Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

En standardiserad metod för analys av lever Sinusformig endotelceller och deras fenestrationer genom svepelektronmikroskopi

doi: 10.3791/52698 Published: April 30, 2015
* These authors contributed equally

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De lever sinus endotelceller (LSECs) är mycket differentierade endotelceller som kantar väggen av leversinus. LSECs är perforerade med fenestrationer som är icke-diaphragmed, porer transcellulär 50-250 nm i diameter. Upp till 20% av ytan på LSECs är täckt av fenestrationer, som vanligtvis i grupper om tiotals till hundratals kallade sållningsplattor 1-3 (Figur 1). Fenestrationer möjliggöra överföring av plasma och nanosubstrates mellan blod och hepatocyter, vilket skapar en mycket effektiv ultrafiltreringssystem. Fenestrationer är dynamiska strukturer - både deras storlek och / eller nummer kan ändras som svar på olika fysiologiska tillstånd, läkemedel och sjukdomar. Till exempel, fenestrationer är större i den fastande än i födointag 4; 2-di-iodoamphetamine ökar fönsternummer, 5,6 och en minskning i storlek och antal fenestrationer per cell sker i åldrande och många sjukdomstillstånd 7-13 1.

Studien av fenestrationer är svårt. Diametern på fenestrationer ligger under upplösningen av konventionella ljusmikroskop, så tidigare bara observation med hjälp av elektronmikroskopi både i intakta levervävnad eller odlade LSECs har varit möjligt. Den svepelektronmikroskop (SEM) har oftast använts för att studera fönsterstorlek, frekvens och porositet (andelen LSEC membran som är perforerad av fenestrationer) eftersom SEM möjliggör observation av stora delar av endotelytan och mätning av tusentals, om inte tiotusentals fenestrationer. Trots dess användbarhet, de resultat som rapporterats från SEM baserade studier förLSEC parametrar såsom fönsterstorlek, antal, frekvens och porositet varierar kraftigt i litteraturen (Tabell 1).

Fenestrationer och silplattor är ömtåliga strukturer som kontraktet bryts, vidgar eller smälter samman under extraktion behövs därför noggrann behandling för att bevara sin integritet. Förhöjda perfusionstryck 14; felaktig osmolaritet fixativ och buffertar 15; otillräcklig fixering eller fixering tid; och hastighet efter fixering dehydratisering och torkning är alla områden av behandling för SEM som kan producera artefakter som stör bevarandet av ultrastrukturen (Figur 2). Förlust av fenestrationer (defenestration ") och fönster krympning kan uppstå som en följd av dålig fixering, vilket resulterar i minskad fenestration diameter och cell porositet. Metoder för att förbättra bevarandet av exemplar för SEM-analys har beskrivits tidigare 15-17 och kommer att diskuterashär med ytterligare tips om hur man kan förbättra prov bevarande. De viktigaste målen för provet bevarande är att ta bort blod från sinusoids så att ytan av LSEC kan visualiseras och för att undvika LSEC skador från antingen högt tryck eller fördröjd fixering. Hela leverperfusion fixativ via portalen ven är den lämpligaste metoden för lever fixering. Såsom beskrivs i detalj på annat ställe 16,18 perfusionen måste genomföras vid lågt tryck (t ex 10 cm av H 2 0) för att undvika tryckrelaterade perfusion artefakter och skador på LSEC, typiskt visar sig som stora luckor inom i cellmembranet. Emellertid kan rimlig fixering ofta erhållas med användning av nål perfusion av leverbiopsier från människor och djur, såsom beskrivs i detalj på annan plats 19. Denna teknik innebär att direkt injicera fixativ i vävnaden tills blodet spolas ut ur provet och vävnaden är fast och fast. Fixering av prover för elektronmikroskopi måste vara perfOrmed så snabbt som möjligt efter avslutad blodflödet för att förhindra ultra förändringar som sker som en följd av de lever extremt snabba autolytiska processer.

