The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
תאי הכבד סינוסי האנדותל (LSECs) הם מאוד תאי האנדותל מובחנים המרפדים את הקיר של סינוסואידה הכבד. LSECs הם מחוררים עם fenestrations ש- diaphragmed עישון, transcellular נקבוביות 50-250 ננומטר בקוטר. עד 20% מהשטח של LSECs מכוסה על ידי fenestrations, שהם בדרך כלל בקבוצות של עשרות עד מאות נקראים צלחות מסננת 1-3 (איור 1). Fenestrations לאפשר העברה של פלזמה וnanosubstrates בין הדם וhepatocytes, יצירת מערכת אולטרה סינון יעילה ביותר. Fenestrations הם מבנים דינמיים – שניהם בגודל ו / או מספר ניתן לשנות בתגובה למצבים שונים פיסיולוגיים, תרופות, ומחלות. לדוגמא, fenestrations גדול יותר בצם מאשר במדינה נמאס 4; 2-די-iodoamphetamine מגדיל מספר אשנוב; 5,6 וירידה בגודל ובמספר fenestrations לכל תא מתרחש במדינות הזדקנות ומחלות רבות 7-13 </sup>. מדידה מדויקת של הגודל ומספר fenestrations חשובה להבנה כיצד מורפולוגיה LSEC מושפעת מחלה שונות, רעילה, ומדינות פיסיולוגיות; ההשפעה שלהם על תפקוד כבד; ולפיתוח אשנוב-ויסות התערבויות טיפוליות 1.
המחקר של fenestrations קשה. הקוטר של fenestrations נמצא מתחת לרזולוציה של מיקרוסקופ אור הרגילה, כך במיקרוסקופ אלקטרונים רק בעבר תצפית באמצעות שני בLSECs רקמת כבד או מתורבתת שלם היה אפשרי. מיקרוסקופ האלקטרונים הסורקים (SEM) יש בתדירות הגבוהה ביותר נעשה שימוש כדי ללמוד גודל אשנוב, תדירות ונקבובית (אחוז קרום LSEC שהוא מחורר ידי fenestrations) כי SEM מאפשר התצפית של שטחים גדולים של פני השטח האנדותל והמדידה של אלפים, אם לא עשרות אלפים fenestrations. למרות השירות שלה, את התוצאות המדווחים מSEM מבוססות מחקרים לפרמטרים LSEC כגון גודל אשנוב, מספר, תדירות ונקבובית להשתנות במידה רבה בספרות (טבלת 1).
Fenestrations וצלחות מסננת הן מבנים שבריריים שחוזה, לשבור, להתרחב או להתגבש במהלך הכנת דגימה, יש צורך בעיבוד ובכך הקפיד לשמור על שלמותם. לחץ זלוף גבוה 14; osmolarity שגויה של מקבע ומאגרים 15; קיבעון לקוי או קיבעון זמן; ומהירות של התייבשות לאחר קיבוע-וייבושם בכל תחומי העיבוד לSEM שעשוי לייצר חפצים המפריעים לשימור ultrastructure (איור 2). אובדן fenestrations ('defenestration') והצטמקות אשנוב יכול להתרחש כתוצאה מקיבעון עני, וכתוצאה מכך קוטר אשנוב מופחת ונקבובי תא. שיטות כדי לשפר את השימור של דגימות לניתוח SEM תוארו בעבר 15-17 ותידוננהכאן עם טיפים נוספים על איך לשפר את שימור דגימה. המטרות העיקריות של שימור הדגימה הן להסיר דם מsinusoids כך את פני השטח של LSEC ניתן דמיינו וכדי למנוע נזק LSEC משני בלחץ גבוה או קיבעון מתעכב. זלוף הכבד השלם של מקבע דרך וריד הפורטל הוא השיטה המועדפת לקיבוע כבד. כפי שתואר בפירוט במקום אחר 16,18 זלוף חייבת להתבצע בלחץ נמוך (למשל 10 סנטימטר של H 2 0), כדי למנוע חפצי זלוף הקשורים ללחץ ונזק לLSEC, בא לידי ביטוי בדרך כלל פערים גדולים כמו בקרום התא. עם זאת, לעתים קרובות ניתן להשיג קיבעון סביר באמצעות זלוף מחט של ביופסית כבד מבני האדם ובעלי חיים, כפי שתואר בפירוט במקום אחר 19. טכניקה זו כרוכה בהזרקה ישירות מקבעת לתוך הרקמה עד דם סמוק מתוך המדגם והרקמות היא מוצקות וקבוע. קיבוע של דגימות למיקרוסקופ אלקטרונים צריך להיות Performed מהר ככל האפשר הבא הפסקת זרימת דם למניעת שינויי ultrastructural מתרחשים כתוצאה מתהליכי הכבדים autolytic מאוד מהירים.
כמו כן, אנו מציגים שיטה של ניתוח תמונה שממזער את ההכללה של חפצים, וסטנדרטיזציה מדידת fenestrations. וריאציה בבחירת sinusoids לmicrographs, ניתוח תמונה של חפצים, ומדידה של שטח תא לתדר נקבוביות ואשנוב הובילו לפערים גדולים בתוצאות שפורסמו. גישה סטנדרטית להערכה ומדידה של fenestrations ודרישות מינימום להצגת נתונים שלא טופלה באופן ברור בספרות בעבר 4,10,20-31.
היכולת מדויקת וreproducibly למדוד את מעמדו של האנדותל סינוסי הכבד היא צעד חשוב בהבנת הביולוגיה של תאים מאוד מיוחדים אלה. טכניקות חדשות כגון מיקרוסקופיה המובנה התאורה 32, מיקרוסקופיה כוח אטומית 33 וד-STORM (ישיר סטוכסטיים אופטי Reconstrucion מיקרוסקופית) 34 תהיה להקנ…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
Ketamine | Must be optained under licence | ||
Xylazine | Must be obtained under licence | ||
Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |