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Biology

Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura

doi: 10.3791/52698 Published: April 30, 2015
* These authors contributed equally

Introduction

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As células endoteliais sinusoidais hepáticas (LSECs) são altamente diferenciadas, células endoteliais que revestem a parede da sinusóide hepática. LSECs são perfuradas com fenestrações que são não-diaphragmed, transcelular poros de 50-250 nm de diâmetro. Até 20% da superfície é coberta por LSECs fenestrações, que são geralmente em grupos de dezenas a centenas chamadas placas de peneira 1-3 (Figura 1). Fenestrações permitir a transferência de plasma e nanosubstrates entre o sangue e hepatócitos, a criação de um sistema de ultrafiltração é altamente eficiente. Fenestrações são estruturas dinâmicas - tanto o seu tamanho e / ou o número pode ser alterado em resposta a vários estados fisiológicos, de drogas, e doença. Por exemplo, fenestrations são maiores no jejum do que no estado alimentado 4; 2-di-iodoamphetamine aumenta número fenestration; 5,6 e uma redução no tamanho e número de fenestrações por célula ocorre em envelhecimento e muitos estados doença 13/7 1.

O estudo de fenestrações é difícil. O diâmetro das fenestrações se encontra abaixo da resolução da microscopia óptica convencional, de modo que anteriormente apenas a observação por microscopia de electrões, tanto em tecido do fígado ou cultivadas LSECs intactos tem sido possível. O microscópio eletrônico de varredura (SEM) tem sido mais frequentemente utilizado para estudar tamanho fenestration, a frequência ea porosidade (a percentagem de membrana LSEC que é perfurado por fenestrations) porque SEM permite a observação de grandes áreas de superfície endotelial e medição de milhares, se não dezenas de milhares de fenestrações. Apesar de sua utilidade, os resultados que são relatados a partir de estudos baseados SEM-paraLSEC parâmetros como o tamanho fenestra�o, número, frequência e a porosidade pode variar amplamente na literatura (Quadro 1).

Fenestrações e pratos perfurados são estruturas frágeis que contrato, quebram, dilatam ou se aglutinam durante a preparação de amostras, processamento, assim, o cuidado é necessário para preservar a sua integridade. A pressão de perfusão elevada 14; osmolaridade incorreto do fixador e buffers 15; fixação inadequada ou fixação do tempo; e velocidade de desidratação pós-fixação e secagem são todas as áreas de processamento para SEM que podem produzir produtos manufacturados que interferem com a preservação da ultraestrutura (Figura 2). Perda de fenestrações ('defenestration') e fenestra�o encolhimento pode ocorrer como resultado de má fixação, resultando na redução de diâmetro e porosidade fenestra�o célula. Métodos para melhorar a conservação de amostras para análise em MEV foram descritos anteriormente 15-17 e será discutidoaqui com dicas adicionais sobre como melhorar a preservação da amostra. Os principais objectivos da preservação espécime são para remover o sangue dos sinusóides, de modo que a superfície do LSEC pode ser visualizado e para evitar danos ou LSEC de alta pressão ou fixação retardada. Perfusão do fígado inteiro de fixador através da veia portal é o método preferido para a fixação hepática. Tal como descrito em pormenor noutro 16,18 perfusão deve ser efectuada a baixa pressão (por exemplo, 10 cm de H 2 0) para evitar artefactos relacionados com a pressão de perfusão e os danos para a LSEC, tipicamente manifestada como grandes lacunas dentro da membrana celular. No entanto, muitas vezes fixação razoável pode ser obtido utilizando a agulha de perfusão de biópsias de fígado de seres humanos e animais, tal como descrito em detalhe noutro local 19. Esta técnica envolve a injeção diretamente fixador para o tecido até que o sangue é liberado para fora da amostra eo tecido é firme e fixo. Fixação de amostras para a microscopia de electrões tem de ser perfORMED tão rapidamente quanto possível a seguir à interrupção do fluxo de sangue para evitar alterações ultra-estruturais que ocorrem como resultado dos processos fígados autoliticas extremamente rápidas.

Nós também apresentamos um método de análise de imagem que minimiza a inclusão de artefactos, e padroniza a medição das fenestrações. Variação na seleção de senóides para micrografias, análise de imagens de artefatos, e medição de área celular para porosidade e fenestration frequência levaram a grandes discrepâncias nos resultados publicados. A abordagem padronizada de avaliação e medida de fenestrações e os requisitos mínimos para a apresentação dos dados não tenham sido claramente abordada na literatura anteriormente 4,10,20-31.

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Protocol

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NOTA: Todos os procedimentos que envolvam a utilização de animais são realizados de acordo com a legislação local. Nosso trabalho é aprovado pela Comissão Distrital de Saúde Bem-Estar Animal da Sydney Local. Os procedimentos autorizados estão descritas na documentação da licença do projeto e seguir as orientações que garantam o bem-estar do animal em todos os momentos. Assegurar o cumprimento da legislação sobre experimentação animal do país onde o trabalho é realizado.

1. Protocolo para Preparando EM Fixative

  1. Para 100 ml de fixador, preparar paraformaldeído por adição de 2 g de paraformaldeído em pó a 25 ml de água destilada em um balão de Erlenmeyer de calor, a 65 ° C, agitando constantemente com um agitador magnético.
    NOTA: O glutaraldeído, paraformaldeído e tampão cacodilato de sódio são todas as substâncias perigosas e devem sempre ser manuseados em fumehood.
  2. Aquece-se a 65 ºC durante 2 min, em seguida, deixa-se arrefecer. Se necessário, adicionar solução de hidróxido de sódio dropwise agitando para limpar solução completamente.
    NOTA: hidróxido de sódio é perigoso, manusear com cuidado.
  3. Adicionar 10 ml de estoque de glutaraldeído grau EM, 50 ml de tampão de cacodilato de sódio 0,2 M e 2 g de sacarose e agita-se com um agitador magnético. Adicionar 2 ml de 1,0 M de CaCl2.
  4. Ajustar a pH 7,4 antes da solução até perfazer 100 ml com água destilada. O fixador final contém de 2,5% de glutaraldeído, paraformaldeído a 2%, 2 mmol CaCl2, 2% de sacarose em tampão de cacodilato 0,1 M. Certifique-se de que a osmolaridade total é de 440 mOsmol / L. Use dentro de 24 horas de preparação.

2. Fixação de Perfusão do Fígado

  1. Tampão de perfusão quente e fixador de 35-37 ºC. A temperatura correcta do tampão exsanguinação e fixador ajuda a assegurar a integridade do tecido.
  2. Anestesiar o animal com uma injecção intraperitoneal única de 50 mg / kg de cetamina e 5 mg / kg de xilazina.
  3. Uma vez que o animal está sobanestesia profunda, avaliada pela retirada da pata traseira e cauda pitada, uma incisão Y é feito com uma tesoura sem corte terminou em abdômen do animal para expor a veia hepática e portal.
    NOTA: Certifique-se de que o equipamento está limpo para evitar a contaminação das amostras com microorganismos e detritos geral que será facilmente visto em SEM.
  4. Amarrar duas suturas muito soltas em torno da veia porta proximal para o fígado, o outro mais distalmente para o fígado.
  5. Canular a veia porta com uma cânula de tamanho apropriado IV (18 G para ratos, 22 G para ratos) suturas .Aperte para garantir cânula.
  6. Começar a perfusão com solução salina tamponada com fosfato aquecido a 37 ° C, e a uma pressão de 10 cm de H 2 0. Entre 5 e 20 ml de PBS, é geralmente necessária para desangrar o fígado.
    NOTA: Não para permitir que as bolhas de ar a entrar no fígado através dos tubos ligados à cânula, como eles induzem artefactos secundárias a embolização e pressão; Danos nos hepatócitos, sinusoids e fenestrações LSEC ocorre se a pressão de perfusão é demasiado elevada.
  7. Cortar a veia cava abdominal e torácica para permitir que o tampão para sair livremente a partir do fígado. Isso evita danos alta contra-pressão para LSECs.
  8. Uma vez que o fígado é livre de sangue, substitua com PBS EM fixador e perfundir durante aproximadamente 5 minutos, até que o fígado é endurecido e muito pálido.
  9. Descontinuar a perfusão e cortar o fígado fixado em 1-2 mm3 blocos usando um bisturi afiado.
  10. Tecido pós-fix em EM fixador para 24-72 horas a 4 ºC.
    NOTA: Em geral, underfixation causa mais artefatos do que com excessiva fixação.
  11. Mudar fixador seguinte período pós-correção para tampão cacodilato de sódio 0,1 M para armazenamento a 4 ºC.
    NOTA: As amostras armazenadas desta forma será preservado por um período significativo de tempo (até 12 meses), a fixação secundária no entanto oportuno e exame é recomendado para melhores resultados.

3. Agulha Perfusion

NOTA: fixação da agulha é uma variante da fixação de perfusão que envolve a injecção de fixador directamente no tecido do fígado de biópsia. O objectivo é que o fixador para ser liberado através dos vasos sanguíneos, a fim de desangrar-los e expor todo o bloco de tecido para fixador. Cuidados devem ser tomados para manter a pressão de injecção de baixa pressão para evitar ferimentos 18,19.

  1. Remover um pequeno pedaço de fígado do animal ou objecto e enxaguar em solução salina para remover o sangue e detritos.
  2. Desenhar a solução salina normal para a seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina).
  3. Injectar a solução salina muito lentamente para o fígado até que o sangue é empurrado para fora do tecido. As injecções múltiplas pode ser necessária.
  4. Desenhar o fixador EM de outra seringa equipada com uma agulha de calibre fino (tipicamente uma seringa de insulina).
  5. Injectar o fixador muito lentamente para o fígado até que se torne difícil e tan na cor. Injecção múltiplas pode ser necessária.
  6. Corte o fígado fixado em 1-2 mm3 blocos usando um bisturi afiado. Incubar em fixador EM para 24 - 72 h a 4 ° C. Lavar 3 vezes em tampão cacodilato de sódio 0,1 M antes de iniciar a fixação secundário.

4. Preparação para Microscopia Eletrônica de Varredura

  1. Lavar amostra 3 vezes em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Para corrigir lipídios, pós fixar a amostra em 2% de tetróxido de ósmio em tampão cacodilato de sódio 0,1 M durante 2 h.
    NOTA: Completo de lavar roupa é muito importante como cross glutaraldeído e tetróxido de ósmio reagir e gerar artefatos em SEM.
  2. Lavar as amostras em concentrações crescentes de etanol, para se iniciar a desidratação. Primeira lavagem em etanol a 50% durante 5 minutos; em seguida, 3 vezes durante 5 min com 70% de etanol; lavar três vezes durante 5 min com 90% de etanol; lavar duas vezes durante 5 min em etanol a 100%; e finalmente lavar duas vezes durante 10 min em etanol a 100% (crivo molecular).
  3. Remover todo o etanol a partir das amostras e substituir com hexametildissilazano (HMDS) em fumehood e deixe por 10 min. Remover HMDS a partir das amostras de tecidos e deixa-se evaporar.
    NOTA: HMDS é altamente higroscópico quando frio, portanto, permitir atingir a TA antes de usar pela etapa final desidratação.
  4. Opcionalmente, montar as amostras imediatamente ou colocá-los em um dessecador até que esteja pronto para montar para SEM.

5. Montagem

NOTA: montagem exemplar correto irá maximizar o número de sinusoids claramente delineados disponíveis para análise em MEV.

  1. Rotular a base dos metais tocos SEM e aplicar fita de carbono condutora dupla face para o topo da tocos.
  2. Visualizar amostras usando um microscópio de dissecação para identificar a superfície com as melhores sinusóides para subsequente SEM. Coloque a superfície para cima sobre a superfície da fita de carbono do topo.
  3. Espécimes da vara firmemente ao topo, as amostras estão agora prontas para revestimento por pulverização.
ove_title "> 6. Revestimento

NOTA: O revestimento da peça com uma fina película de metal condutor (ouro ou platina) em um recinto sputter coater o modelo e protege contra danos provenientes de um feixe de elétrons. Se o revestimento é muito grosso estruturas de interesse pode ser obscurecida.

  1. Coloque tocos na câmara de vácuo automática de revestidor por crepitação fina, para o modo de rotação e de revestimento por pulverização automático definido para 45 segundos. Use revestimento de platina para mais fino detalhamento, no entanto ouro também é adequado.
  2. Aplicar uma fina camada de tinta de carbono para as superfícies externas das amostras de fígado montados, tomando cuidado para não revestir as superfícies sinusoidais.
  3. Uma vez que as amostras são revestidas com platina e carbono tinta ter secado eles estão prontos para a observação sobre o SEM. As amostras podem ser armazenadas num exsicador.

7. Usando o Microscópio Eletrônico de Varredura

  1. Lugar espécimes em microscópio eletrônico de varredura e microscópio para retornar vácuo. </ Li>
  2. Usando procedimentos operacionais padrão microscópio para visualização de espécimes dando início a uma ampliação baixa, aumentando gradualmente a ampliação.
  3. Certifique-se o microscópio é ajustado apropriadamente para trabalhar a distância, tamanho de ponto e astigmatismo.
  4. Verifique se há integridade fixação. Se o LSEC é na maior parte livre de lacunas e contém fenestrations medição 30-250 nm de diâmetro isso geralmente indicam que a preparação de amostras foi bem sucedida.
  5. Se os sinusoids estão cheios de lacunas ou desprovido de fenestrações a preparação da amostra não foi bem sucedida ou se houver patologia significativa. Neste caso, cortar a amostra com uma lâmina de barbear muito fina, e as superfícies de corte recoberto e analisados ​​por sinusóides fixos com sucesso.
  6. Em aproximadamente 15.000-20.000 × ampliação seleccionar LSEC superfícies planas que estão livres de detritos com boa fixação e onde as fenestrações são claramente visíveis (contendo tipicamente pelo menos 10 fenestrações).
  7. Excepto imagens de pelo menos 10 por sinusóides do fígado, a partir de diferentes áreas dos blocos, utilizando, pelo menos, dois blocos por fígado. Amostragem 10 micrografias a 15.000 - 20.000 × ampliação por animal é geralmente suficiente para a quantificação de fenestrações para ser representativa de todo o fígado.

8. Análise

NOTA: O software ImageJ, que pode ser baixado gratuitamente a partir do NIH é utilizada para quantificar diâmetro fenestration e frequência ( www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. Abrir imagem J e definir a escala usando a barra de escala embutido na imagem (Screen shot 1).
  2. Usando a ferramenta de polígono em ImageJ, traço em torno de toda a área plana do LSEC incluindo áreas fenestrados e defenestrado. Não basta traçar os pratos perfurados, pois isso vai falsamente inflacionar porosidade. Excluir qualquer grandes peças de detritos que estão na superfície celular, que pode ser obscurifenestrations GN.
  3. Para medir o diâmetro fenestration, traçar uma linha através do maior diâmetro de cada fenestration selecionando a ferramenta de linha, e pressionar "m" para medir a linha, e "d" (empate) para desenhar de forma permanente a linha na imagem. Esta linha é definido como o diâmetro fenestra�o. O comprimento da linha de agora estará disponível na caixa de ImageJ de resultados (Screen shot 2).
  4. Medir todos os espaços que são furos maiores no citoplasma LSEC superior a 250 nm, assim como fenestrações. As lacunas são muitas vezes artefatos que refletem má perfusão ou fixação, no entanto lacunas também pode ocorrer como resultado de uma doença e toxicidade. Os dados para as lacunas serão excluídos do cálculo dos parâmetros fenestration mais tarde na análise.
  5. A área de lacunas que não são circulares deve ser calculada pelo traçado em torno das lacunas e calcular sua área em ImageJ.
  6. Cole os dados da caixa de resultados em ImageJ em uma planilha do Excel para furtheanálise r.

9. Cálculos

  1. Média fenestration diâmetro = média de todos os diâmetros fenestration (não incluindo as lacunas, onde as lacunas são ≥ 250 nm).
  2. Área Fenestração = πr 2, onde r, o raio, é calculado a partir do diâmetro fenestrações indivíduo (R = d / 2), não incluindo lacunas.
  3. Porosidade (%) = (Σ (πr 2) Área total analisado / - Σ (área de hiatos =)) (2 ^ M)) x 100.
  4. Frequência Fenestration = número total de fenestrações / (área total analisado-Σ (área de lacunas) (mm 2).

10. Apresentação de Dados Fenestration

NOTA: Sempre que possível, publicações, incluindo a quantificação de dados fenestration deve incluir as seguintes informações

  1. Fenestration diâmetro, com uma declaração confirmando o que diâmetros de fronteira onde usado para definir fenestrations (tipicamenteentre 50-250 nm), Fenestração frequência (número / uM 2) e a porosidade (%).
  2. Uma indicação que confirma se lacunas foram incluídos na análise, gráfico de distribuição de frequências de diâmetro fenestra�o e o número de blocos, os fígados, imagens e fenestrações devem ser incluídos na análise.

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Representative Results

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Visualização inicial em baixa ampliação por microscopia eletrônica de varredura revela uma superfície plana da amostra do fígado com uma área exposta grande o suficiente para observar muitas grandes vasos hepáticos e sinusóides (Figura 1A). Assegurar a colocação de bloco de fígado correta na montagem stub é essencial para a obtenção de imagens claras dos sinusóides e cápsula do fígado do Glisson deve ser evitado por este motivo (Figura 1B). O aumento da ampliação permite inspecção mais próxima da vasculatura densa do fígado e revela as placas de células únicas de hepatócitos que dividem os vasos (Figura 1C). Má fixação dos resultados de fígado em má qualidade de imagem, as células do sangue e detritos obscurecem a visão do fígado (Figura 1D).

Além disso o aumento da ampliação permite a observação de fenestrações LSEC (Figura 2A). É essencial que as sinusóides são corr rectamente identificados - as placas de hepatócitos pode, em algumas circunstâncias aparecer como vasos sanguíneos, mas características como a bile canalículos ajudar com orientação (Figura 2B). Alta pressão de perfusão pode causar artefatos, tais como grandes lacunas no endotélio, pensado para ser causado por coalescência das placas crivadas LSEC. Estes são facilmente identificadas no âmbito de SEM (Figura 2C). Evitando membrana celular directamente acima dos núcleos vai ajudar com precisão de densidade fenestra�o e cálculos de porosidade (Figura 2D).

Análise do LSEC com ImageJ permite a quantificação de LSEC diâmetro fenestra�o, a densidade e a frequência (Figura 3A). Estas dimensões proporcionam uma medida empírica de fenestrações e permitir medições das alterações induzidas pelo envelhecimento, doença, toxinas ou terapias (Figura 3B).

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Figura 1. Visualizando o fígado com SEM. (A) Inspecção inicial no âmbito do SEM revela os sinusóides do fígado e vasos maiores, incluindo as do trato portal e vênulas centrais, (b) a cápsula de Glisson abrange todos os detalhes das sinusóides; (C) A vasculatura denso do fígado e placas única célula de hepatócitos que se encontram entre os vasos;. (D) de fixação pobres resultados em sinusoids desmoronados e o desenvolvimento de artefatos ultra-estruturais Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. A ultra-estrutura do fígado. Fenestrations (A) LSEC são facilmente ver n no tecido bem fixo; (B) A superfície de um hepatócito com bem preservada canalículos biliares; (C) grandes lacunas no endotélio causada pela alta pressão de perfusão; (D) LSEC núcleos indicado pelas setas inchar sob a superfície o LSEC fina e não deve ser incluído na área de análise de porosidade. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Análise do LSEC com ImageJ. (A) A ferramenta poligonal permite a medição da área total para a medição e a ferramenta de linha é utilizada para medir o diâmetro fenestra�o; (B) Um histograma de frequência gerado pelos dados obtidos a partir de análise de Imagem J."Target =" _ blank 2698fig3large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Diâmetro (nm) Frequência (por um2) Porosidade (%) Referência
nd nd 60 ± 12 20
127 ± 4 nm 6,5 ± 0,5 4,6 ± 0,4 21
nd nd 40,5 22
nd 0,6 ± 1,4 0,01 ± 0,03
nd 2,5 ± 0,5 0,047 ± 0,012 24
87,25 ± 1,4 nd 9,22 ± 0,7 25
100-200 4,49 ± 0,69 2,55 ± 0,54 26
nd nd 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0,4 6,6 ± 0,2 28
nd 2,7 ± 1,1 4,1 ± 2,3 10
68 ± 1 8 ± 0,6 3,4 ± 0,2 29
nd nd 3,9 ± 0,2 30
73,3 ± 0,4 nd 2,2 ± 0,2 31
90,7 ± 11,7 8,45 ± 2,43 5,93 ± 2,05 4
110,7 ± 0,25 9 6 3
104,8 ± 0,22 13 8 3

Tabela 1.

Componente Artefato
Osmolaridade do fixador e buffer muito baixo (hipotônica) Inchaço celular
Osmolaridade do fixador e buffer muito alto (hipertônica) Encolhimento celular
Espécime tamanho demasiado grande Fixador não pode penetrar longe o suficiente durante a incubação = autólise / fixação inadequada
pH do fixador e tampão antes de ósmio inferior a 7,2 ou superior a 7,4 A desnaturação de proteínas e deformidades estruturais
Fixação tempo muito curto Autólise
Fixação tempo demasiado longo Pode causar encolhimento celular
Temperatura alta Aumenta a velocidade de fixação no entanto podem desnaturar proteínas
Temperatura baixa Fixação inadequada
A pressão de perfusão demasiado elevado Lacunas, espaço do alargamento Disse, vacúolos em hepatócitos, perda de pratos perfurados, arregalando de diâmetro fenestration
Os danos mecânicos quando picados e / ou com a pinça Trituração de estruturas celulares se o tecido não é suficientemente bem endurecido pelo fixador
Tempo prolongado de fixação após a morte, a biópsia espécime, ou exsanguination Isquemia, autólise, a formação de espaços, defenestração
Volume de incubação baixo fixador Menos de 20 vezes o volume da amostra = penetração inadequada do fixador e autólise no centro de blocos.
Fixative concentração demasiado elevada Concentração afeta a taxa de fixação e penetração do fixador. Formação de artefato.
Fixador concentração muito baixa Esgotamento do fixador antes de o processo de fixação é blebbing célula produtora completa e outros artefatos.
Sinais de fixação incompleta no fígado Blebbing celular (microvilosidades inchada ou originários do citoplasma), defenestração, lacunas, perda das microvilosidades, as mitocôndrias inchado, inchaço celular, lumens sinusoid desabaram ou comprimido, sangue no lúmen senoidais, núcleos de hepatócitos de forma irregular
Contaminação sanguínea do fixador Desativa fixador
Perfusão sujo e equipamentos de preparação Espécime contaminação com detritos e bactérias
Desidratação incompleta das amostras ou armazenamento sem dessecante após o revestimento Specihomens cobrar-up em SEM. Adição de tinta de carbono para o bloco pode ajudar a reduzir a carga

Tabela 2. Dicas de solução de problemas para amostra pobres e qualidade de imagem.

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Discussion

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A capacidade de medir de forma precisa e reprodutivelmente o estado do endotélio sinusoidal fígado é um passo importante na compreensão da biologia destas células altamente especializadas. Novas técnicas, como a microscopia de iluminação estruturada 32, microscopia de força atômica e 33 d-STORM (direto Stochastic Optical Reconstrucion Microscopia) 34 irá transmitir informações importantes sobre a morfologia destas células in vitro, mas SEM continua a ser a principal metodologia de visualizar e medir a sua estrutura em situ.

O passo mais crucial e tecnicamente desafiador é a fixação inicial: se o fígado é preservada bem os passos subsequentes irá produzir facilmente observável e, de fato, bonito, imagens do sinusoid fígado. Perfusão hepática todo é o método mais eficaz para garantir uma boa fixação, mas resultados comparáveis ​​são possíveis em amostras de perfusão de agulhas que foram corrigidos rapidamentee sob baixa pressão. A reabsorção de água pelas amostras de fígado desidratados é uma outra razão comum para imagens SEM pobres, mas isto pode ser facilmente evitada pelo armazenamento adequado das amostras em um exsicador com dessecante.

Há uma necessidade de normalização da quantificação de fenestrações de modo que os estudos de diferentes grupos de pesquisa podem ser comparadas e interpretado. No passado houve grande variação nos valores publicados com muito pouca informação metodológica sobre como esses valores foram obtidos. Aqui nós fornecemos uma abordagem padronizada para a determinação e apresentação de valores que descrevem fenestration ultra-estrutura.

Sempre que possível, publicações, incluindo a quantificação de dados fenestration deve incluir as seguintes informações: diâmetro Fenestration, com uma declaração confirmando o que diâmetros de fronteira onde usado para definir fenestrations (tipicamente entre 50-250 nm); fenestration frequência (número / &# 181; 2 m) e porosidade (%); uma declaração confirmando se lacunas foram incluídos na análise; e um gráfico de distribuição de freqüência de diâmetro fenestration. Além disso, o número de blocos, os fígados, imagens e fenestrações devem ser incluídos na análise.

Diâmetro Fenestration, frequência e porosidade são indicadores importantes do estado do fígado e padronizar a coleta de dados será benéfico para o campo. Os métodos discutidos aqui fornecer um quadro para garantir que os estudos sobre a ultra-estrutura do LSEC e fenestrações são realizadas e apresentadas de uma forma comparável em diferentes grupos de pesquisa. A metodologia pode ser facilmente adaptada para medir fenestrações em LSECs isoladas e cultivadas.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Um método padronizado para a Análise do fígado sinusoidal células endoteliais e Seus fenestrações por Microscopia Eletrônica de Varredura
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Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

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