The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.
Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures – both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.
Le cellule endoteliali sinusoidali epatiche (LSECs) sono altamente cellule endoteliali differenziate che rivestono la parete della sinusoide epatica. LSECs sono perforate con finestrature che non sono diaframmato, transcellulare pori 50-250 nm di diametro. Fino al 20% della superficie di LSECs è coperto da fenestrations, che sono di solito in gruppi di decine o centinaia chiamati piatti forati 1-3 (Figura 1). Fenestrations consentono il trasferimento di plasma e nanosubstrates tra sangue e epatociti, creando un sistema di ultrafiltrazione altamente efficiente. Fenestrazioni sono strutture dinamiche – sia la loro dimensione e / o il numero può essere modificato in risposta a vari stati fisiologici, farmaci e malattie. Ad esempio, finestrature sono più grandi nel digiuno che a stomaco pieno 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta numero finestratura, 5,6 e una riduzione delle dimensioni e del numero di finestrature per verifica delle cellule in invecchiamento e molte malattie stati 7-13 </sup>. La misurazione accurata delle dimensioni e del numero di finestrature è importante per capire come LSEC morfologia è influenzata da vari malattia, tossico, e gli stati fisiologici; il loro impatto sulla funzionalità epatica; e per sviluppare fenestrazione-modulante interventi terapeutici 1.
Lo studio delle finestrature è difficile. Il diametro di finestrature si trova sotto la risoluzione della microscopia ottica convenzionale, così precedenza solo osservazione usando microscopia elettronica sia in tessuto epatico o coltivate LSECs intatte stato possibile. Il microscopio elettronico a scansione (SEM) è stato più frequentemente usato per studiare dimensioni fenestrazione, frequenza e porosità (la percentuale di membrane LSEC che è perforata da fenestrations) perché SEM consente l'osservazione di grandi aree della superficie endoteliale e la misurazione di migliaia, se non decine di migliaia di finestrature. Nonostante la sua utilità, i risultati che sono riportati dagli studi SEM-based perParametri LSEC come le dimensioni fenestrazione, numero, frequenza e porosità variano ampiamente in letteratura (Tabella 1).
Fenestrazioni e piatti forati sono strutture fragili tale contratto, si rompono, si dilatano o fondono durante la preparazione dei campioni, quindi attenzione a trattamento è necessario per preservare la loro integrità. Elevata pressione di perfusione 14; errata osmolarità del fissativo e buffer 15; fissazione inadeguata o fissazione tempo; e la velocità di post-fissazione disidratazione ed essiccamento sono tutte le aree di elaborazione per SEM che possono produrre manufatti che interferiscono con la conservazione di ultrastruttura (Figura 2). Perdita di fenestrations ('defenestration') e finestratura restringimento può verificarsi come risultato di fissaggio poveri, con conseguente riduzione di diametro finestratura e porosità cellule. Metodi per migliorare la conservazione di campioni per analisi SEM sono stati descritti precedentemente 15-17 e verranno discussiqui con ulteriori suggerimenti su come migliorare la conservazione dei campioni. I principali obiettivi della conservazione del campione sono per rimuovere sangue dai sinusoidi modo che la superficie del LSEC può essere visualizzata e per evitare danni LSEC sia da alta pressione o fissazione ritardata. Tutta la perfusione del fegato di fissativo attraverso la vena porta è il metodo preferito per il fissaggio del fegato. Come descritto in dettaglio altrove 16,18 perfusione deve essere effettuata a bassa pressione (ad esempio 10 cm H 2 0) per evitare artefatti perfusione relativi alla pressione e danni al LSEC, tipicamente manifesta come grandi lacune all'interno della membrana cellulare. Tuttavia, la fissazione ragionevole spesso può essere ottenuto utilizzando ago perfusione di biopsie epatiche da esseri umani e animali, come descritto in dettaglio altrove 19. Questa tecnica comporta l'iniezione direttamente fissativo nel tessuto fino sangue viene lavata dal campione e il tessuto è ferma e fissa. Fissazione dei campioni per la microscopia elettronica deve essere perfORMED più rapidamente possibile dopo la cessazione del flusso di sangue per prevenire cambiamenti ultrastrutturali si verificano a seguito dei processi fegati autolitici estremamente rapidi.
Presentiamo anche un metodo di analisi di immagine che minimizza l'inclusione di manufatti, e standardizza la misurazione di finestrature. Variazione nella selezione di sinusoidi per micrografie, analisi di immagine di manufatti, e misurazione della superficie cellulare per porosità e fenestrazione frequenza hanno portato a grandi discrepanze nei risultati pubblicati. Un approccio standardizzato per la valutazione e la misurazione delle finestrature ei requisiti minimi per la presentazione dei dati non sono stati chiaramente affrontato nella letteratura in precedenza 4,10,20-31.
La capacità di precisione e riproducibilità misurare lo stato del fegato endotelio sinusoidale è un passo importante nella comprensione della biologia di queste cellule altamente specializzate. Le tecniche più recenti, come la microscopia strutturato illuminazione 32, microscopia a forza atomica 33 e d-STORM (diretta Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) 34 saranno di comunicare informazioni importanti per quanto riguarda la morfologia di queste cellule in vitro, ma S…
The authors have nothing to disclose.
The authors have no acknowledgements.
Name of material | Company | Catalogue Number | Comments |
EM grade Glutaraldehyde | ProSciTech | C001 | Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze |
Paraformaldehyde powder | Sigma Aldrich | 158127 | Always prepare Paraformaldehyde fresh |
Sodium Cacodylate powder | Sigma Aldrich | C0250 | Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution |
Calcium Chloride | Sigma Aldrich | C1016 | Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O |
Osmium tretroxide | ProSciTech | C011 | Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle |
Ethanol- Absolute | Sigma Aldrich | 459836 | 100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve |
Other grades of Ethanol | Labtech | EL5 | Prepare graded Ethanols with dH2O |
Hexamethyldisilazane | Sigma Aldrich | 52619 | Allow to reach room temperature before use |
Cannulas | Terumo | TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C | 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice |
Conductive Carbon tape | ProSciTech | IA0201 | |
Carbon Paint | ProSciTech | I003 | |
Ketamine | Must be optained under licence | ||
Xylazine | Must be obtained under licence | ||
Molecular Sieve | Sigma Aldrich | 208647 | Removes water from the 100 % Ethanol |