukt til å generere mer informativ verdi av spesifikk styrke (SF o). Fordi det tar hensyn til CSA av fiber, SF o
Typiske kjennetegn ved sunn, voksen fibre fra Claflin et al. 2011 10 for menneske, Mendias et al. 2011 1 for mus og Gumucio et al. 2012 2 for rotte er beskrevet i tabell 3. Alle data som presenteres i tabell 3 ble generert ved hjelp av teknikker som er beskrevet i denne artikkelen.
| Menneskelig (Vastus lateralis) | Mus (EDL) | Rat (Infraspinatus) | ||||
| Mann | Kvinne | Mann | Mann | |||
| Type 1 | Type 2a | Type 1 | Type 2a | (Ikke skrevet) | (Ikke skrevet) | |
| CSA (mikrometer 2) | 4880 - 6900 | 5270 - 8380 | 3870 - 5470 | 4010 - 5610 | 1850 - 3080 | 5290 - 8010 |
| F o (MN) | 0,79 til 1,17 | 1,02 til 1,54 | 0,64 til 0,97 | 0,71 til 1,07 | 0,14 til 0,25 | 0,55 til 0,97 |
| SF o (kPa) | 142-182 | 165-210 | 156-193 | 172-214 | 67-94 | 102-131 |
| n | 129 | 160 | 149 | 207 | 37 | 94 |
Tabell 3. Typiske kjennetegn ved sunne, voksne fibre fra menneskelig vastus lateralis 10, mus extensor digitorum longus 1 og rotte infraspinatus to muskler. Optimale sarcomere lengder ble satt til 2,7 mikrometer for menneske fibre 7,8 og 2,5 mikrometer for både mus (36, 37) og rotte fibre (38). Eksperimentell L f områder (25 th og 75 th kvartiler) var 1,39 til 1,73 mm, 1,17 til 1,53 mm og 1,32 til 1,59 mm for menneske, mus og rotte hhv. Serier vist indikere den 25. og 75 th kvartiler og n er antall fibre testet.
De vanligste problemene under testing inkluderer en sutur løkke slip, noe som resulterer i en kraft response med en "fange" slik som den som illustrert i figur 10A, og en delvis eller full tykkelse rift i fiberen, noe som resulterer i en kraft som svar som returnerer brått mot eller (break) null mens fiberen fremdeles er neddykket i aktiveringsoppløsningen (Figur 10B). Hvis det oppstår en slip, tåre eller pause under et eksperiment, bør fiber kastes og dataene ekskludert, men å opprettholde en registrering av fiberbrudd kan også være informativ 11. Et annet negativt resultat som kan oppstå er det for tidlig aktivering av fiberen, mens i den pre-aktiverende oppløsning (figur 10C). Delvis aktivering i pre-aktiverende oppløsning antyder signifikant kryssforurensning godt (dvs. en utilsiktet økning i kalsiumkonsentrasjonen i den pre-aktiverende brønn). I dette tilfelle må alle bad aspireres og skylles godt med deionisert vann. Tørking skilleflatene mellom kamrene er også anbefalingended som fuktighet eller kondens i disse områdene kan føre til fukttransporterende løsning mellom bad. Beslutningen om å inkludere eller ekskludere data vil til slutt avhenge av den eksperimentelle fokus og bør derfor tas hensyn til ved utformingen av studien.
Figur 1: Sutur loop (10-0 monofilament nylon sutur).
Figur 2:. Bundle disseksjon tang er i venstre hånd, mikrodisseksjon saks er i høyre hånd. Rød linje viser den gunstige orientering av håndleddet og saks med de langsgående aksene av fibrene.
Figur 3: (A) Testing apparat med merkede komponenter. (A) Eksperimentelle kamre med gjennomsiktig bunn. (B) Lengde-regulator. (C) Force-svinger. (D) lyskilde. (E) Lengde-kontrolleren xyz mikrometer drive med digitalt display. (F) Stage mikrometer drive med digitalt display. (G) Force-svinger xyz mikrometer stasjonen. (H) Plattform for kalibrert laser-diffraksjon target skjermen. (I) Vibrasjonsisolerende tabell. (B) Nærbilde av forsøkskamrene. (J) Rustfritt stål festeflate som strekker seg fra lengde-regulator. (K) Rustfritt stål festeflate som strekker seg fra den kraft-transducer. (L) Side prisme. (M) Boliger for termoelektriske kjølemoduler. (N) Termo for rapportering kammer temperature.
Figur 4: Modifisert 100 ul pipette tips brukes til å overføre fiber fra disseksjon rett til eksperimentell kammeret.
Figur 5:. Montering enkelt fiber på eksperimentelle enheter (A) utarbeidet sutur løkker tredd på rustfritt stål festeflater. (B) Fiber overført til eksperimentell kammeret. (C) Fiber forankret til rustfritt stål festeoverflater ved første par av sutur sløyfer med overskudd av sutur fjernet. (D) Second par sutur loops gjengede over toppen av første sutur sløyfer og bundet på plass.
Figur 6: sarcomere lengde bestemmes ved projeksjon av en laser interferensmønster på en kalibrert target skjerm (a) laserkilde.. (B) Mirror. (C) Target skjerm. (D) laserinterferensmønster.
Figur 7: (A) Bestemmelse av fiber tverrsnittsareal ved optimal sarcomere lengde (human = 2,7 pm). Forutsatt et elliptisk tverrsnitt, er CSA beregnes for hver av fem steder langs fiberen midtseksjonen og gjennomsnittet av de fem individuelle målinger rapporteres som fiber CSA. 2a representerer ovenfra diameter og er en akse av ellipsen, representerer 2b sideriss diameter, og den andre aksen av ellipsen. (B) Representative fiber bilder som illustrerer hver av de fem tilsvarende diameter målinger tatt i både toppen og fra siden.
Figur 8: Representative force spor fra sunt menneske vastus lateralis muskelfibre (A) Type 1 fiber (CSA: 5710 mikrometer 2, F o: 0,89 mN og SF o: 156 kPa).. (B) Type 2a fiber (CSA: 9510 mikrometer 2, F o: 1,66 mN og SF o: 174 kPa). Fiber myosin tung kjede typen ble bestemt ved bruk av elektroforetiske separasjon og sølv-farging 22 teknikker.
oad / 52695 / 52695fig9.jpg "/>
Figur 9: Beregning av maksimal virksomme kraft (F o) (a) Utvidet visning av fiberstyrken respons under slakk-induserende bevegelse av lengde-regulator initiert i pre-aktiverende oppløsning.. F P er den kraft som kreves for å opprettholde en sarcomere lengde på 2,7 um med fiberen i ro. (B) Utvidet visning av lengde-kontrolleren slakk-induserende bevegelse. Vær oppmerksom på at F o = F T - F P.
Figur 10: (A) søm løkke slip, dokumentert av en "fange" i kraft spor under fremveksten av kraft. Sjekk for å være sikker på sløyfer er sikre før du aktiverer fiber. (B) Fiber pause under aktivering. Kan skyldes dårlig fiber integritet eller aggressiv fiber behandling under sutur sløyfe stedment. (C) For tidlig delvis fiberaktivering på grunn av forurensning av pre-aktivering kammer med Ca 2+.
Discussion
Vurdering av kontraktile egenskaper av permeabiliserte enkeltskjelettmuskelfibre er brukt til å undersøke muskelfunksjonen i en rekke sammenhenger. Eksempler på dette er studier som har evaluert effekten av aldring 12, mosjon 10,13,14, romfart 15, skader 2,3,16, medikamentelle behandlinger 17,18, sykdoms 19 og genetisk manipulasjon 20,21 på fiber struktur og funksjon. På grunn av evnen til å vurdere den direkte kontraktile utførelsen av myofibriller i sin opprinnelige konfigurasjon, gir denne teknikken en attraktiv plattform for å danne en forståelse av myofibrillære funksjon fraværende av potensielt samvirkende effekter som er til stede når neuromuskulær signaloverføring og eksitasjon-indusert kalsium-frigjøring inngår i systemet som studeres. Dessuten kan funksjonstesting av enkle fibre benyttes til å komplettere kontraktile protein identifikasjon resultater som de som erinnhentet gjennom immunhistokjemi eller gel elektroforese + western blot 22.
En av de primære funksjonene til skjelettmuskulatur er å generere kraft. Følgelig SF O, er et mål på den iboende kraft frembringes av et et kontraktile system, er av stor interesse for muskel fysiologer. Pålitelige estimater av SF o krever nøyaktige målinger av både fiber CSA og F o. Siden fibrene er, generelt, verken sirkulær i tverrsnitt, og heller ikke ensartet i CSA langs sin lengde, stor forsiktighet bør utvises ved estimering CSA. For dette formål blir det foretatt målinger på flere steder langs lengden av fiberen, og på hvert sted, fra to perspektiver adskilt med 90 °. Pålitelige målinger av F o krever oppmerksomhet til flere detaljer, inkludert regnskap for passiv kraft, justere sarcomere lengde for å maksimere overlapping av tykke og tynne filamenter, ansette en aktiverende løsning med en kalsiumkonsentrasjon tlue resulterer i maksimal aktivering, å opprettholde den ønskede forsøkstemperatur, og å opprettholde optimale lagringsbetingelser (temperatur og varighet) av fibrene før dagen for forsøket.
Mens du fremgangsmåten her beskriver framgangsmåten for å vurdere maksimal isometrisk kraft, er det ofte ønskelig å vurdere andre viktige funksjonelle kvaliteter av skjelettmuskelfibre. Dette kan oppnås ved å forlenge forsøksprotokollen for å inkludere flere mekaniske manipulasjoner av fiberen. For eksempel, tillater måling av hastigheten ved hvilken fiber forkorter mot en rekke forskjellige belastninger bestemmelse av styrken-hastighetsforhold, fra hvilken kraft-kraft og hastighet-effektforhold kan beregnes 10,23,24. I tillegg kan hastigheten til ubelastet forkortning bli bestemt ved å anvende "slakk test" 25, som består av å bruke en serie av slakk-induserende forkorting trinn og measuring av tiden som kreves av fiberen for å fjerne slakk. En annen kinetic parameter som ofte rapporteres er k st, hastighetskonstanten for kraft utbygging etter en mekanisk forstyrrelse som midlertidig løsner all crossbridges 26. Endelig er forholdet mellom kalsiumkonsentrasjon og virksomme kraft generasjonen (den "force-PCA-forholdet") ofte av interesse 18, og kan bestemmes ved å utsette fiberen for en serie løsninger med kalsiumkonsentrasjoner som strekker seg fra under terskelen for aktivering av kontraktile system til de som er tilstrekkelig til å fremkalle maksimal aktivering og derfor maksimal kraft (F o).
Selv om mye av det nevnte utstyr er nødvendig for å vurdere enkelt fiber kontraktilitet, er annet utstyr som ikke er absolutt nødvendig. Lengden-kontrolleren, for eksempel, er viktig for enhver forsøksprotokoll som krever rask og nøyaktig forlengelse eller forkortning av fiberen,men er ikke absolutt nødvendig for å vurdere maksimal isometrisk kraft (selv om en null-kraft nivå i kraft plate må likevel bli identifisert ved noen midler). De prismer som tillater observasjon av fiberen fra siden, mens nyttig for å vurdere tverrsnittsareal, er ikke absolutt nødvendig ved plassering av fiberen inne i forsøkskammeret. Videre betyr alternativ for å utsette fiberen for de forskjellige eksperimentelle løsningene kan bli benyttet, inkludert utarbeide et manuelt operert system av kamre eller et enkelt kammer som gir mulighet for rask fylling og tømming av løsninger. Til slutt, mens under eksperimentelle fysiologiske temperaturer slik som 15 ° C er vanligvis brukt til å forbedre reproduserbarheten av målingene mekaniske 1,2,3,5,8,12,17,27, er det mulig å generere gyldige data ved andre temperaturer 23 , 28 så lenge effekten av temperaturen på løsningsegenskaper (kalsiumkonsentrasjon, pH, etc.) blir tatt hensyn til. Sammensetningen av testing løsninger er blant de mest kritiske aspekter av permeabiliserte fiber teknikker beskrevet her. Betraktninger vedrørende løsningssammensetning er komplekse og utenfor omfanget av denne artikkelen. Løsningene som er beskrevet i trinn 5 i protokollen seksjonen er utformet med en vekt på hurtig aktivering av permeabilisert fiber på dens overføring fra pre-aktivering for å aktivere løsninger og samtidig opprettholde en konstant ionisk styrke, kationiske sammensetning, og osmolaritet 6,29. Andre tilnærminger til løsning sammensetning har vært ansatt med betydelig suksess med andre forskningsmiljøer og vanligvis gjøre bruk av publiserte bindende konstanter og dataverktøy 27,30,31. Konsentrasjonen av kalsiumioner i de forskjellige aktiverings løsningene er spesielt viktig i studier som involverer submaksimal aktivering slik som kraft-PCA evalueringer. For eksperimenter hvor fibrene er fullstendig aktivert, slik som de beskrived her, kalsiumkonsentrasjonen i den aktiverende oppløsning vanligvis overstiger med god margin som kreves for å oppnå maksimal styrke, noe som gjør dens presis kunnskap mindre kritisk. Tilsetning av kreatinfosfat er viktig for bufring av intramyofibrillar ATP og ADP svingninger som ellers ville være forbundet med kontraktile aktivitet. Kreatin kinase er nødvendig for å katalysere overføringen fosfat fra kreatinfosfat til ADP. Under eksperimentelle betingelser som medfører høy ATP omløpshastighet, inkludert arbeider ved høye temperaturer eller ved å måle med høy hastighet matfett i raske fibre 32, må kreatinkinase tilsettes til oppløsningen for å supplere endogen kreatin kinase som forblir bundet til fibrene. For mindre krevende eksperimentelle betingelser, er ATP-regenerering systemet 27 mindre kritisk.
Begrensninger av permeabilized enkelt fiber teknikken inkluderer følgende. De data som genereres av disse testene definererkontraktile egenskaper av den spesifikke myofibrillære enhet som var festet til den eksperimentelle apparater. Følgelig tar denne bare en liten brøkdel av hele multinucleated fiber fra hvilket segment ble oppnådd som i sin tur utgjør en liten brøkdel av det totale antall fibre i muskelen. Etterforskerne bør derfor vurdere nøye prøvetaking er nødvendig for å støtte noen konklusjoner trukket fra forsøkene. I tillegg evaluere virkningen av en trening intervensjon på fiber funksjon forutsetter at de evaluerte Fibrene ble faktisk rekruttert i løpet av treningen. Selv protokollen forsøker å etterligne den naturlige intracellulære miljøet av fiberen, er det sarcolemma permeabilization prosessen ikke-spesifikk og gir nødvendigvis oppløselige intracellulære bestanddeler til fritt diffundere inn i bade løsninger. En ytterligere konsekvens av membranens permeabilitet er en endring i den osmotiske balanse bevises ved en svelling i fibervolum 33. Denfiber svellingen øker avstanden mellom actin og myosin filamenter som resulterer i nedsatt følsomhet av kalsium myofilament systemet 34,35, men kan reverseres ved innføring av store, osmotisk aktive forbindelser 34. En endelig begrensning å vurdere er konsekvens av den teknikk som brukes til å feste fibrene til den eksperimentelle apparater. Dette krever alltid å forvrenge romlige forhold i det filament system ved og i nærheten av festepunkter, med stede funksjonsproblemer. Nærmere bestemt blir de områder av fiberen på og tilstøtende til festepunktene funksjonelt kompromittert, og derved bidra artifactual serie elastisitet til målesystemet.
Oppsummert har vi beskrevet et middel for å vurdere kraft-kapasitet på kjemisk permeabiliserte skjelettmuskelfibre in vitro. Selv om fokuset i denne artikkelen har vært på vurdering av maksimal isometrisk kraft frembringelseg kapasitet på menneskeskjelettmuskelfibre, kan den eksperimentelle metode modifiseres og utvides for å bestemme en rekke kinetiske parametre og forhold over et område av pattedyrarter, eller på annen måte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene culture test tube with cap | Fisher Scientific | 14-956-3D | |
| 0.5 ml screw cap microcentrifuge | Fisher Scientific | 02-681-334 | |
| 0.5 ml microcentrifuge caps with o-ring | Fisher Scientific | 02-681-358 | |
| Microcentrifuge cryobox | Fisher Scientific | 5055-5005 | |
| pH meter | Mettler-Toledo | FE20 | |
| Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| Nonsterile-suture 10-0 monofilament | Ashaway Line Twine | S30002 | |
| Insect pins | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Forceps - Dumont #5 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Microdissecting scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | |
| Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | |
| Micrometer drives | Parker Hannifin | 3936M | |
| Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
| Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
| Temperature controller | Aplha Omega Instruments | Series 800 | |
| LabVIEW software | National Instruments | - | |
| Computer | Varied | - | |
| Chamber system | Aurora Scientific | 802D | |
| Length-controller | Aurora Scientific | 312C | |
| Force-transducer | Aurora Scientific | 403A | |
| Reagents | |||
| K-proprionate | TCI America | P0510 | |
| Imadizole | Sigma-Aldrich | I0125 | |
| MgCl2•6H20 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Brij 58 | Sigma-Aldrich | P5884 | |
| EGTA (acid) | Sigma-Aldrich | E0396 | |
| Na2H2ATP•0.56H2O | Sigma-Aldrich | A7699 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G6279 | |
| HEPES (acid) | Sigma-Aldrich | H7523 | |
| MgO | Sigma-Aldrich | 529699 | |
| HDTA (acid) | TCI America | D2019 | |
| CaCO3 | Sigma-Aldrich | C4830 | |
| NaN3 | Sigma-Aldrich | S8032 | |
| KOH (1 N) | Sigma-Aldrich | 35113 | |
| HCL (1 N) | Sigma-Aldrich | 318949 | |
| Na2CrP•4H2O | Sigma-Aldrich | P7936 | |
| pH 10 standard | Fisher Scientific | SB115 | |
| pH 7 standard | Fisher Scientific | SB107 | |
References
- Mendias, C. L., Kayupov, E., Bradley, J. R., Brooks, S. V., Claflin, D. R. Decreased specific force and power production of muscle fibers from myostatin-deficient mice are associated with a suppression of protein degradation. J Appl Physiol. 111 (1), 185-191 (2011).
- Gumucio, J. P., Davis, M. E., Bradley, J. R., Stafford, P. L., Schiffman, C. J., Lynch, E. B., Claflin, D. R., Bedi, A., Mendias, C. L. Rotator cuff tear reduces muscle fiber specific force production and induces macrophage accumulation and autophagy. J Orthop Res. 30 (12), 1963-1970 (2012).
- Mendias, C. L., Roche, S. M., Harning, J. A., Davis, M. E., Lynch, E. B., Sibilsky Enselman, E. r, Jacobson, J. A., Claflin, D. R., Calve, S., Bedi, A. Reduced muscle fiber force production and disrupted myofibril architecture in patients with chronic rotator cuff tears. J Shoulder Elbow Surg. 1 (4), 111-119 (2015).
- Moss, R. L. Sarcomere length-tension relations of frog skinned muscle fibres during calcium activation at short lengths. J Physiol. 292, 177-192 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effects of pH on contraction of rabbit fast and slow skeletal muscle fibers. Biophys J. 53, 935-946 (1988).
- Moisescu, D. G., Thieleczek, R. Calcium and strontium concentration changes within skinned muscle preparations following a change in the external bathing solution. J Physiol. 275, 241-262 (1978).
- Walker, S. M., Schrodt, G. R. I Segment lengths and thin filament periods in skeletal muscle fibers of the Rhesus monkey and the human. Anat Rec. 178, 63-81 (1974).
- Gollapudi, S. K., Lin, D. C. Experimental determination of sarcomere force-length relationship in type-1 human skeletal muscle fibers. J Biomech. 42, 2011-2016 (2009).
- Brenner, B. Technique for stabilizing the striation pattern in maximally calcium-activated skinned rabbit psoas fibers. Biophys J. 41 (1), 99-102 (1983).
- Claflin, D. R., et al. Effects of high and low-velocity resistance training on the contractile properties of skeletal muscle fibers from young and older humans. J Appl Physiol. 111, 1021-1030 (2011).
- Lynch, G. S., Faulkner, J. A., Brooks, S. V. Force deficits and breakage rates after single lengthening contractions of single fast fibers from unconditioned and conditioned muscles of young and old rats. Am J Physiol Cell Physiol. 295, C249-C256 (2008).
- Frontera, W. R., Rodriguez Zayas, A., Rodriguez, N. Aging of human muscle: understanding sarcopenia at the single muscle cell level. Phys Med Rehabil Clin N Am. 23, 201-207 (2012).
- Malisoux, L., Francaux, M., Theisen, D. What do single-fiber studies tell us about exercise training. Med Sci Sports Exerc. 39 (7), 1051-1060 (2007).
- Widrick, J. L., Stelzer, J. E., Shoepe, T. C., Garner, D. P. Functional properties of human muscle fibers after short-term resistance exercise training. Am J Physiol Regulatory Integrative Comp Physiol. 238, 408-416 (2002).
- Trappe, S. Effects of spaceflight, simulated spaceflight and countermeasures on single muscle fiber physiology. J Gravit Physiol. 9 (1), 323-326 (2002).
- Malisoux, L., Jamart, C., Delplace, K., Nielens, H., Francaux, M., Thiesen, D. Effect of long-term muscle paralysis on human single fiber mechanics. J Appl Physiol. 102, 340-449 (2006).
- Krivickas, L. S., Walsh, R., Amato, A. Single muscle fiber contractile properties in adults with muscular dystrophy treated with MYO-029. Muscle Nerve. 39, 3-9 (2009).
- Russell, A. J., et al. Activation of fast skeletal muscle troponin as a potential therapeutic approach for treating neuromuscular diseases. Nature Medicine. 18 (3), 352-356 (2012).
- Krivickas, L. S., Yang, J. I., Kim, S. K., Frontera, W. R. Skeletal muscle fiber function and rate of disease progression in amyotrophic lateral sclerosis. Muscle Nerve. 26, 636-643 (2002).
- Mendias, C. L., Marcin, J. E., Calerdon, D. R., Faulkner, J. A. Contractile properties of EDL and soleus muscles of myostatin-deficient mice. J Appl Physiol. 101, 898-905 (2006).
- Lynch, G. S., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Faulkner, J. A. Contraction-induced injury to single permeabilized muscle fibers from mdx, transgenic mdx and control mice. Am J Physiol Cell Physiol. 279, 1290-1294 (2000).
- Mizunoya, Q., Wakamatsu, J., Tatsumi, R., Ikeuchi, Y. Protocol for high-resolution separation of rodent myosin heavy chain isoforms in a mini-gel electrophoresis system. Anal Biochem. 377, 111-113 (2008).
- Hill, A. V. The heat of shortening and the dynamic constants of muscle. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 126, 136-195 (1938).
- Bottinelli, R., Canepari, M., Pellegrino, M. A., Reggiani, C. Force-velocity properties of human skeletal muscle fibres: myosin heavy chain isoform and temperature dependence. J Physiol. 495, 573-586 (1996).
- Edman, K. A. The velocity of unloaded shortening and its relation to sarcomere length and isometric force in vertebrate muscle fibres. J Physiol. 291, 143-159 (1979).
- Brenner, B., Eisenberg, E. Rate of force generation in muscle: Correlation with actomyosin ATPase activity in solution. PNAS. 83, 3542-3546 (1986).
- Moss, R. L. The effect of calcium on the maximum velocity of shortening in skinned skeletal muscle fibres of the rabbit. J. Muscle Res. Cell Motil. 3, 295-311 (1982).
- Pate, E., Wilson, G. J., Bhimani, M., Cooke, R. Temperature dependence of the inhibitory effects of orthovanadate on shortening velocity in fast skeletal muscle. Biophys J. 66, 1554-1562 (1994).
- Ashley, C. C., Moisescu, D. G. Effect of changing the composition of the bathing solutions upon the isometric tension-pCa relationship in bundles of crustacean myofibrils. J Physiol. 270, 627-652 (1977).
- Godt, R. E. Calcium-activated tension of skinned muscle fibers of the frog. Dependence on magnesium adenosine triphosphate concentration. J Gen Physiol. 63, 722-739 (1974).
- Fabiato, A., Fabiato, F. Calculator programs for computing the composition of the solutions containing multiple metals and ligands used for experiments in skinned skeletal muscle cells. Journal de Physiologie (Paris). 75, 463-505 (1979).
- Chase, P. B., Kushmerick, M. J. Effect of physiological ADP concentrations on contraction of single skinned fibers from rabbit fast and slow muscles). Am J Physiol. 268, C480-C489 (1995).
- Godt, R. E., Maughan, D. W. Swelling of skinned muscle fibers of the frog. Biophysical Journal. 19, 103-116 (1977).
- Kawai, M., Wray, J. S., Zhao, Y. The effect of lattice spacing change on cross-bridge kinetics in chemically skinned rabbit psoas muscle fibers. Biophys J. 64, 187-196 (1993).
- Millman, B. M. The filament lattice of striated muscle. Physiol Rev. 78 (2), 359-391 (1998).
- Edman, K. A. Contractile properties of mouse single muscle fibers, a comparison with amphibian muscle fibers. J Exp Biol. 208, 1905-1913 (2005).
- Phillips, S. K., Woledge, R. C. A comparison of isometric force, maximum power and isometric heat rate as a function of sarcomere length in mouse skeletal muscle. Pflügers Archiv. 420, 578-583 (1992).
- Stephenson, D. G., Williams, D. A. Effects of sarcomere length on the force-pCa relation in fast and slow-twitch skinned muscle fibres from the rat. J Physiol. 333, 637-653 (1982).