Vi presenterar också en metod för bildanalys som minimerar införandet av artefakter, och standardiserar mätningen av fenestrationer. Variation i valet av sinus för mikrofotografier, bildanalys av artefakter, och mätning av cellområdet för porositet och fönsterfrekvens har lett till stora skillnader i publicerade resultat. En standardiserad metod för utvärdering och mätning av fenestrationer och de minimikrav för datapresentation har inte klart upp i litteraturen tidigare 4,10,20-31.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

OBS: Alla förfaranden som omfattar användning av djur genomförs i enlighet med den lokala lagstiftningen. Vårt arbete har godkänts av Sydney lokala sjukvårdsdistrikt djurskyddskommitté. De tillåtna förfaranden beskrivs i dokumentationen projektet licens och följa riktlinjer som säkerställer djurens välbefinnande hela tiden. Att säkerställa att lagstiftningen om djurförsök i det land där arbetet utförs.

1. Protokoll för framställning EM Fixative

  1. För 100 ml fixeringsvätska, förbereda paraformaldehyd genom att tillsätta 2 g paraformaldehyd pulver till 25 ml destillerat vatten i en konisk kolv, värme till 65 ° C, under ständig omrörning med en magnetisk omrörare.
    OBS: glutaraldehyd, paraformaldehyd och natriumkakodylatbuffert är alla farliga ämnen och måste alltid hanteras i fumehood.
  2. Värm vid 65 ° C i 2 minuter och låt sedan svalna. Om det behövs, tillsätt natriumhydroxidlösningen dropwise under omröring för att rensa lösning helt.
    OBS: natriumhydroxid är farligt, handtag med omsorg.
  3. Tillsätt 10 ml EM-grad lager glutaraldehyd, 50 ml av 0,2 M natrium-kakodylatbuffert och 2 g av sackaros och rör om med magnetomrörare. Tillsätt 2 ml av 1,0 M CaCl 2.
  4. Justera till pH 7,4 innan du köper lösning upp till 100 ml med destillerat vatten. Den slutliga fixativ innehåller 2,5% glutaraldehyd, 2% paraformaldehyd, 2 mmol CaCl2, 2% sackaros i 0,1 M kakodylatbuffert. Se till att den totala Osmolalitet är 440 mOsmol / L. Använd inom 24 timmar av förberedelser.

2. Perfusion Fixering av lever

  1. Varm perfusionsbuffert och fixativ till 35-37 ° C. Rätt temperatur av exsanguination buffert och fixerings bidrar till att säkerställa vävnadsintegritet.
  2. Söva djuret med en enda intraperitoneal injektion av 50 mg / kg Ketamin och 5 mg / kg Xylazin.
  3. När djuret är underdjup anestesi, bedöms av bakbenen tillbakadragande och svans nypa, är en Y-snitt med trubbiga slutade sax i djurets buk att exponera levern och portvenen.
    OBS: Se till att utrustningen är ren för att undvika kontaminering av prover med mikroorganismer och allmänna skräp som kommer lätt ses på SEM.
  4. Bind två mycket lösa suturer runt portvenen en proximalt till levern, den andra mer distalt till levern.
  5. Kanylera portvenen med en lämpligt dimensionerad IV-kanyl (18 G för råttor, 22 G för möss) .Tighten suturer för att säkra kanylen.
  6. Påbörja perfusion med fosfatbuffrad saltlösning värms till 37 ° C, och vid ett tryck av 10 cm H 2 0. Mellan 5 och 20 ml PBS krävs vanligtvis för att exsanguinate levern.
    OBS: inte att tillåta luftbubblor att komma in i levern genom rören är anslutna till kanylen som de förmå artefakter sekundärt till embolisering och tryck; Skador på hepatocyterna, sinusoids och LSEC fenestrationer uppstår om perfusion trycket är för högt.
  7. Sever buken och bröst hålvenen att tillåta bufferten att lämna fritt från levern. Detta förhindrar högt mottryck skador LSECs.
  8. När levern är fri från blod, ersätta PBS med EM fixativ och BEGJUTA i ca 5 minuter, tills levern är härdad och mycket blek.
  9. Avbryt perfusion och skär den fasta lever i 1 - 2 mm 3 kvarter med en vass skalpell.
  10. Post-fix vävnad i EM fixativ för 24 - 72 timmar vid 4 ° C.
    OBS: I allmänhet orsakar underfixation fler föremål än overfixation.
  11. Ändra fixerings efter post-fix period till 0,1 M natriumkakodylatbuffert för lagring vid 4 ° C.
    OBS: Prover som lagras på detta sätt kommer att bevaras under en längre tid (upp till 12 månader), men tid sekundär fixering och undersökning rekommenderas för bästa resultat.

3. Nål Perfusion

OBS: Needle fixering är en variant av perfusion fixering som innebär injektion av fixativ direkt i biopsier levervävnad. Målet är att fixerings spolas genom blodkärlen för att exsanguinate dem och avslöja alla vävnadsblock att fixativ. Man måste vara försiktig för att hålla injektionstrycket lågt för att undvika tryckskador 18,19.

  1. Ta bort en liten bit av levern från djuret eller ämnet och skölj i saltlösning för att avlägsna blod och skräp.
  2. Rita den normal saltlösning in i spruta försedd med en fin gauge nål (typiskt en insulinspruta).
  3. Injicera saltlösning mycket långsamt in i levern tills blodet spolas ut ur vävnaden. Multipla injektioner kan krävas.
  4. Rita EM fixativ till en annan spruta med en fin nål (typiskt en insulinspruta).
  5. Injicera fixativ mycket långsamt in i levern tills det blir hårt och tan i färg. Multipel injektionar kan krävas.
  6. Skär fasta lever i 1 - 2 mm 3 kvarter med en vass skalpell. Inkubera i EM fixativ för 24 - 72 timmar 4 ° C. Tvätta tre gånger i 0,1 M natriumkakodylatbuffert innan påbörjas sekundär fixering.

4. Förberedelser inför Svepelektronmikroskopi

  1. Tvätta prov 3 gånger i 0,1 M natrium-kakodylatbuffert. För att fixa lipider, posta fixera provet i 2% osmiumtetroxid i 0,1 M natriumkakodylatbuffert under 2 h.
    OBS: Komplett tvätt är mycket viktigt eftersom glutaraldehyd och osmiumtetroxid korsreagerar och generera artefakter på SEM.
  2. Skölj proverna i ökande koncentrationer av etanol för att påbörja uttorkning. Första sköljning i 50% etanol under 5 minuter; sedan tre gånger i 5 min med 70% etanol; skölj 3 gånger under 5 min med 90% etanol; skölj två gånger under 5 minuter i 100% etanol; och slutligen skölj två gånger under 10 min i 100% etanol (molekylsikt).
  3. Ta bort all etanol från proven och ersätt med hexametyldisilazan (HMDS) i fumehood och låt stå i 10 minuter. Ta HMDS från vävnadsprover och låt avdunsta.
    OBS: HMDS är mycket hygroskopisk när den är kall därför möjligt att nå RT innan du använder för slutlig dehydratiseringssteg.
  4. Eventuellt montera prover omedelbart eller placera dem i en torkapparat tills att montera för SEM.

5. Montering

OBS: Korrekt provmontering kommer att maximera antalet tydligt avgränsade sinuskurvor tillgängliga för analys inom ramen för SEM.

  1. Märk basen av metall SEM stubbar och tillämpa dubbelhäftande ledande kol tejp på toppen av stubbar.
  2. Visualisera prover med hjälp av en dissekera mikroskop för att identifiera ytan med de bästa sinusoiderna för efterföljande SEM. Placera denna yta uppåt på kolet bandets yta stubben.
  3. Stick prover ordentligt på stubben, exemplar är nu redo för sputterbeläggning.
ove_title "> 6. Beläggning

OBS: Beläggning provet med en fin film av ledande metall (guld eller platina) i en spotta bestrykningsstationer skäl provet och skyddar den från skador från elektronstrålen. Om beläggningen är alltför tjocka strukturer av intresse kan skymmas.

  1. Placera stubbar i vakuumkammare automatisk fina spotta bestrykare, inställningsmod för rotation och automatisk sputterbeläggning under 45 sekunder. Använd platinabeläggning för finare detaljer, men guld är också lämplig.
  2. Applicera ett tunt lager av kol färg på de yttre ytorna av de monterade leverprover, noga med att inte belägga sinusytorna.
  3. När proverna är belagda med platina och kol färgen har torkat de är redo för observation på SEM. Prover kan förvaras i en torkapparat.

7. Använda svepelektronmikroskop

  1. Placera prover i svepelektronmikroskop och retur mikroskop för att vakuum. </ Li>
  2. Med användning av standard mikroskop rutiner för visualisering av prover från början vid en låg förstoring, gradvis ökande förstoring.
  3. Se till att mikroskopet justeras på lämpligt sätt för arbetsavstånd, punktstorlek och astigmatism.
  4. Kontrollera för fixering integritet. Om LSEC är oftast fri från brister och innehåller fenestrationer mäter 30-250 nm i diameter skulle i allmänhet visar att extraktion har varit framgångsrik.
  5. Om sinusoiderna är fulla av luckor eller saknar fenestrationer provet preparatet inte har varit framgångsrik eller om det finns betydande patologi. I det här fallet, skiva provet med en mycket fin rakblad, och de skurna ytorna övermålas och analyseras för att framgångsrikt fasta sinusoider.
  6. Vid ungefär 15,000-20,000 gångers förstoring välj plana LSEC ytor som är fria från skräp med god fixering och där fenestrationer är klart synliga (typiskt innehållande minst 10 fenestrationer).
  7. Spara bilder, varav minst 10 sinusoiderna per lever, från olika delar av blocken, med hjälp av åtminstone två block per levern. Provtagning 10 mikrofotografier på 15.000 - 20.000 gångers förstoring per djur är i allmänhet tillräckligt för kvantifiering av fenestrationer vara representativ för hela levern.

8. Analys

OBS: ImageJ programvara som kan laddas ner gratis från NIH används för att kvantifiera fönster diameter och frekvens ( www.imagej.nih.gov/ij ).

  1. Öppna bild J och ställ in skala med hjälp av skalan bar inbäddad i bilden (Skärmdump 1).
  2. Använda polygonverktyget i ImageJ, spår runt hela plan yta av LSEC inklusive Fenestrated och defenestrerades områden. Inte bara spåra silplattor eftersom det felaktigt att blåsa porositet. Uteslut eventuella stora bitar av skräp som finns på cellytan som kan vara obscuring fenestrationer.
  3. För att mäta fönsterdiameter, spåra en linje genom den längsta diametern hos varje fönster genom att välja linjeverktyget och trycka på "m" för att mäta linjen, och "d" (oavgjort) för att permanent dra gränsen på bilden. Denna linje definieras som fenestrationen diametern. Längden av linjen kommer nu att vara tillgängliga i resultat låda med ImageJ (skärm sköt 2).
  4. Mät alla luckor som är större hål i LSEC cytoplasman över 250 nm, samt fenestrationer. Luckor är ofta föremål som återspeglar dålig perfusion eller fixering, men luckor även kan uppstå som en följd av sjukdom och toxicitet. Uppgifterna för luckor kommer att uteslutas från beräkningen av fenestration parametrar senare i analysen.
  5. Området luckor som inte är rund skall beräknas genom att spåra runt luckorna och beräkna sitt område på ImageJ.
  6. Klistra in data från resultaten rutan i ImageJ i ett Excel-ark för further-analys.

9. Beräkningar

  1. Genomsnittlig fönsterdiameter = genomsnitt för alla fenestration diameter (exklusive luckor, där brister är ≥ 250 nm).
  2. Fenestration area = πr 2, där r, radien, beräknas från de enskilda fenestrationer diametern (r = d / 2), inte inklusive luckor.
  3. Porositet (%) = (Σ (πr 2) / total yta analyseras - Σ (område med luckor =)) (im 2)) x 100.
  4. Fenestration frekvens = totala antalet fenestrationer / (total yta analyseras-Σ (område luckor) (im 2).

10. Framläggande av Fenestration Data

OBS: När det är möjligt, publikationer inklusive kvantifiering av fenestration uppgifter bör innehålla följande uppgifter

  1. Fönster diameter, med ett uttalande som bekräftar vad gräns diameter där används för att definiera fenestrationer (vanligtvismellan 50-250 nm), Fenestration frekvensen (antal / xm 2) och porositet (%).
  2. Ett uttalande som bekräftar huruvida luckor har tagits med i analysen, frekvensfördelning diagram över fönsterdiameter och antalet lever, block, bilder och fenestrationer bör ingå i analysen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Inledande visualisering vid låg förstoring genom svepelektronmikroskopi visar en plan yta av levern provet med en exponerad yta stor nog att observera många stora lever fartyg och sinussignaler (Figur 1A). Garantera rätt lever blocket placering på monterings stubben är viktigt för att erhålla klara bilder av sinusoider och Glisson kapsel i levern bör undvikas av detta skäl (Figur 1B). Öka förstoringen tillåter närmare inspektion av den täta kärlen i levern och avslöjar encelliga plattor av hepatocyter som delar fartyg (Figur 1C). Dålig fixering av levern resulterar i dålig bildkvalitet, blodceller och skräp skymma vyn i levern (figur 1D).

Ytterligare ökning av förstoringen tillåter observation av LSEC fenestrationer (Figur 2A). Det är viktigt att de sinusvågor är korr rekt identifierade - plattorna i hepatocyter kan under vissa omständigheter se ut som blodkärl, men funktioner som gallcanaliculi hjälpa till med orientering (Figur 2B). Högt perfusionstryck kan orsaka artefakter såsom stora luckor i endotelet, som tros orsakas av sammansmältning av LSEC silplattor. Dessa är lätta att identifiera enligt SEM (Figur 2C). Undvika cellmembranet direkt ovanför kärnorna kommer att bidra med en noggrannhet på fönster densitet och porositet beräkningar (Figur 2D).

Analys av LSEC med ImageJ tillåter kvantifiering av LSEC fenestration diameter, densitet och frekvens (figur 3A). Dessa dimensioner ger en empirisk mätning av fenestrationer och låta mätningar av förändringar inducerade av åldrande, sjukdom, toxiner eller behandlingar (Figur 3B).

filer / ftp_upload / 52.698 / 52698fig1.jpg "/>
Figur 1. Visualisering levern med SEM. (A) Inledande inspektion enligt SEM avslöjar sinusoider i levern och större fartyg, inklusive dem i portalen vägarna och centrala venoler, (b) Glisson kapsel omfattar alla uppgifter om de sinusvågor, (C) Den täta kärlen i levern och encelliga plattor av hepatocyter som ligger mellan fartygen,. (D) Dålig fixering resulterar i kollapsade sinusoider och utveckling av ultra artefakter Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2
Figur 2. Ultrastrukturen av levern. (A) LSEC fenestrationer är lätt se n väl fixerat, (B) Ytan på en hepatocyte med välbevarad gallcanaliculi, (C) Stora brister i endotel orsakade av högt perfusionstryck, (D) LSEC kärnor pilarna buktar under ytan av den tunna LSEC och bör inte ingå i området för porositet analys. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. Analys av LSEC med ImageJ. (A) polygonal verktyget kan mäta den totala areal för mätning och linjeverktyget används för att mäta fönsterdiameter, (B) En frekvens histogram som alstras av de data som erhållits från Image J-analys.2698fig3large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Diameter (nm) Frekvens (per UM2) Porositet (%) Referens
na na 60 ± 12 20
127 ± 4 nm 6,5 ± 0,5 4,6 ± 0,4 21
na na 40,5 22
na 0,6 ± 1,4 0,01 ± 0,03
na 2,5 ± 0,5 0,047 ± 0,012 24
87,25 ± 1,4 na 9,22 ± 0,7 25
100-200 4,49 ± 0,69 2,55 ± 0,54 26
na na 23 ± 2 27
85 ± 17 11 ± 0,4 6,6 ± 0,2 28
na 2,7 ± 1,1 4,1 ± 2,3 10
68 ± 1 8 ± 0,6 3,4 ± 0,2 29
na na 3,9 ± 0,2 30
73,3 ± 0,4 na 2,2 ± 0,2 31
90,7 ± 11,7 8,45 ± 2,43 5,93 ± 2,05 4
110,7 ± 0,25 9 6 3
104,8 ± 0,22 13 8 3

Tabell 1.

Komponent Artefakt
Osmolaritet fixativ och buffert för låg (hypotonisk) Cell svullnad
Osmolaritet fixativ och buffert för hög (hypertonisk) Cellkrympning
Prov storlek för stor Fixative kan inte tränga tillräckligt långt under inkubation = autolys / otillräcklig fixering
pH i fixerings och buffert före osmium mindre än 7,2 eller över 7,4 Protein denaturering och strukturella missbildningar
Fixering tid för kort Autolys
Fixering för lång Kan orsaka cellkrympning
Temperatur hög Ökar fixering hastighet men kan denaturera proteiner
Temperatur låg Otillräcklig fixering
Perfusion Trycket är för högt Luckor, utrymme för Disse utvidgningen, vakuoler i leverceller, förlust av silplattor, breddning av fönsterdiameter
Mekanisk skada när mals och / eller med pincett Krossning av cellstrukturer om vävnaden inte härdas tillräckligt genom fixerings
Förlängd tid fixering efter döden, prov biopsi, eller exsanguination Ischemi, autolys, spalt bildning, defenestration
Låg fixativ inkubationsvolym Mindre än 20 gånger provvolymen = otillräcklig penetration av fixativ och autolys i centrum av block.
Fixative koncentration är för hög Koncentrationen påverkar graden av fixering och penetrering av fixeringsmedel. Artefakt bildning.
Fixativ koncentration för låg Konsumtion av fixerings före fixeringsprocessen är klar producerande cell blåsbildning och andra artefakter.
Tecken på ofullständig fixering i levern Cellblåsbildning (svullna mikrovilli eller härrör från cytoplasman), defenestration, luckor, förlust av mikrovilli, svullen mitokondrier, cell svullnad, sinusvåg lumen kollapsade eller komprimerade, blod i sinus lumen, oregelbundet formade hepatocyter kärnor
Kontaminering av fixativ blod Deaktiverar fixativ
Dirty perfusion och prepareringsutrustning Prov förorening med skräp och bakterier
Ofullständig uttorkning av proverna eller lagring utan torkmedel efter beläggning Specimän ladda upp på SEM. Lägga kol färg på blocket kan bidra till att minska laddning

Tabell 2. Felsökningstips för fattiga prov och bildkvalitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Förmågan att noggrant och reproducerbart mäta status levern sinus endotel är ett viktigt steg i att förstå biologi dessa mycket specialiserade celler. Nyare tekniker såsom strukturerad belysning mikroskopi 32, atomkraftsmikroskopi 33 och d-STORM (direkt Stochastic Optical Reconstrucion Microscopy) 34 kommer att ge viktig information om morfologin hos dessa celler in vitro men SEM fortfarande den främsta metoden för att visualisera och mäta deras struktur i situ.

Den mest avgörande och tekniskt utmanande steg är den första fixering: om levern bevaras väl de efterföljande stegen kommer att producera lätt observerbara och faktiskt, vacker, bilder av levern sinus. Hela leverperfusion är den mest effektiva metoden för att säkerställa god fixering, men jämförbara resultat är möjliga i nål perfusion prover som har fastställts snabbtoch under lågt tryck. Resorption av vatten genom de torkade leverprover är en annan vanlig orsak till dålig SEM-bilder, men detta kan lätt undvikas genom korrekt lagring av proverna i en exsickator med torkmedel.

Det finns ett behov av standardisering av kvantifiering av fenestrationer så att studier från olika forskargrupper kan jämföras och tolkas. I det förflutna har det varit stora variationer i värden som offentliggjordes med mycket lite metod information om hur dessa värden erhölls. Här visar vi en standardiserad metod för att bestämma och presentera värden som beskriver fenestration ultra.

När det är möjligt, publikationer, inklusive kvantifiering av fenestration uppgifter bör innehålla följande uppgifter: Fenestration diameter, med ett uttalande som bekräftar vad gräns diameter där används för att definiera fenestrationer (typiskt mellan 50-250 nm); fönster frekvens (antal / &# 181; m 2) och porositet (%); ett uttalande som bekräftar huruvida luckor har tagits med i analysen; och en frekvensfördelning diagram över fenestration diameter. Dessutom bör antalet lever, block, bilder och fenestrationer ingå i analysen.

Fönster diameter, frekvens och porositet är viktiga indikatorer på leverstatus och standardisera insamlingen av dessa uppgifter kommer att vara till nytta för området. De metoder som diskuteras här ger en ram för att säkerställa att studier av ultra av LSEC och fenestrationer utförs och presenteras på ett jämförbart sätt mellan olika forskargrupper. Metodiken är lätt anpassas till att mäta fenestrationer i isolerade och odlade LSECs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25% EM grade Glutaraldehyde ProSciTech C001 Store stock at -20 C until needed, avoid refreeze
Paraformaldehyde powder Sigma Aldrich 158127 Always prepare Paraformaldehyde fresh
Sodium Cacodylate powder Sigma Aldrich C0250 Prepare 0.2 M stock, pH 7.4 by dissolving powder in dH2O, used mostly at 0.1 M by preparing 1:2 dilution
Calcium Chloride Sigma Aldrich C1016 Prepare 1 M CaCl2by dissolving powder in dH2O
Osmium tretroxide ProSciTech C011 Wash ampoules in weak acid prior to use to avoid contamination. Prepare 2 % stock in glass bottle
Ethanol- Absolute Sigma Aldrich 459836  100 % Ethanol must be high grade and stored with Molecular Sieve
Other grades of Ethanol Labtech EL5 Prepare graded Ethanols with dH2O
Hexamethyldisilazane Sigma Aldrich 52619  Allow to reach room temperature before use
Cannulas Terumo TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C 18 G is suitable for most rats, 22 G is suitable for most mice, but it is good to have a few 24 G on hand in case of very small mice
Conductive Carbon tape ProSciTech IA0201
Carbon Paint ProSciTech I003
Ketamine Must be obtained under license
Xylazine Must be obtained under license
Molecular Sieve Sigma Aldrich 208647 Removes water from the 100 % Ethanol

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. The Liver: Biology and Pathobiology. Arias, I. M., et al. John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).
  2. Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis. Hepatology. 21, 863-874 (1995).
  3. Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse. Hepatology. 5, (4), 683-692 (1985).
  4. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell. Pathology. 42, (3), 255-258 (2010).
  5. Tian, Y., et al. Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice. Hepatology. 53, (1), 253-262 (2011).
  6. Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells. J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69, (5), 514-518 (2013).
  7. Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells. J Electron Microsc. 59, (1), 65-69 (2010).
  8. Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. 191-216 (2010).
  9. McLean, A. J., et al. Age-related pseudocapillarization of the human liver. J Pathol. 200, (1), 112-117 (2003).
  10. Le Couteur, D. G., et al. Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver. Hepatology. 33, (3), 537-543 (2001).
  11. Cogger, V. C., et al. The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver. Pharmacol Toxicol. 89, (6), 306-311 (2001).
  12. Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study. Hepatology. 7, (1), 77-82 (1987).
  13. Jamieson, H. A., et al. Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes. Diabetologia. 50, (9), 1969-1976 (2007).
  14. Fraser, R., et al. High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers. Br J Exp Pathol. 61, (2), 222-228 (1980).
  15. Wisse, E. An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids. J Ultrastruct Res. 31, (1), 125-150 (1970).
  16. Wisse, E. An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells. J Ultrastruct Res. 38, (5), 528-562 (1972).
  17. Fahimi, H. D. Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde. Lab Invest. 16, (5), 736-750 (1967).
  18. Wisse, E., et al. Fixation methods for electron microscopy of human and other liver. World J Gastroenterol. 16, (23), 2851-2866 (2010).
  19. Vreuls, C., et al. Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies. Hepatology. 59, (2), 737-739 (2014).
  20. Furrer, K., et al. Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway. Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108, (7), 2945-2950 (2011).
  21. Zhang, Q., et al. OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1. J Mol Endocrinol. (2014).
  22. May, D., et al. A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations. PLoS One. 6, (7), e21478 (2011).
  23. Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells. Biochem Biophys Res Commun. 280, (2), 481-485 (2001).
  24. Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells. Liver Int. 33, (9), 1386-1397 (2013).
  25. Wack, K. E., et al. Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver. Hepatology. 33, (9), 363-378 (2001).
  26. Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat. Hepatology. 21, (2), 539-544 (1995).
  27. Straub, A. C., et al. Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide. J Clin Invest. 118, (12), 3980-3989 (2008).
  28. Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life. JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97, (1-3), 197-206 (1986).
  29. Jamieson, H. A., et al. Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid. Exp Gerontol. 42, (4), 374-378 (2007).
  30. Cogger, V. C., et al. Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link. Atherosclerosis. 189, (2), 273-281 (2006).
  31. Cogger, V. C., et al. The effects of oxidative stress on the liver sieve. J Hepatol. 41, (3), 370-376 (2004).
  32. Cogger, V. C., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J Struct Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  33. Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells. J Electron Microsc. 50, (4), 283-290 (2001).
  34. Monkemoller, V., et al. Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy. Phys Chem Chem Phys. 16, (24), 12576-12581 (2014).
En standardiserad metod för analys av lever Sinusformig endotelceller och deras fenestrationer genom svepelektronmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).More

Cogger, V. C., O'Reilly, J. N., Warren, A., Le Couteur, D. G. A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy. J. Vis. Exp. (98), e52698, doi:10.3791/52698 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter