Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني

doi: 10.3791/52698 Published: April 30, 2015
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

الكبد الخلايا البطانية الجيبية (LSECs) هي غاية الخلايا البطانية المتباينة التي تبطن جدار جيبي الكبدي. ومثقبة LSECs مع fenestrations التي هي غير diaphragmed، العابر للالمسام 50-250 نانومتر في القطر. ما يصل الى 20٪ من سطح LSECs تغطيها fenestrations، التي عادة ما تكون في مجموعات من عشرات إلى مئات دعا لوحات غربال 1-3 (الشكل 1). Fenestrations سماح نقل البلازما وnanosubstrates بين الدم وخلايا الكبد، وخلق نظام الترشيح الفائق كفاءة عالية. Fenestrations هي البنى الدينامية - سواء من حيث الحجم و / أو رقم يمكن تغييرها استجابة لمختلف الدول الفسيولوجية، والمخدرات، والمرض. على سبيل المثال، fenestrations هي أكبر في صمت مما كانت عليه في الدولة التي تغذيها 2-دي-iodoamphetamine يزيد عدد تنوفذ، 5،6 وانخفاض في حجم وعدد fenestrations في حدوث خلية في الشيخوخة والمرض العديد من الدول 13/7 1.

دراسة fenestrations صعبة. قطر fenestrations يكمن تحت قرار من المجهر الضوئي التقليدي، لذلك فقد كان الوحيد سابقا الملاحظة باستخدام المجهر الإلكتروني في كل من أنسجة الكبد أو مثقف LSECs سليمة ممكن. وأكثر ما تم استخدام المجهر الإلكتروني الماسح (SEM) لدراسة حجم تنوفذ والتردد والمسامية (النسبة المئوية للغشاء LSEC التي مخترقين fenestrations) لSEM يسمح لمراقبة مناطق واسعة من سطح البطانية وقياس الآلاف، إن لم يكن عشرات الآلاف من fenestrations. على الرغم من فائدتها، والنتائج التي أبلغ عنها من دراسات SEM المستندة لالمعلمات LSEC مثل حجم تنوفذ، عدد وتواتر والمسامية وتختلف على نطاق واسع في الأدب (الجدول 1).

Fenestrations ولوحات غربال هي الهياكل الهشة التي العقد، كسر، تمدد أو تلتحم خلال إعداد العينات، لا بد من معالجة بالتالي الحذر للحفاظ على سلامتهم. ارتفاع ضغط التروية 14؛ الأسمولية غير صحيحة من تثبيتي، ومخازن 15؛ عدم كفاية التثبيت أو التثبيت الزمن؛ وسرعة الجفاف بعد تثبيت وتجفيف كلها مجالات تجهيز لSEM التي قد تنتج القطع الأثرية التي تتداخل مع الحفاظ على التركيب الدقيق (الشكل 2). فقدان fenestrations ('القذف من النافذة') وتنوفذ انكماش يمكن أن يحدث نتيجة لسوء التثبيت، مما أدى إلى انخفاض قطرها تنوفذ والمسامية الخلية. وقد وصفت وسائل لتحسين الحفاظ على عينات لتحليل SEM سابقا 15-17 وسيتم مناقشتهاهنا مع نصائح إضافية حول كيفية تحسين الحفاظ على العينة. الأهداف الرئيسية لحفظ العينات هي لإزالة الدم من الجيوب بحيث يمكن تصور سطح LSEC وتجنب الضرر LSEC إما من ارتفاع ضغط أو تأخير التثبيت. نضح الكبد كاملة من تثبيتي عبر الوريد البابي هو الأسلوب المفضل لتثبيت الكبد. كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر يجب القيام 16،18 نضح تحت ضغط منخفض (على سبيل المثال 10 سم من H 2 0) لتجنب القطع الأثرية نضح المتعلقة الضغط والأضرار التي لحقت LSEC، والذي تجلى عادة فجوات كبيرة كما ضمن في غشاء الخلية. ومع ذلك، يمكن في كثير من الأحيان الحصول على تثبيت معقول باستخدام إبرة نضح من خزعات الكبد من البشر والحيوانات، كما هو موضح بالتفصيل في مكان آخر (19). تتضمن هذه التقنية عن طريق الحقن مباشرة تثبيتي إلى الأنسجة حتى يتم مسح الدم من العينة والنسيج حازم وثابت. تثبيت العينات للفحص المجهري الإلكترون يجب أن يكون الأداء الإقتصادي الأداءormed في أسرع وقت ممكن بعد وقف تدفق الدم لمنع التغييرات التركيبية التي تحدث نتيجة للكبد عمليات الانحلال الذاتي سريعة للغاية.

كما نقدم طريقة لتحليل الصور التي تقلل إدراج القطع الأثرية، وتوحد قياس fenestrations. وقد أدى الاختلاف في اختيار الجيوب لالميكروسكوب، تحليل الصور من القطع الأثرية، وقياس مساحة الخلية لالمسامية وتنوفذ تردد إلى تناقضات كبيرة في نشر النتائج. نهج موحد لتقييم وقياس fenestrations ومتطلبات الحد الأدنى لعرض البيانات لم يتم التطرق بوضوح في الأدب سابقا 4،10،20-31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ملاحظة: جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام الحيوانات وتنفذ وفقا للتشريعات المحلية. الموافقة على عملنا من قبل لجنة رعاية الحيوان منطقة الصحة سيدني المحلي. ووصف الإجراءات المسموح بها في وثائق الترخيص للمشروع ومتابعة مبادئ توجيهية لضمان رفاهية الحيوان في جميع الأوقات. ضمان الالتزام التشريع على التجارب على الحيوانات من البلاد حيث يتم تنفيذ العمل.

1. بروتوكول لإعداد EM تثبيتي

  1. 100 مل من تثبيتي، وإعداد بارافورمالدهيد بإضافة 2 غرام من مسحوق امتصاص العرق إلى 25 مل من الماء المقطر في دورق مخروطي، والحرارة إلى 65 درجة مئوية مع التحريك باستمرار مع محرك مغناطيسي.
    ملاحظة: غلوتارالدهيد، لامتصاص العرق والصوديوم العازلة كاكوديلات كلها مواد خطرة ويجب دائما أن تعالج في fumehood.
  2. الحرارة عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم يترك ليبرد. إذا لزم الأمر، إضافة محلول هيدروكسيد الصوديوم dropwايسي مع التحريك لمسح حل تماما.
    ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم الخطرة، التعامل مع الرعاية.
  3. إضافة 10 مل من EM الصف الأسهم غلوتارالدهيد، 50 مل من 0.2 M الصوديوم العازلة كاكوديلات و 2 غرام من السكروز واثارة مع محرك مغناطيسي. إضافة 2 مل من 1.0 M CaCl 2.
  4. ضبط لدرجة الحموضة 7.4 قبل اتخاذ حل ما يصل الى 100 مل بالماء المقطر. يحتوي تثبيتي النهائي 2.5٪ غلوتارالدهيد، 2٪ لامتصاص العرق، 2 ملمول CaCl 2٪ السكروز في 0.1 M عازلة كاكوديلات. تأكد من أن الأسمولية إجمالية تبلغ 440 mOsmol / L. استخدام في غضون 24 ساعة من التحضير.

2. الإرواء التثبيت الكبد

  1. دافئ العازلة نضح وتثبيتي إلى 35-37 درجة مئوية. درجة الحرارة الصحيحة المخزن المؤقت استنزاف وتثبيتي يساعد على ضمان سلامة الأنسجة.
  2. تخدير الحيوان مع حقن داخل الصفاق واحدة من 50 ملغ / كغ الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين.
  3. وبمجرد أن الحيوان هو تحتالتخدير العميق، والمقررة من قبل انسحاب هند أطرافهم وقرصة الذيل، يتم إجراء شق Y مع حادة انتهت المقص في بطن الحيوان لفضح الكبد والوريد البابي.
    ملاحظة: تأكد من أن المعدات نظيفة لتجنب تلوث العينات مع الكائنات الحية الدقيقة والحطام العام والتي سينظر إليها بسهولة على SEM.
  4. ربط اثنين من الغرز فضفاضة جدا حول الوريد البابي الأقرب إلى الكبد، والآخر أكثر بشكل أقصى للكبد.
  5. يقني؛ يدخل القنية الوريد البابي مع قنية بحجم مناسب الرابع (18 G للفئران، 22 G للفئران) الغرز .Tighten لتأمين قنية.
  6. بدء نضح مع الفوسفات مخزنة المالحة درجة حرارة 37 درجة مئوية، وتحت ضغط من 10 سم من H 2 0. مطلوب عادة بين 5 و 20 مل من برنامج تلفزيوني ليستنزف الكبد.
    ملاحظة: لا يسمح لفقاعات الهواء بدخول الكبد من خلال أنابيب متصلة قنية لأنها تحفز التحف الثانوية لالانصمام والضغط؛ الأضرار التي لحقت خلايا الكبد، سيnusoids وfenestrations LSEC يحدث إذا كان ضغط التروية مرتفع جدا.
  7. قطع والبطن والصدر الوريد الأجوف للسماح المخزن المؤقت للخروج بحرية من الكبد. هذا يمنع الضرر ارتفاع ضغط الخلفي لLSECs.
  8. وبمجرد أن الكبد هو خال من الدم، استبدال برنامج تلفزيوني مع EM تثبيتي، ويروي ما يقرب من 5 دقائق، حتى هو صلابة الكبد وشاحب جدا.
  9. وقف نضح وقطع الكبد الثابتة إلى 1-2 ملم 3 كتل باستخدام مشرط حاد.
  10. الأنسجة بعد الإصلاح في EM تثبيتي ل24-72 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: بشكل عام، underfixation يؤدي إلى مزيد من القطع الأثرية من overfixation.
  11. تغيير تثبيتي بعد فترة ما بعد الإصلاح إلى 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات للتخزين عند 4 درجات مئوية.
    سيتم الحفاظ على العينات المخزنة بهذه الطريقة لفترة طويلة من الزمن (تصل إلى 12 شهرا)، تثبيت الثانوي ولكن في الوقت المناسب ويوصى فحص حصول على أفضل النتائج: ملاحظة.

3. إبرة Perfusion

ملاحظة: إبرة تثبيت هو البديل من نضح تثبيت ينطوي على حقن تثبيتي مباشرة إلى أنسجة الكبد تحتاج فحص. والهدف من ذلك هو لتثبيتي إلى أن يتم مسح من خلال الأوعية الدموية من أجل يستنزف منهم وفضح كل من كتلة الأنسجة لتثبيتي. يجب توخي الحذر للحفاظ على ضغط الحقن منخفض لتجنب الإصابة الضغط 18،19.

  1. إزالة قطعة صغيرة من الكبد من الحيوانات أو الموضوع، وشطف في المياه المالحة لإزالة الدم والحطام.
  2. رسم ملحي في حقنة مزودة إبرة قياس غرامة (عادة حقنة الأنسولين).
  3. حقن محلول ملحي ببطء شديد في الكبد حتى يتم مسح الدم من الأنسجة. قد تكون هناك حاجة الحقن متعددة.
  4. رسم تثبيتي EM إلى حقنة أخرى مزودة إبرة قياس غرامة (عادة حقنة الأنسولين).
  5. حقن تثبيتي ببطء شديد في الكبد حتى يصبح من الصعب وتأن في اللون. حقن متعددةالصورة قد تكون مطلوبة.
  6. قطع الكبد الثابتة إلى 1-2 ملم 3 كتل باستخدام مشرط حاد. احتضان في تثبيتي EM عن 24-72 ساعة 4 ° C. يغسل 3 مرات في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات قبل البدء في تثبيت الثانوي.

4. التحضير للالمجهر الإلكتروني

  1. غسل العينة 3 مرات في 0،1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات. لإصلاح الدهون، وبعد إصلاح العينة في 2٪ رباعي أكسيد الأوزميوم في 0.1 M الصوديوم العازلة كاكوديلات لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: أكمل الغسيل مهم جدا حيث تتفاعل عبر غلوتارالدهيد ورباعي أكسيد الأوزميوم وتولد القطع الأثرية في SEM.
  2. شطف عينات في زيادة تركيزات الإيثانول لبدء الجفاف. شطف الأولى في الايثانول 50٪ لمدة 5 دقائق. ثم 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 70٪ من الإيثانول. شطف 3 مرات لمدة 5 دقائق مع 90٪ من الإيثانول. شطف 2 مرات لمدة 5 دقائق في الإيثانول بنسبة 100٪. وأخيرا شطف 2 مرات لمدة 10 دقيقة في الإيثانول بنسبة 100٪ (المنخل الجزيئي).
  3. إزالة جميع الإيثانول من العينات واستبدالها مع hexamethyldisilazane (HMDS) في fumehood ويترك لمدة 10 دقيقة. إزالة HMDS من عينات الأنسجة والسماح لتتبخر.
    ملاحظة: HMDS هو استرطابي للغاية عندما الباردة وبالتالي السماح للوصول إلى RT قبل استخدام لخطوة الجفاف النهائية.
  4. اختياريا، جبل العينات على الفور أو وضعها في مجفف حتى جاهزة للتحميل لSEM.

5. تركيب

ملاحظة: سيتم تصحيح العينة تصاعد تحقيق أقصى قدر من عدد من الجيوب محددة بوضوح المتاحة للتحليل تحت SEM.

  1. تسمية قاعدة معدنية بذرة SEM وتطبيق الوجهين الشريط الكربون الموصلة إلى الجزء العلوي من بذرة.
  2. تصور العينات باستخدام المجهر تشريح لتحديد السطح مع أفضل الجيوب لاحق SEM. وضع هذا السطح صعودا على سطح الشريط الكربون من كعب.
  3. العينات عصا بحزم كعب، العينات جاهزة الآن لتفل الطلاء.
ove_title "> 6. طلاء

ملاحظة: طلاء العينة مع فيلم جيد من معدن موصل (الذهب أو البلاتين) في أسباب تفل المغطي العينة ويحميها من التلف من شعاع الالكترون. إذا كان طلاء يجوز حجب هياكل سميكة جدا من الفائدة.

  1. مكان بذرة في فراغ الغرفة التلقائي تفل على ما يرام المغطى، ووضع للتناوب وتلقائية طلاء بالرش تعيين لمدة 45 ثانية. استخدام البلاتين طلاء لتفصيل أدق، ولكن الذهب هو أيضا مناسبة.
  2. تطبيق طبقة رقيقة من الطلاء الكربون على الأسطح الخارجية للعينات الكبد شنت، مع الحرص على عدم معطف السطوح الجيبية.
  3. مرة واحدة والمغلفة العينات مع البلاتين والطلاء قد جفت الكربون انهم مستعدون للمراقبة على SEM. ويمكن تخزين العينات في المجفف.

7. باستخدام مجهر المسح الإلكتروني

  1. المكان العينات إلى مجهر المسح الإلكتروني والعودة المجهر لفراغ. </ لى>
  2. باستخدام إجراءات التشغيل القياسية المجهر لرؤية العينات التي تبدأ في تضخم منخفض، وزيادة التكبير تدريجيا.
  3. ضمان يتم ضبط المجهر بشكل مناسب للعمل عن بعد، حجم البقعة والاستجماتيزم.
  4. تحقق من سلامة تثبيت. إذا كان LSEC غير مجانا معظمهم من الثغرات ويحتوي fenestrations قياس 30-250 نانومتر قطر هذا من شأنه أن يشير عموما كان أن إعداد العينات ناجحة.
  5. إذا كانت الجيوب مليئة الثغرات أو خالية من fenestrations لم يكن تحضير العينة ناجح أو أن هناك أمراض كبير. في هذه الحالة، شريحة العينة بشفرة حلاقة دقيقة جدا، وقطع السطوح recoated وتحليلها لالجيوب الثابتة بنجاح.
  6. وفي حوالي 15،000-20،000 × التكبير تحديد السطوح LSEC مسطحة بحيث تكون خالية من الحطام مع التثبيت الجيد وحيث fenestrations واضحة للعيان (عادة تحتوي على 10 على الأقل fenestrations).
  7. حفظ الصور لا يقل عن 10 الجيوب في الكبد، من مناطق مختلفة من الكتل، وذلك باستخدام اثنين على الأقل من كتل في الكبد. أخذ العينات 10 الميكروسكوب في 15000 - 20000 × التكبير لكل حيوان غير كافية بشكل عام لتقدير حجم fenestrations لتكون ممثلة للكبد كامل.

تحليل 8.

ويستخدم برنامج يماغيج التي يمكن تحميلها مجانا من المعاهد الوطنية للصحة لقياس قطرها تنوفذ وتردد (ملاحظة: www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. فتح صورة J ووضع جدول باستخدام شريط نطاق وجزءا لا يتجزأ في الصورة (لقطة الشاشة 1).
  2. باستخدام أداة المضلع في يماغيج، أثر في جميع أنحاء منطقة مسطحة بالكامل من LSEC بما في ذلك المناطق منوفذة وdefenestrated. لا مجرد تتبع لوحات غربال حيث سيؤدي ذلك إلى تضخيم زورا المسامية. استبعاد أي قطعة كبيرة من الحطام التي هي على سطح الخلية التي قد تكون obscurifenestrations نانوغرام.
  3. لقياس قطرها تنوفذ، وتتبع خط من خلال أطول قطر كل تنوفذ عن طريق اختيار أداة سطر، ثم اضغط على "م" لقياس الخط، و "د" (رسم) لرسم خط على الصورة بشكل دائم. ويعرف هذا الخط كما قطر تنوفذ. فإن طول الخط تكون متاحة الآن في مربع نتائج يماغيج (لقطة الشاشة 2).
  4. قياس كل الثغرات التي هي أكبر الثقوب في السيتوبلازم LSEC أكثر من 250 نانومتر، وكذلك fenestrations. الثغرات غالبا ما تكون القطع الأثرية التي تعكس ضعف التروية أو التثبيت، لكن ثغرات يمكن أن يحدث أيضا نتيجة المرض وسمية. سيتم استبعاد البيانات عن الثغرات من حساب المعلمات تنوفذ في وقت لاحق في التحليل.
  5. ينبغي أن تحسب مجال الثغرات التي لا التعميم عن طريق تتبع حول الثغرات وحساب منطقتهم على يماغيج.
  6. لصق البيانات من مربع النتائج في يماغيج إلى جداول البيانات إكسل لابعد من ذلكتحليل ص.

9. الحسابات

  1. متوسط ​​تنوفذ قطرها = متوسط ​​جميع أقطار نوفذة (وليس بما في ذلك الثغرات، حيث الفجوات ≥ 250 نانومتر).
  2. منطقة التثقب = πr حيث يتم احتساب ص، نصف القطر، من fenestrations قطر الفردي (ص = د / 2)، وليس بما في ذلك الثغرات.
  3. المسامية (٪) = (Σ (πr 2) / مساحة إجمالية حلل - Σ (منطقة الثغرات =)) (ميكرون 2)) × 100.
  4. تردد تنوفذ = العدد الكلي للfenestrations / (مساحة إجمالية تحليل-Σ (منطقة الثغرات) (ميكرون 2).

10. عرض التثقب البيانات

وينبغي أن تتضمن كلما كان ذلك ممكنا، بما في ذلك المطبوعات الكمي للبيانات تنوفذ المعلومات التالية: ملاحظة

  1. تنوفذ القطر، مع بيان يؤكد ما أقطار الحدود حيث تستخدم لتحديد fenestrations (عادةبين 50-250 نانومتر)، وتردد التثقب (رقم / ميكرون 2) والمسامية (٪).
  2. وقال بيان يؤكد ما إذا كان قد تم إدراج ثغرات في التحليل، وينبغي أن تدرج الرسم البياني توزيع الترددات من قطر تنوفذ وعدد الأكباد، وكتل والصور وfenestrations في التحليل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

التصور الأولي في التكبير المنخفض عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني يكشف سطح مستو للعينة الكبد وتبلغ مساحتها يتعرض كبيرة بما يكفي لمراقبة العديد من السفن الكبد الكبيرة والجيوب (الشكل 1A). ضمان الصحيح وضع كتلة الكبد على كعب متزايدة من الضروري للحصول على صور واضحة من الجيوب وكبسولة غليسون الكبد يجب تجنبها لهذا السبب (الشكل 1B). زيادة التكبير يسمح توثيق التفتيش من الأوعية الدموية كثيفة من الكبد ويكشف عن لوحات خلية واحدة من خلايا الكبد التي تقسم السفن (الشكل 1C). الفقراء تثبيت نتائج الكبد في ضعف جودة الصورة، وخلايا الدم والحطام تحجب ضوء الكبد (1D الشكل).

الأمر الذي يزيد من التكبير يسمح مراقبة fenestrations LSEC (الشكل 2A). فمن الضروري أن الجيوب هي نيوس حددت ectly - يمكن لوحات من خلايا الكبد، في بعض الظروف تظهر مثل الأوعية الدموية ولكن بعض السمات، مثل الصفراء نفيق مساعدة مع التوجه (الشكل 2B). ضغط التروية عالية يمكن أن يسبب المصنوعات اليدوية مثل فجوات كبيرة في البطانة، ويعتقد أن يكون ناجما عن تجمع للوحات غربال LSEC. ويتم تحديد هذه بسهولة تحت SEM (الشكل 2C). وتجنب غشاء الخلية مباشرة فوق نواة مساعدة مع دقة كثافة تنوفذ وحسابات المسامية (الشكل 2D).

تحليل LSEC مع يماغيج يسمح الكمي لLSEC قطر تنوفذ والكثافة والتردد (الشكل 3A). توفر هذه الأبعاد لقياس التجريبي لfenestrations وتسمح قياسات التغييرات الناجمة عن الشيخوخة والمرض والسموم أو العلاجات (الشكل 3B).

الملفات / ftp_upload / 52698 / 52698fig1.jpg "/>
الشكل 1. تصور الكبد مع SEM. (A) التفتيش الأولي تحت SEM يكشف عن الجيوب الكبد والأوعية الدموية الكبيرة بما في ذلك الجهاز البابي والأوردة المركزية؛ (ب) تغطي كبسولة وغليسون كافة تفاصيل الجيوب؛ (C) والأوعية الدموية كثيفة من الكبد و لوحات خلية واحدة من خلايا الكبد التي تقع بين السفن؛ (D) النتائج تثبيت الفقيرة في الجيوب انهار وتطوير المصنوعات اليدوية التركيبية الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 2
الرقم 2. التركيب الدقيق للكبد. fenestrations (A) LSEC ونرى بسهولة ن في الأنسجة ثابتة بشكل جيد؛ (ب) سطح الكبدية مع الحفاظ عليها جيدا نفيق الصفراء؛ (C) فجوات كبيرة في البطانة الناجم عن الضغط نضح عالية؛ (D) LSEC نوى المشار إليها بواسطة الأسهم انتفاخ تحت سطح لا ينبغي أن تدرج في LSEC رقيقا و في المنطقة لتحليل المسامية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تحليل LSEC مع يماغيج. (A) أداة متعددة الأضلاع تسمح بقياس المساحة الكلية للقياس ويتم استخدام أداة سطر لقياس قطرها تنوفذ؛ (B) رسم بياني تردد الناتجة عن البيانات المكتسبة من صورة تحليل J.2698fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

قطر (نانومتر) التردد (في um2) المسامية (٪) إشارة
غ غ 60 ± 12 20
127 ± 4 نانومتر 6.5 ± 0.5 4.6 ± 0.4 21
غ غ 40.5 22
غ 0.6 ± 1.4 0.01 ± 0.03
غ 2.5 ± 0.5 0.047 ± 0.012 24
87.25 ± 1.4 غ 9.22 ± 0.7 25
100-200 4.49 ± 0.69 2.55 ± 0.54 26
غ غ 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0.4 6.6 ± 0.2 28
غ 2.7 ± 1.1 4.1 ± 2.3 10
68 ± 1 8 ± 0.6 3.4 ± 0.2 29
غ غ 3.9 ± 0.2 30
73.3 ± 0.4 غ 2.2 ± 0.2 31
90.7 ± 11.7 8.45 ± 2.43 5.93 ± 2.05 4
110.7 ± 0.25 9 6 3
104.8 ± 0.22 13 8 3

الجدول 1.

عنصر الحقيقة الجميلة
الأسمولية من تثبيتي، والعازلة منخفضة جدا (ناقص التوتر) تورم الخلية
الأسمولية من تثبيتي، والعازلة عالية جدا (مفرط التوتر) انكماش الخلية
حجم العينة كبيرة جدا تثبيتي لا يمكن اختراق بعيدا بما فيه الكفاية خلال الحضانة = انحلال ذاتي / عدم كفاية التثبيت
الرقم الهيدروجيني للتثبيتي، والعازلة قبل الأزميوم أقل من 7.2 أو أكثر من 7.4 تمسخ البروتين والتشوهات الهيكلية
الوقت تثبيت قصيرة جدا انحلال ذاتي
الوقت تثبيت طويلة جدا قد يسبب انكماش خلايا
ارتفاع في درجة الحرارة يزيد من سرعة التثبيت ولكن قد تفسد البروتينات
درجات الحرارة المنخفضة تثبيت غير كافية
ضغط التروية عالية جدا ثغرات، والفضاء من ديس التوسيع، فجوات في خلايا الكبد، وفقدان لوحات غربال، واتساع قطرها تنوفذ
الأضرار الميكانيكية عندما تنميق و / أو باستخدام ملقط سحق الهياكل الخلوية إذا لم يتم تصلب الأنسجة جيدا بما فيه الكفاية من قبل تثبيتي
الوقت الطويل لتثبيت بعد الموت، خزعة العينة، أو استنزاف نقص الأوكسجين، انحلال ذاتي، وتشكيل الفجوة، القذف من النافذة
انخفاض تثبيتي حجم الحضانة أقل من 20 أضعاف حجم العينة = عدم كفاية اختراق تثبيتي، وانحلال ذاتي في وسط كتل.
Fتركيز ixative عالية جدا يؤثر تركيز معدل تثبيت وتغلغل مثبت. تشكيل الحرفية.
تركيز تثبيتي منخفضة جدا استنفاد تثبيتي قبل عملية تثبيت اكتمال blebbing الخلايا المنتجة والمصنوعات اليدوية الأخرى.
علامات التثبيت غير كاملة في الكبد blebbing الخلية (زغيبات تورم أو منشؤها من السيتوبلازم)، القذف من النافذة، والثغرات، وفقدان زغيبات، الميتوكوندريا متورمة، وتورم الخلية، شمعة جيبي انهارت أو ضغط الدم في التجويف الجيبية، نواة الخلية الكبدية غير منتظمة الشكل
تلوث الدم من تثبيتي يعطل مثبت
نضح القذرة ومعدات تجهيز عينة التلوث الحطام والبكتيريا
الجفاف غير مكتملة من العينات أو التخزين دون المجففة بعد طلاء SPECIالرجال تهمة المتابعة على SEM. مضيفا الطلاء الكربون إلى كتلة قد تساعد في الحد من تهمة

الجدول 2. نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها لعينة الفقيرة وجودة الصورة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

القدرة على بدقة وبتكاثر قياس حالة الكبد البطانة الجيبية هي خطوة هامة في فهم بيولوجيا هذه الخلايا المتخصصة للغاية. والتقنيات الحديثة مثل منظم إضاءة المجهر 32، قوة المجهر الذري 33 و D-STORM (مباشر الاستوكاستك البصرية Reconstrucion الميكروسكوب) 34 نقل المعلومات الهامة فيما يتعلق مورفولوجيا هذه الخلايا في المختبر لكنها لا تزال SEM المنهجية الأساسية لتصور وقياس بنيتها في الموقع.

الخطوة الأكثر أهمية وتحديا من الناحية الفنية هو التثبيت الأولي: إذا كان الحفاظ على الكبد بشكل جيد الخطوات اللاحقة سوف تنتج بسهولة يمكن ملاحظتها وبالفعل، جميل، صور من جيبي الكبد. نضح الكبد كله هو الأسلوب الأكثر فعالية لضمان تثبيت جيدة، ولكن نتائج مماثلة ممكنة في عينات التروية الإبرة التي تم إصلاحها بسرعةوتحت ضغط منخفض. ارتشاف الماء عن طريق عينات الكبد المجففة سبب آخر شائع للفقراء الصور SEM، ولكن هذا يمكن تجنبها بسهولة عن طريق التخزين السليم للعينات في مجفف مع المجففة.

هناك حاجة لتوحيد القياس الكمي لfenestrations بحيث يمكن مقارنة دراسات من المجموعات البحثية المختلفة وتفسيرها. في الماضي كان هناك تباين واسع في القيم المنشورة مع المعلومات المنهجية قليلة جدا عن كيفية الحصول على هذه القيم. نحن هنا قدمت نهج موحد لتحديد وتقديم القيم التي تصف تنوفذ التركيب الدقيق.

كلما كان ذلك ممكنا، بما في ذلك المطبوعات الكمي للبيانات تنوفذ ينبغي أن تشمل المعلومات التالية: التثقب القطر، مع بيان يؤكد ما أقطار الحدود حيث تستخدم لتحديد fenestrations (عادة بين 50-250 نانومتر)؛ تردد نوفذة (رقم / &# 181؛ م 2) والمسامية (٪)؛ بيان يؤكد ما إذا كان قد تم إدراج ثغرات في التحليل؛ والرسم البياني توزيع الترددات من قطر تنوفذ. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تدرج في عدد من كبد، وكتل والصور وfenestrations في التحليل.

قطر تنوفذ والتردد والمسامية هي مؤشرات هامة على حالة الكبد وسوف توحيد جمع هذه البيانات يكون مفيدا في الميدان. الأساليب التي تمت مناقشتها هنا توفر إطارا لضمان أن الدراسات في التركيب الدقيق للLSEC وfenestrations يتم تنفيذ وعرضها بطريقة قابلة للمقارنة عبر المجموعات البحثية المختلفة. ويتم تكييف منهجية بسهولة لقياس fenestrations في LSECs معزولة ومثقف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5, (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42, (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53, (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59, (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200, (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33, (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89, (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7, (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50, (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61, (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31, (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38, (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16, (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16, (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59, (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108, (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6, (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280, (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33, (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33, (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21, (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118, (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97, (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42, (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189, (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41, (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50, (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16, (24), 12576-12581 (2014).
طريقة موحدة لتحليل خلايا الكبد خاص بالمنحنى البطانية وFenestrations من خلال المجهر الإلكتروني
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter