The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
जिगर sinusoidal endothelial कोशिकाओं (LSECs) अत्यधिक यकृत sinusoid की दीवार है कि रेखा विभेदित endothelial कोशिकाओं रहे हैं। LSECs गैर diaphragmed हैं कि fenestrations के साथ छिद्रित कर रहे हैं, transcellular व्यास में 50-250 एनएम pores। LSECs की सतह का 20% तक चलनी प्लेटें 1-3 (चित्रा 1) कहा जाता सैकड़ों करने के लिए दसियों के समूह में आम तौर पर कर रहे हैं, जो fenestrations, द्वारा कवर किया जाता है। Fenestrations एक अत्यधिक कुशल ultrafiltration प्रणाली बनाने, प्लाज्मा और रक्त और hepatocytes के बीच nanosubstrates के हस्तांतरण की अनुमति है। Fenestrations गतिशील संरचनाओं हैं – उनके आकार और / या संख्या दोनों विभिन्न शारीरिक राज्यों, दवाओं, और रोग के जवाब में बदला जा सकता है। उदाहरण के लिए, fenestrations फेड राज्य में 4 से अधिक का उपवास में बड़े होते हैं; सेल उम्र बढ़ने और कई रोग राज्यों 7-13 में होता प्रति 5,6 और आकार में कमी और fenestrations की संख्या, 2-डि-iodoamphetamine गवाक्षीकरण संख्या बढ़ जाती है </sup>। Fenestrations की संख्या और आकार की सही माप LSEC आकृति विज्ञान विभिन्न रोग, जहरीले, और शारीरिक राज्यों से प्रभावित है कि कैसे को समझने के लिए महत्वपूर्ण है; जिगर समारोह पर उनके प्रभाव; और विकसित करने के लिए उपचारात्मक उपायों 1 गवाक्षीकरण-modulating।
fenestrations के अध्ययन के लिए मुश्किल है। बरकरार जिगर ऊतक या सुसंस्कृत LSECs में दोनों पहले से ही अवलोकन का उपयोग कर इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी संभव हो गया है इसलिए fenestrations के व्यास, पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी के संकल्प के नीचे स्थित है। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) सबसे अधिक बार, SEM के हजारों के endothelial सतह और माप के बड़े क्षेत्रों के अवलोकन के लिए अनुमति देता है क्योंकि गवाक्षीकरण आकार, आवृत्ति और porosity (fenestrations द्वारा छिद्रित है कि LSEC झिल्ली का प्रतिशत) का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है नहीं दसियों fenestrations के हजारों की है। इसकी उपयोगिता के बावजूद, से रिपोर्ट कर रहे हैं, जो परिणामों के लिए पढ़ाई में SEM आधारितऐसे गवाक्षीकरण आकार, संख्या, आवृत्ति और porosity के रूप में LSEC मापदंडों साहित्य (1 टेबल) में व्यापक रूप से भिन्न हो।
Fenestrations और चलनी प्लेटें अनुबंध, तोड़ चौड़ा करना या नमूना तैयार करने के दौरान संगठित होना है कि कमजोर संरचनाओं हैं, इस प्रकार सावधान प्रसंस्करण उनके अखंडता की रक्षा करने की जरूरत है। ऊंचा छिड़काव दबाव 14; लगानेवाला और buffers 15 की गलत परासारिता; अपर्याप्त निर्धारण या निर्धारण समय; और बाद के निर्धारण के निर्जलीकरण और सुखाने की गति फैटी के संरक्षण के साथ हस्तक्षेप है कि कलाकृतियों (चित्रा 2) का उत्पादन हो सकता है कि SEM के लिए प्रसंस्करण के सभी क्षेत्रों रहे हैं। Fenestrations की हानि ('defenestration') और गवाक्षीकरण दबाव कम गवाक्षीकरण व्यास और सेल सरंध्रता, जिसके परिणामस्वरूप गरीब निर्धारण का एक परिणाम के रूप में हो सकता है। SEM के विश्लेषण के लिए नमूनों के संरक्षण में सुधार करने के तरीके में पहले 15-17 वर्णित किया गया है और चर्चा की जाएगीयहाँ नमूना संरक्षण को सुधारने के लिए अतिरिक्त सुझावों के साथ। नमूना संरक्षण के मुख्य लक्ष्यों LSEC की सतह से देखे जा सकते हैं ताकि sinusoids से खून निकालने के लिए और उच्च दबाव में देरी या नियतन से या तो LSEC क्षति से बचने के लिए कर रहे हैं। पोर्टल शिरा के माध्यम से लगानेवाला के पूरे जिगर छिड़काव जिगर निर्धारण के लिए पसंदीदा तरीका है। विस्तार में वर्णित के रूप में कहीं 16,18 छिड़काव कम दबाव पर किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए एच 2 0 से 10 सेमी) LSEC करने के लिए दबाव से संबंधित छिड़काव कलाकृतियों और नुकसान से बचने के लिए, आम तौर पर कोशिका झिल्ली में भीतर के रूप में बड़े अंतराल प्रकट। कहीं और 19 विस्तार से वर्णित के रूप में हालांकि, उचित निर्धारण अक्सर, मनुष्यों और पशुओं से जिगर बायोप्सी की सुई छिड़काव का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता है। रक्त के नमूने से बाहर प्लावित है जब तक इस तकनीक को सीधे ऊतक में लगानेवाला इंजेक्शन शामिल है और ऊतक फर्म और तय है। इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए नमूने के फिक्सेशन perf होने की जरूरत हैयकृत बहुत तेजी से autolytic प्रक्रियाओं का एक परिणाम के रूप में होने वाली ultrastructural परिवर्तन को रोकने के लिए रक्त के प्रवाह की समाप्ति के निम्नलिखित के रूप में संभव के रूप में जल्दी ormed।
हम यह भी कलाकृतियों को शामिल किए जाने को कम करता है, और fenestrations की माप के मानकीकरण कि छवि विश्लेषण का एक तरीका मौजूद है। Porosity और गवाक्षीकरण आवृत्ति के लिए micrographs के लिए sinusoids के चयन में भिन्नता है, कलाकृतियों की छवि विश्लेषण, और सेल क्षेत्र की माप प्रकाशित परिणामों में प्रमुख विसंगतियों के लिए नेतृत्व किया। मूल्यांकन और fenestrations और डेटा प्रस्तुति के लिए न्यूनतम आवश्यकताओं की माप के लिए एक मानकीकृत दृष्टिकोण स्पष्ट रूप से पहले से 4,10,20-31 साहित्य में संबोधित नहीं किया गया है।
सही ढंग से और reproducibly जिगर sinusoidal अन्तःचूचुक की स्थिति को मापने की क्षमता इन अति विशिष्ट कोशिकाओं के जीव विज्ञान को समझने में एक महत्वपूर्ण कदम है। ऐसे संरचित रोशनी माइक्रोस्कोपी 32, परमाणु शक्ति माइक्र?…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
Ketamine | Must be optained under licence | ||
Xylazine | Must be obtained under licence | ||
Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |