Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi

doi: 10.3791/52698 Published: April 30, 2015
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Leveren sinusformede endotelceller (LSECs) er høyt differensierte endoteliale cellene som kler veggen av hepatisk sinusoid. LSECs er perforert med fenestrations som er ikke-diaphragmed, porer transcellulær 50-250 nm i diameter. Opp til 20% av overflaten på LSECs er dekket av fenestrations, som vanligvis er i grupper på titalls til flere hundre kalles sikteplatene 1-3 (figur 1). Fenestrations tillate overføring av plasma og nanosubstrates mellom blod og hepatocytter, og skaper en svært effektiv ultrafiltreringssystem. Fenestrations er dynamiske strukturer - både sin størrelse og / eller antall kan endres som følge av ulike fysiologiske tilstander, narkotika og sykdom. For eksempel fenestrations er større i fastende enn i matinntak 4; 2-di-iodoamphetamine øker fenestration nummer, 5,6 og en reduksjon i størrelse og antall fenestrations per oppstår celle i aldring og mange sykdomstilstander 7-13 1.

Studiet av fenestrations er vanskelig. Diameteren på fenestrations ligger under oppløsningen av konvensjonell lysmikroskopi, slik som tidligere bare observasjon ved hjelp av elektronmikroskopi i både intakte levervev eller kultur LSECs har vært mulig. Den scanning elektronmikroskop (SEM) har oftest vært brukt til å studere fenestrasjon størrelse, hyppighet og porøsitet (prosentandelen av LSEC membran som er perforert ved fenestrations) fordi SEM muliggjør observasjon av store områder av endoteloverflaten, og måling av tusener, hvis ikke titusenvis av fenestrations. Til tross for sin nytteverdi, resultatene som rapporteres fra SEM-baserte studier forLSEC parametere som fenestrasjon størrelse, antall og hyppighet porøsitet varierer mye i litteraturen (tabell 1).

Fenestrations og sil platene er skjøre strukturer som kontrakten brytes, dilate eller flyter sammen under prøven forberedelse, er derfor forsiktig behandling er nødvendig for å bevare sin integritet. Forhøyet perfusjonstrykket 14; feil osmolaritet av fiksativ og buffere 15; utilstrekkelig fiksering eller fiksering tid; og hastigheten av post-fiksering dehydrering og tørking, er alle områder av behandling for SEM som kan produsere gjenstander som interfererer med bevaring av ultrastruktur (figur 2). Tap av fenestrations ('defenestration') og fenestrasjon krymping kan oppstå som et resultat av dårlig fiksering, noe som resulterer i redusert fenestrasjon diameter og porøsitet. Metoder for å forbedre bevaring av prøver for SEM-analyse er blitt beskrevet tidligere 15-17 og vil bli diskuterther med flere tips om hvordan du kan forbedre prøven bevaring. Hovedmålene prøven bevaring er å fjerne blodet fra sinuskurver, slik at overflaten av LSEC kan visualiseres og for å unngå skade fra LSEC enten for høyt trykk eller forsinket fiksering. Hele lever perfusjon av fiksativ via portvenen er den foretrukne metoden for leveren fiksering. Som beskrevet i detalj et annet sted 16,18 perfusjon må foretas ved lavt trykk (for eksempel 10 cm H 2 0) for å unngå trykkrelaterte perfusjon gjenstander og skade på LSEC, typisk manifestert som store hull inne i cellemembranen. Imidlertid kan rimelig fiksering ofte oppnås ved anvendelse av nål perfusjon av leverbiopsi fra mennesker og dyr, som beskrevet i detalj et annet sted 19. Denne teknikk innebærer direkte injisering av fikseringsmiddel i vevet til blodet som tømmes ut av prøven, og vevet er fast og løst. Fiksering av prøver for elektronmikroskopi må være performed så raskt som mulig etter avslutning av blodstrømmen for å forhindre ultra endringer som skjer som et resultat av leveren ekstremt hurtige autolytiske prosesser.

Vi presenterer også en fremgangsmåte for bildeanalyse som minimerer inkludering av gjenstander, og standardiserer måling av fenestrations. Variasjon i valget av sinuskurver for mikrobilder, bildeanalyse av gjenstander, og måling av celleområdet for porøsitet og fenestrasjon frekvens har ført til store avvik i publiserte resultater. En standardisert metode for evaluering og måling av fenestrations og minimumskravene for datapresentasjon har ikke vært tydelig adressert i litteraturen tidligere 4,10,20-31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

MERK: Alle prosedyrer som involverer bruk av dyr blir utført i henhold til lokal lovgivning. Vårt arbeid er godkjent av Sydney Local Health District Animal Welfare Committee. De tillatte prosedyrene er beskrevet i dokumentasjonen prosjektet lisens og følge retningslinjer som sikrer velferden til dyret til enhver tid. Sikre etterlevelse av regelverket om dyreforsøk i landet der arbeidet utføres.

1. Protokoll for Forbereder EM fiksativ

  1. Til 100 ml av fikseringsmiddel, fremstille paraformaldehyd ved tilsetning av 2 g paraformaldehyd pulver til 25 ml destillert vann i en konisk kolbe, varme til 65 ° C under omrøring med en magnetrører.
    MERK: Glutaraldehyde, paraformaldehyde og natrium kakodylatbuffer er alle farlige stoffer og må alltid håndteres i fumehood.
  2. Heat på 65 ºC i 2 min så avkjøl. Hvis nødvendig, legge natronlut dropwise under omrøring for å fjerne oppløsningen helt.
    MERK: natriumhydroksid er farlig, vær forsiktig.
  3. Tilsett 10 ml av EM klasse lager glutaraldehyd, 50 ml 0,2 M natrium-kakodylat-buffer og 2 g sukrose og røres med magnetrører. Tilsett 2 ml 1,0 M CaCl2.
  4. Juster til pH 7,4 før å gjøre løsningen opp til 100 ml med destillert vann. Den endelige fikseringsmiddel inneholder 2,5% glutaraldehyd, 2% paraformaldehyd 2 mmol CaCl2, 2% sukrose i 0,1 M kakodylatbuffer. Sørge for at total Osmolalitet er 440 mOsmol / L. Brukes innen 24 timer forberedelse.

2. Perfusjons Fixation of Liver

  1. Varm perfusjon buffer og fiksativ til 35-37 ºC. Den riktige temperatur for blodtapping buffer og festing hjelper til å sikre vev integritet.
  2. Bedøver dyr med en enkel intraperitoneal injeksjon av 50 mg / kg Ketamin og 5 mg / kg xylazin.
  3. Når dyret er i henholddyp anestesi, bedømt ved baklabb tilbaketrekking og hale klemme, er en Y-snitt gjort buttendet med saks i dyrets mage for å eksponere leveren og portalvenen.
    MERK: Pass på at utstyret er rent for å unngå forurensning av prøvene med mikroorganismer og generell rusk som vil bli lett sett på SEM.
  4. Tie to meget løse sting rundt portvenen en proksimal til leveren, den andre mer distalt til leveren.
  5. Cannulate portvenen med en riktig størrelse IV kanyle (18 G for rotter, 22 G for mus) .Stram sting for å feste kanylen.
  6. Begynne perfusjon med fosfatbufret saltløsning oppvarmet til 37 ° C, og ved et trykk på 10 cm H 2 0. Mellom 5 og 20 ml av PBS er vanligvis nødvendig for å exsanguinate leveren.
    MERK: Ikke for å tillate luftbobler å gå inn i leveren gjennom rørene er koblet til kanylen slik de frem gjenstander sekundært til embolisering og press; Skader på hepatocytter, sinusoids og LSEC fenestrations oppstår hvis perfusjonstrykket er for høy.
  7. Sever mage- og torakal vena cava for å tillate buffer for å gå fritt fra leveren. Dette hindrer høyt mottrykk skade LSECs.
  8. Når leveren er fri for blod, erstatte PBS med EM fiksativ og perfuse i ca 5 minutter, til leveren er herdet og veldig blek.
  9. Avvikle perfusjon og kutte den faste leveren til 1 - 2 mm 3 kvartaler med en skarp skalpell.
  10. Post-fix vev i EM fiksativ til 24 - 72 timer ved 4 ºC.
    MERK: Generelt underfixation forårsaker flere gjenstander enn overfixation.
  11. Endre fiksativ følgende post-fix perioden til 0,1 M natriumkakodylat buffer for lagring ved 4 ºC.
    MERK: Prøver som er lagret på denne måten vil bli bevart for en betydelig periode (opptil 12 måneder), men betimelig sekundær fiksering og undersøkelse anbefales for best resultat.

3. Needle Perfusion

MERK: Nål fiksering er en variant av perfusjonen fiksering som innebærer injeksjon av bindemiddel direkte i vevsprøve levervev. Målet er for fiksativ å bli spylt gjennom blodårene for å exsanguinate dem og avsløre alle de vevsblokk å fiksativ. Hensyn må tas for å holde sprøytetrykket lavt for å unngå trykkskader 18,19.

  1. Fjerne en liten del av leveren fra dyr eller gjenstand og skyll i saltvann for å fjerne blod og smuss.
  2. Tegn normal saltvann inn sprøyte utstyrt med en fin nål (typisk en insulinsprøyte).
  3. Injiser saltvann meget langsomt inn i leveren til blodet skylles ut av vevet. Multiple injeksjoner kan være nødvendig.
  4. Tegn EM fiksativ inn i en annen sprøyte utstyrt med en fin nål (typisk en insulinsprøyte).
  5. Injisere fiksativ veldig sakte inn i leveren til den blir hard og brun i fargen. Flere injeksjons Det kan være nødvendig.
  6. Skjær faste leveren til 1 - 2 mm 3 blokker med en skarp skalpell. Inkuber i EM fiksativ til 24 - 72 timer 4 ° C. Vask tre ganger i 0,1 M natriumkakodylat buffer før du begynner sekundær fiksering.

4. Forberedelse til Scanning elektronmikroskopi

  1. Vask prøve 3 ganger i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer. For å reparere lipider, post fiksere prøven i 2% osmiumtetroksid i 0,1 M natrium-kakodylat-buffer i 2 timer.
    MERK: Komplett vask er svært viktig som glutaraldehyd og osmiumtetroksid kryss reagere og generere gjenstander på SEM.
  2. Skyll prøvene i økende konsentrasjoner av etanol for å starte dehydrering. Første skylling i 50% etanol i 5 minutter; deretter tre ganger i 5 min med 70% etanol; skylles 3 ganger i 5 min med 90% etanol; skylles to ganger i 5 min i 100% etanol; og til slutt skylles to ganger i 10 min i 100% etanol (molekylsikt).
  3. Fjern all etanol fra prøvene og erstatte med heksametyldisilazan (HMDS) i fumehood og la stå i 10 min. Fjern HMDS fra vevsprøver og la det fordampe.
    MERK: HMDS er svært hygroskopisk når kald derfor tillate å nå romtemperatur før du bruker for endelig dehydrering trinn.
  4. Eventuelt montere prøvene umiddelbart eller plassere dem i en eksikator før du er klar til å montere for SEM.

5. Montering

MERK: Riktig prøvemontering vil maksimere antall klart avgrensede sinusoids tilgjengelige for analyse i henhold SEM.

  1. Etiketten bunnen av metall SEM stubber og anvende dobbeltsidig tape ledende karbon til toppen av stubber.
  2. Visual prøver ved hjelp av en dissekere mikroskop for å identifisere overflaten med de beste sinusoids for påfølgende SEM. Plasser den overflate oppover på karbon tape overflate av stussen.
  3. Stick prøver fast til stubben, prøvene er nå klar for frese belegg.
ove_title "> 6. Coating

MERK: Coating prøven med en fin film av ledende metall (gull eller platina) i en frese belegger begrunnelse prøven og beskytter den mot skader fra elektronstråle. Hvis belegget er for tykke strukturer av interesse kan være uklart.

  1. Plasser stubber i vakuumkammeret automatiske fint frese coater, satt modus til rotasjon og automatisk frese belegg for 45 sek. Bruk platina belegg for finere detaljer, men gull er også egnet.
  2. Påfør et tynt lag med karbon maling til de utvendige overflatene på de monterte leverprøver, tar seg ikke å belegge sinus overflater.
  3. Når prøvene er belagt med platina og karbon malingen har tørket, er de klare for observasjon på SEM. Prøvene kan være lagret i en eksikator.

7. Bruk Scanning Electron Microscope

  1. Plasser prøver i scanning elektronmikroskop og gå tilbake til mikroskop vakuum. </ Li>
  2. Ved hjelp av standard mikroskop driftsprosedyrer for visualisering av prøvene ved å starte på en lav forstørrelse, gradvis økende forstørrelse.
  3. Sørg mikroskopet er justert riktig for arbeidsavstand, spot størrelse og astigmatisme.
  4. Sjekk for fiksering integritet. Hvis LSEC er stort sett fri for hull og inneholder fenestrations måle 30-250 nm diameter dette ville vanligvis indikerer at prøven forberedelse har vært vellykket.
  5. Hvis sinusoids er fulle av hull eller blottet for fenestrations prøven forberedelse ikke har vært vellykket eller det er betydelig patologi. I dette tilfellet, skjære prøven med en veldig fin barberblad, og snittflatene males og analysert for å lykkes med faste sinusoids.
  6. På ca 15.000-20.000 × forstørrelse velge flate LSEC overflater som er fri for rusk med god fiksering og hvor fenestrations er godt synlig (typisk inneholder minst 10 fenestrations).
  7. Lagre bilder av minst 10 sinusoids per leveren, fra ulike områder av blokkene, ved hjelp av minst to kvartaler per leveren. Prøvetaking 10 mikrobilder ved 15.000 - 20.000 x forstørrelse pr dyr er vanligvis tilstrekkelig for kvantifisering av fenestrations å være representativ for hele leveren.

8. Analyse

MERK: ImageJ programvare som kan lastes ned gratis fra NIH utnyttes til å kvantifisere fenestration diameter og frekvens ( www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. Åpne Image J og sette skalaen ved hjelp av skalaen bar innebygd i bildet (Screen shot 1).
  2. Bruke polygonverktøyet i ImageJ, spor rundt hele flatt område av LSEC inkludert fenestrert og defenestrated områder. Ikke bare spore sikteplatene, da dette vil feilaktig blåse porøsitet. Utelukke noen store biter av rusk som er på celleoverflaten som kan være obscuring fenestrations.
  3. For å måle fenestration diameter, spore en linje gjennom den lengste diameter på hver fenestration ved å velge linjen verktøyet, og trykk "m" for å måle linjen, og "d" (uavgjort) til permanent trekke linjen på bildet. Denne linje er definert som diameteren fenestrasjon. Lengden på linjen vil nå være tilgjengelig i resultatene eske ImageJ (Screen shot 2).
  4. Måle alle åpninger som er større hull i LSEC cytoplasma enn 250 nm, så vel som fenestrations. Gapene er ofte reflekterende gjenstander dårlig perfusjon eller fiksering, men hullene kan også oppstå som et resultat av sykdom og toksisitet. Dataene for hullene vil bli ekskludert fra beregningen av fenestration parametere senere i analysen.
  5. Arealet av hull som ikke er sirkulære bør beregnes ved å trekke rundt hullene og beregning av deres område på ImageJ.
  6. Lim inn data fra resultatene boksen i ImageJ inn et Excel-regneark for further analyse.

9. Beregninger

  1. Gjennomsnittlig fenestration diameter = gjennomsnittet av alle fenestration diameter (ikke inkludert hull, hvor hullene er ≥ 250 nm).
  2. Fenestrasjon areal = πr 2, hvor R, radien, er beregnet ut fra det enkelte fenestrations diameter (r = d / 2), ikke inkludert hull.
  3. Porøsitet (%) = (Σ (πr 2) / totalt areal analysert - Σ (område av hullene =)) (2 mikrometer)) x 100.
  4. Fenestration frekvens = totalt antall fenestrations / (totalt areal analysert-Σ (område hull) (mikrometer 2).

10. Presentasjon av Fenestration data

MERK: Når det er mulig, publikasjoner inkludert kvantifisering av fenestration data skal inneholde følgende opplysninger

  1. Fenestration diameter, med en uttalelse som bekrefter hva grense diameter der brukes til å definere fenestrations (typiskmellom 50 til 250 nm), Fenestration frekvens (antall / um 2) og porøsitet (%).
  2. En bekreftelse på om hullene er tatt med i analysen, frekvensfordeling graf over fenestration diameter og antall lever, blokker, bilder og fenestrations bør inkluderes i analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Initial visualisering ved lav forstørrelse ved scanning-elektronmikroskopi avslører en flat overflate av leveren prøven med et eksponert område som er stort nok til å observere mange store leveren fartøyer og sinusformer (figur 1A). Sikre korrekt leveren blokk plassering på monterings stubben er vesentlig for å oppnå klare bilder av de sinus og Glisson s kapsel av leveren bør unngås på grunn av dette (figur 1B). Økning av forstørrelsen tillater nærmere inspeksjon av det tette blodkar i leveren og avslører enkelt celle plater av hepatocytter som skiller fartøy (figur 1C). Dårlig fiksering av leveren gir dårlig bildekvalitet, blodceller og rusk skjule visningen av leveren (figur 1D).

Videre øker forstørrelsen tillater observasjon av LSEC fenestrations (Figur 2A). Det er viktig at sinusoids er korr ectly identifisert - plater hepatocytter kan, under visse omstendigheter ser ut som blodårer, men funksjoner som galle canaliculi bistå med orientering (figur 2B). Høy Perfusjonstrykket kan føre gjenstander såsom store hull i endotelet, antatt å være forårsaket av koalescens av de LSEC siktplatene. Disse er lett identifiseres i henhold SEM (figur 2C). Unngå cellemembran direkte over kjernene vil hjelpe til med nøyaktighet på fenestrasjon tetthet og porøsitet beregninger (figur 2D).

Analyse av LSEC med ImageJ tillater kvantifisering av LSEC fenestrasjon diameter, tetthet og frekvens (figur 3A). Disse dimensjoner gir et empirisk mål på fenestrations og tillater målinger av endringer indusert av aldring, sykdom, toksiner eller behandling (Figur 3b).

filer / ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg "/>
Figur 1. Visualisering leveren med SEM. (A) Innledende inspeksjon under SEM avslører sinusoids i leveren og større fartøy, inkludert de av portalen veiene og sentrale venuler, (b) Den Glisson sin kapsel dekker alle detaljene på sinusoids, (c) Den tette blodkar i leveren og encellete plater av hepatocytter som ligger mellom fartøyene,. (D) Dårlig fiksering fører kollapset sinusoids og utvikling av ultra gjenstander Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. ultrastructure av leveren. (A) LSEC fenestrations er lett se N i godt fast vev, (B) Overflaten av en hepatocytter med godt bevart galle canaliculi, (C) store hull i endotelet forårsaket av høyt perfusjonstrykk, (D) LSEC kjerner vist med pilene bule ut under overflaten av den tynne LSEC og bør ikke tas med i området for porøsitet analyse. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. Analyse av LSEC med ImageJ. (A) Den mangekantede verktøyet tillater måling av det samlede område for måling og linjen verktøyet brukes til å måle fenestrasjon diameter, (B) En frekvens histogram som genereres av data oppnådd fra bilde J analyse.2698fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Diameter (nm) Frekvens (per UM2) Porøsitet (%) Referanse
na na 60 ± 12 20
127 ± 4 nm 6.5 ± 0.5 4.6 ± 0.4 21
na na 40.5 22
na 0.6 ± 1.4 0,01 ± 0,03
na 2.5 ± 0.5 0.047 ± 0.012 24
87,25 ± 1.4 na 9.22 ± 0,7 25
100-200 4,49 ± 0,69 2,55 ± 0,54 26
na na 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0,4 6.6 ± 0.2 28
na 2.7 ± 1.1 4.1 ± 2.3 10
68 ± 1 8 ± 0,6 3.4 ± 0.2 29
na na 3.9 ± 0.2 30
73,3 ± 0,4 na 2.2 ± 0.2 31
90.7 ± 11.7 8.45 ± 2.43 5.93 ± 2.05 4
110,7 ± 0,25 9 6 3
104,8 ± 0,22 13 8 3

Tabell 1.

Component Artefact
Osmolaritet av fiksativ og buffer for lav (hypoton) Cell hevelse
Osmolaritet av fiksativ og buffer for høy (hyperton) Cell krymping
Prøven størrelse for stor Fiksativ kan ikke trenge langt nok under inkubasjon = autolyse / utilstrekkelig fiksering
pH-verdien i fiksativ og buffer før osmium mindre enn 7,2 eller over 7,4 Proteindenaturering og strukturelle misdannelser
Fixation tid for kort Autolyse
Fixation gang for lenge Kan forårsake celle krymping
Temperatur høy Øker fiksering hastighet kan imidlertid denaturere proteiner
Temperaturen lav Utilstrekkelig fiksering
Perfusjonstrykket for høyt Gaps, space of Disse utvidelse, vakuoler i hepatocytter, tap av sil plater, utvidelse av fenestration diameter
Mekanisk skade når hakking og / eller ved hjelp av pinsett Knusing av cellulære strukturer hvis vevet ikke er herdet godt nok med fiksativ
Lengre tid å feste etter døden, prøven biopsi, eller exsanguination Iskemi, autolyse, gap formasjon, defenestration
Lav fiksativ inkubasjonsvolum Mindre enn 20 ganger prøvevolumet = utilstrekkelig gjennomtrengning av bindemiddel, og autolyse i midten av blokkene.
Fixative For høy konsentrasjon Konsentrasjon påvirker frekvensen av fiksering og gjennomtrengning av bindemiddel. Artefact formasjon.
Fiksativ konsentrasjonen for lav Utmattelse av fiksativ før opptaket er ferdig produserende celle blebbing og andre gjenstander.
Tegn på ufullstendig fiksering i leveren Cell blebbing (hovne microvilli eller stammer fra cytoplasma), defenestration, hull, tap av microvilli, hovne mitokondrier, celle hevelse, sinusformet lumen kollapset eller komprimerte, blod i sinusformet lumen, uregelmessig formede hepatocytter atomkjerner
Blod forurensning av fikser Deaktiverer fiksativ
Dirty perfusjon og forberedelse utstyr Prøven forurensning med rusk og bakterier
Ufullstendig dehydrering av prøvene eller lagring uten tørkemiddel etter belegg Specimenn lade opp på SEM. Legge karbon maling til blokken kan bidra til å redusere kostnad

Tabell 2. Feilsøking tips for fattige prøven og bildekvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Evnen til nøyaktig og reproduserbart måle status av leveren sinusformet endotelet er et viktig skritt i å forstå biologien til disse svært spesialiserte celler. Nyere teknikker som strukturert belysning mikros 32, atomic force mikros 33 og d-STORM (direkte Stochastic Optical Reconstrucion Mikros) 34 vil gi viktig informasjon om morfologi av disse cellene in vitro, men SEM er fortsatt den primære metode for å visualisere og måle deres struktur i situ.

Det mest avgjørende og teknisk utfordrende trinnet er den første fiksering: hvis leveren er bevart godt de påfølgende trinnene vil produsere lett observer og ja, vakker, bilder av leveren sinusformet. Hele lever perfusjon er den mest effektive metoden for å sikre god fiksering, men sammenlignbare resultater er mulig i nål perfusjon prøver som har blitt fikset rasktog under lavt trykk. Resorpsjon av vann ved de dehydrerte leverprøvene er en annen vanlig årsak til dårlig SEM bilder, men dette kan lett unngås ved riktig lagring av prøvene i et tørke med tørkemiddel.

Det er behov for standardisering av kvantifisering av fenestrations slik at studier fra forskjellige forskningsgrupper kan sammenlignes og tolkes. I det siste har det vært store variasjoner i de verdier som er publisert med svært lite metodisk informasjon om hvordan disse verdier ble oppnådd. Her har vi gitt en standardisert tilnærming for å bestemme og presentere verdier som beskriver fenestration ultrastructure.

Når det er mulig, publikasjoner, inkludert kvantifisering av fenestration data skal inneholde følgende opplysninger: Fenestration diameter, med en uttalelse som bekrefter hva grense diameter der brukes til å definere fenestrations (vanligvis mellom 50-250 nm); fenestration frekvens (antall / &# 181; m 2) og porøsitet (%); en bekreftelse på om hullene er tatt med i analysen; og en frekvensfordeling graf av fenestrasjon diameter. I tillegg bør antallet lever, blokker, bilder og fenestrations inkluderes i analysen.

Fenestration diameter, frekvens og porøsitet er viktige indikatorer på leveren status og standardisere innsamling av disse dataene vil være gunstig for feltet. Metodene diskutert her gi et rammeverk for å sikre at studier av ultrastructure av LSEC og fenestrations utføres og presenteres på en sammenlignbar måte på tvers av ulike forskningsmiljøer. Metodikken er lett tilpasses måling fenestrations i isolerte og dyrkede LSECs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5, (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42, (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53, (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59, (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200, (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33, (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89, (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7, (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50, (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61, (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31, (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38, (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16, (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16, (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59, (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108, (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6, (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280, (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33, (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33, (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21, (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118, (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97, (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42, (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189, (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41, (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50, (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16, (24), 12576-12581 (2014).
En standardisert metode for analyse av Liver Sinus endotelceller og deres Fenestrations ved scanning elektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter