Abstract
In gewervelde dieren, wordt hematopoiesis gereguleerd door inductieve micro-omgevingen (niches). Ook in de ongewervelde modelorganisme Drosophila melanogaster, inductieve microenvironments bekend als larvale Hematopoëtische Zakken (HP's) zijn geïdentificeerd als anatomische plaatsen voor de ontwikkeling en regulering van de bloedcellen (hemocytes), in het bijzonder van de zelfvernieuwende macrofaaglijn. HPs zijn segmentaal herhaalde zakken tussen de epidermis en de spierlagen van de larve, waarvan ook sensorische neuronen van het perifere zenuwstelsel. In de larve, zijn resident (zittend) hemocytes blootgesteld aan anti-apoptotische, lijm en proliferatieve signalen van deze sensorische neuronen en mogelijk andere componenten van de HPs, zoals de voering spieren en epitheliale lagen. Tijdens de normale ontwikkeling, de geleidelijke afgifte van ingezeten hemocytes van de HPs brandstoffen de bevolking van circulerende hemocytes, die culmineert in de release van de most van de bewoner hemocytes begin metamorfose. Immuunsysteem aanvallen, lichamelijk letsel of mechanische storing leiden tot de voortijdige vrijlating van ingezeten hemocytes in omloop. De schakelaar van larvale hemocytes tussen ingezeten locaties en de bloedsomloop verhoogt de noodzaak van een gemeenschappelijke norm / procedure om selectief te isoleren en te kwantificeren deze twee populaties van bloedcellen uit enkele Drosophila larven. Derhalve is dit protocol beschrijft een geautomatiseerde methode om los te laten en te kwantificeren van de bewoner en circulerende hemocytes van enkele larven. De werkwijze faciliteert ex vivo technieken, en kunnen worden aangepast aan een verscheidenheid van ontwikkelingsstadia van Drosophila en andere ongewervelde organismen dienen.
Introduction
Onderzoek in de ongewervelde model Drosophila melanogaster is de ontdekking van aangeboren immuniteit 1 gereden, en heeft het begrip van de verschillende aspecten van bloedcellen ontwikkeling 2-4. Drosophila hematopoiesis kan worden onderverdeeld in de lijn van embryonale / larvale hemocytes, van oorsprong uit de vergemakkelijkt embryo en uit te breiden in de larve en het geslacht van lymfeklier hemocytes 4,5. Hier presenteren we een protocol dat zich richt op de lijn van embryonale / larvale hemocytes, die in de Drosophila larven bestaat hoofdzakelijk plasmatocytes (macrofagen) en enkele kristallen 4 cellen. In de larve, hemocytes van het embryo blijven bestaan en koloniseren segmentaal herhaald en terminal Hematopoietische Pockets (HP's) zich tussen de opperhuid en de spieren lagen van het larvale lichaam muur 5,6. Op basis van hun natuur als zelf-vernieuwing macrofagen 6, hun overheersende verblijf in de lokale weefsel microenvironments 6, 7 en hun afstamming van de vroegste bloedcellen ontstaan tijdens de ontwikkeling 6,8, dit bloed celpopulatie wordt geacht vergelijkbaar vertebrate zelf-vernieuwing weefsel macrofagen, onafhankelijk myeloïde recent geïdentificeerd in verschillende soorten 4,9,10. In Drosophila, sommige of al deze resident cellen tonen ook plasticiteit tot andere soorten bloedcellen te voorzien kristalcellen 11,12.
Larvale hemocytes zijn overwegend inwoner (zittend), maar zijn in een dynamische steady-state tussen verschillende HP's. Ze worden geleidelijk vrijgegeven in het verkeer, in het bijzonder met de larve 3 e instar benadert verpopping 5-7. Immuun uitdagingen, letsel of mechanische storing leiden tot een voortijdige, in het laatste geval omkeerbaar, mobilisatie van de bewoner hemocytes in de hemolymfe 4,6,13.
Eerdere studies hebben die inwoner voorgesteld en circulerendelarvale hemocytes zijn van hetzelfde geslacht, maar verschillen in hun lijm of homing eigenschappen 6,7,13,14. Selectieve isolatie van circulerende versus inwoner hemocytes onthuld verhoogde niveaus van proliferatie in de bewoner hemocyte bevolking, suggereert hun blootstelling aan inductieve signalen van de HP's 6. Drosophila larvale HPs worden omzoomd door opperhuid en de spieren lagen en verder haven sensorische neuron clusters van het perifeer zenuwstelsel (PNS) en leverfunctie die lijkt oenocytes 6. Functioneel zijn mutante cellen en genetische ablatie experimenten toonden aan dat sensorische neuronen in de HPs ondersteunen trofische voortbestaan en lokalisatie van larvale hemocytes 6.
Hier beschrijven we een werkwijze voor het specifiek isoleren en kwantificeren van inwoner circulerende hemocytes uit één Drosophila larven, en een protocol voor mechanische hemocyte mobilisatie. De werkwijzen kunnen worden gebruikt voor het ex vivoonderzoek hemocytes en kan verder worden aangepast aan andere ontwikkelingsstadia Drosophila zoals de pop en volwassen en andere ongewervelde systemen. Aangezien eerdere studies geen onderscheid tussen ingezeten en circulerende hemocytes, dit protocol voorziet in een gemeenschappelijke norm voor de studie van ingezeten bloedcellen en zal helpen om de consistentie van ongewervelde bloedcellen onderzoek te verhogen.
Ten eerste, de hemocyte Bleed / Schraap Assay beschrijft het differentieel isolatie en geautomatiseerde kwantificering van fluorescerend eiwit gemarkeerd resident en circulerende hemocyte populatie van enkele Drosophila larven; Het protocol biedt twee opties voor regelmatige en tegel scannen uitgeruste microscopen (figuur 1). Dientengevolge, het percentage circulerende hemocytes en het totale aantal hemocytes per larven verkregen. De methode is gebaseerd op transgene Drosophila larven die fluorescerend eiwit tot expressie brengen onder hun bloedcelbevolking. De keuze van de hemocyte bestuurder of journalist bepaalt de uitkomst, dat wil zeggen, dat de bevolking van bloedcellen wordt gevisualiseerd en gekwantificeerd. Om vooral label macrofagen (plasmatocytes), waarvan de overgrote meerderheid van de bewoner en de circulerende hemocyte bevolking van de Drosophila larve 6 omvatten geschikte transgenen omvatten Hml Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXn -GAL4 16 CRQ-GAL4 (door H. Agaisse 16) of GAL4-eter 17; voor het labelen van de relatief kleine populatie van kristal cellen, geschikt lijnen zijn BcF6-GVB en GFP 18 of LZ-GAL4 (door J. Pollock 19), voor de etikettering lamellocytes, een gespecialiseerd celtype voornamelijk veroorzaakt door het immuunsysteem uitdagingen en verwondingen 13, bijvoorbeeld MSNF9mo-mCherry worden gebruikt 17. Sommige transgene drivers worden uitgedrukt in een bereik van gedifferentieerde bloedcellen en voorlopers, zoals hij - GAL4 20, die ongeveer 80% van alle larvale bloedcellen 20 labels. Houdt u er rekening mee dat in alle gevallen waarin GAL4- drivers gebruikt worden, samen met UAS-GFP of een ander fluorescerend eiwit UAS-transgeen is vereist. In de sectie Resultaten, wordt deze methode gebruikt om te controleren bloedcellen aantal en de circulatie gedrag in de loop van de larvale ontwikkeling.
Ten tweede, de bloedbestanddelen Verstoring Assay beschrijft een voorafgaande stap ontworpen resident hemocytes los door externe manipulatie, die vervolgens kan de evaluatie van het vermogen van hemocytes opnieuw hechten en thuisbasis HPs binnen een kort tijdsbestek (30 - 60 min) 6. Meestal deze test wordt gevolgd door de ontluchting / Schraap Assay het percentage circulerende hemocytes per larve bepalen. We presenteren een vereenvoudigde protocol voor deze test (figuur 1D), die verstoring gebruikt door vortexen with glasparels in plaats van manipulatie van één larve met een kwast zoals eerder 6 beschreven. In de sectie Resultaten, wordt deze test gebruikt om die kortstondig vrijstaande hemocytes vlotter in de hemolymfe demonstreren en kan worden teruggevonden in de fractie van circulerende hemocytes. De test is ook nuttig om verschillen in hemocytes hun homing / hechting aan locaties resident, vergeleken bijvoorbeeld verschillende genetische achtergronden of stimuleringscondities kwantificeren. Houdt u er rekening mee dat deze mechanische manipulatie weerspiegelt een omkeerbaar proces en verschilt van Infectie of letsel veroorzaakte inwoner hemocyte mobilisatie, die doorgaans niet omkeerbaar in een kort tijdsbestek 4,13.
Protocol
1. hemocyte Bleed / Schraap Assay
- Voorbereiding van dia's:
- Optie 1 voor microscopen zonder tile aftastfunctie: Voor elke larve te analyseren Bereid een glasplaatje met ongeveer 5 Pap-pen putjes van 2 mm vierkantjes, overeenkomend met het gebied gezichtsveld van de microscoop; voeg ongeveer 5 - 10 pl S2 media om elk (figuur 1A). Houd dia's in vochtige kamer om putten te voorkomen dat uitdroogt.
- Optie 2 voor microscopen met tegel scanfunctie: Voor elke larve te analyseren, bereidt een glasplaatje met 3-4 Pap-pen putten van ~ 3-4 mm vierkanten; Voeg ongeveer 15 - 20 pl S2 media aan elk putje (Figuur 1B). Houd dia's in vochtige kamer om putten te voorkomen dat uitdroogt.
LET OP: De hierboven aanbevolen aantal putten is voldoende voor totalen van 3.000 hemocytes per larve (larven late 2e instar, ~ 2,5-3 mm lengte, transgene labelen van de meerderheid van de larval bloedcellen). Bij de beoordeling van grotere bloedcel aantallen, misschien meer putten nodig zijn om overbevolking te voorkomen.
- Collectie van larven:
- Spuiten water in een vlieg flacon met larven en spoel larven in een petrischaal of schep wat voedsel dat de larven in een petrischaal bevat en verdunnen met water met behulp van een spuit fles.
- Zachtjes halen larven uit de petrischaal met behulp van een penseel en plaats ze in het water in een holte schaal of op een dia op een koude blok.
OPMERKING: Larven kan voor een beperkte tijd in water of op een koude blok worden gehouden; Gebruik monsters binnen 45 minuten of minder larven dood of ongewenste effecten op hemocytes voorkomen.
- Dissection:
- Selecteer larven onder een fluorescentiemicroscoop op een koude metalen blok. Meet indien gewenst maten en imago larven.
- Isolatie van circulerende hemocytes ("Bleed"):
- Zodra larven worden geselecteerd, plaats een larve in het eerste Pap-pen goed (figuur 1C,2A).
- Gebruik 2 schone naalden of ontleden schaar en een tang om een incisie te maken op zowel de achterste en voorste uiteinden van de larve. Om storende resident hemocytes voorkomen, is het het beste om deze insnijdingen aan de ventrale zijde van de larven. Om consistente resultaten maken de insnijdingen in dezelfde locaties voor elke larve. Larven 1 st instar, 1 insnijding (in het ventrale voorste) voldoende.
- Laat larve bloeden gedurende enkele seconden zonder druk of fysische beroering (Figuur 2A).
LET OP: Als het werken op meerdere larven is het beter om deze insnijdingen voor elk te maken voordat u verder gaat met de volgende stap om te voorkomen dat het houden van larven op het ijs te lang, die de integriteit van de monsters kunnen beïnvloeden. - Til de larve van de naalden of pincet en dompel het in de tweede put om alle resterende circulerende hemocytes spoelen. Daarna volgen met de release van ingezeten hemocytes.
- Voorzichtig overdracht van de larve naar het volgende goed (figuur 2C).
- Identificeer de lymfeklier van de larve, dat typisch op ongeveer 1/3 van het voorste uiteinde van de larve en die dorsaal kunnen fluoresceren door het larvale lichaamswand. Vermijd de lymfeklier, terwijl het vrijgeven inwoner hemocytes door beetgepakt de larve met een naald zo dicht mogelijk bij de lymfeklier te voorkomen prikken (figuur 2C).
OPMERKING: Bij normale ontwikkeling van de rijping van lymfeklier hemocytes vertraagd vergeleken larvale hemocytes en fluorescente reporters gesplitste hemocytes mag geen signaal in de lymfeklier jonge larven vertonen. In deze gevallen heeft minder aandacht voor de lymfeklier worden betaald als geen verontreiniging van gedifferentieerde fluorescent-gelabelde larvale hemocytes door lymfeklier hemocytes verwacht. - Vrijgeven inwoner bloedcellen in een dissectiop het proces van schrapen en / of prikken. Gebruik een borduurwerken om effectief vastpinnen de larve in de buurt van de lymfeklier (zie boven) of andere delen van het lichaam als dat nodig is. Gebruik een andere naald jab bij de clusters van hemocytes die zichtbaar zijn door het larvale lichaam muur (figuur 2C, E), gericht op de hemocytes scheiden. Hemocytes kan ook worden uitgebracht in een schrapen beweging. Echter, scheuren de opperhuid begin kan grote clusters van bloedcellen, die geautomatiseerde tellen uitdagender kon maken los.
OPMERKING: Afhankelijk van de leeftijd en het genotype van de larve, zal het totale aantal hemocytes variëren. Verdeel de release proces hierboven beschreven over verschillende putten overbevolking van een aantal putten met bloedcellen, die enkel beeld cell analyse moeilijker zou kunnen maken te vermijden. - Als er maar weinig hemocytes blijven in de finale karkas, tel deze hemocytes door waarneming door de microscoop en het gebruik van een handleiding tally counter (Figuur 2E). Het tellen, p vergemakkelijkingkant het karkas op een schone ruimte van dezelfde dia en verspreiden zo dun mogelijk het aantal optische vlakken te beperken.
- Zodra de dissectie is voltooid wachten tussen 5 - 10 minuten om de cellen te regelen (maar niet noodzakelijk houden) voor het afbeelden van de putjes. Incubeer de dia in een vochtige kamer om uitdroging te voorkomen en te vermijden ruwe behandeling van de dia's, die de vaste hemocytes kon verstoren.
OPMERKING: Bij het bepalen van hemocyte telt, vrijgegeven cellen zijn niet vast en de cellen moeten worden afgebeeld kort na dissectie, bij voorkeur binnen 30 minuten na vrijlating uit de larve. Afhankelijk van het volume medium en cellen te zullen de meeste cellen geregeld binnen 5 - 10 minuten, die moet worden bevestigd door zich door de optische vlakken van de drager in de put. Echter, slechts een fractie van bloedcellen om het schuifvlak hebben gehouden tegen die tijd, een feit dat moet worden overwogen als modificerende dit protocol voor mobiele fixatie-gebaseerde approaches.
- Neem beelden van de vaste hemocytes onder een fluorescentiemicroscoop (Figuur 2B, D, F). Volg met kwantificering van hemocytes met ImageJ software.
- Afbeelding voor te bereiden op ImageJ cel tellen algoritme:
- Open beeld van zowel het gebruik van ImageJ: Bestand → Open → (lokaliseren bestand en selecteer).
- Zorg ervoor dat de afbeelding (en) is 8-bit of 16-bit. Pas de drempel voor het beeld door het selecteren Afbeelding vervolgens op aan te passen en selecteer Threshold. Let op de "Threshold venster" (Figuur 3A).
- Controleer de optie "Donkere Achtergrond". Selecteer "Red" en verhoging van de Lower Threshold Level (zie zwarte pijl) tot elke cel in de afbeelding is gemarkeerd met een rode stip (cellen die niet worden gedekt zal worden gezien in grijstinten; Figuur 3B). Als de Tweede Thresholdwordt verhoogd aantal cellen zullen niet gemarkeerd worden. Dit kan de indicator voor hoe ver de Tweede Threshold ingesteld zijn.
OPMERKING: Af en toe clusters van cellen kan niet worden opgelost en zou worden geteld als één voor het deeltje teller. In dergelijke gevallen kan het aantal cellen in een cluster worden geschat door het onderzoeken van het beeld (inzoomen indien nodig) en handmatige telling met een telapparaat. Alternatief kan het onderste drempel verhoogd tot clusters van cellen te lossen; elke ongemarkeerde cellen als gevolg van deze manipulatie kan vervolgens worden geteld met behulp van een telapparaat.
- Analyseer aantal cellen met behulp van ImageJ:
- Start de Particle Analyzer om de cellen (Figuur 3C) tellen. Selecteer Analyseren en klik op Analyseren Particle. Eventueel selecteer "Overlay Contouren" om de deeltjes te zien de telling algoritme (Figuur 3D). Als alternatief, een grens aan de grootte of pixelgebied van een eenheid (bv., Cel, klompje cellen, enz.) Voor het algoritme te tellen.
- Klik op OK. Observeren een samenvatting venster met de telling (figuur 3E).
2. hemocyte Verstoring Assay
- Om hemocytes selecteert larven verstoren en leg ze in een 2 ml microcentrifugebuis met ongeveer 0,5 g glasparels (212-600 pm) en voeg 0,5 ml water.
- Vortex de buis, met de hand, op snelheid 10 gedurende 1 minuut.
- Haal de larven van de glasparels door morsen van de inhoud van de microcentrifugebuis een petrischaal en uitzoeken van de larven met een penseel.
- Voor de herstelfase, plaatsen larven in de eerder bereide petrischaaltjes met kleine hoeveelheden vlieg voedsel. Laat de larven te herstellen hun hemocyte patroon gedurende 45 min of gewenst.
NB: Gooi alle larven die zijn gestopt met bewegen, zoals ze zijn gestorven in het proces. Toch zien we meestal little schade na 1 min vortexen (zie hieronder en Aanvullende Figuur 1). - Na de herstelperiode, verder met de Bleed / Schraap Assay zoals hierboven beschreven in paragraaf 1.
Representative Results
Typische resultaten van de beschreven werkwijzen te illustreren gebruikten we eerst de bloedbestanddelen Bloeden / Schraap Assay om de progressie van larvale hemocyte getallen en hun verblijf in de loop van larvale ontwikkeling (figuur 4) schetsen. Resident en circulerende larvale hemocyte populatie werden geïsoleerd uit enkele larven (Hml Δ-GAL4, UAS-GFP, He-GAL4 te labelen de meeste larven hemocytes) en gekwantificeerd met behulp ImageJ. Cohorten larven afmeting 1,2 mm (~ 48 uur AEL of 1 st instar), 2,5 mm (~ 80 uur AEL of late 2e instar) en 3,5 mm (~ 96 uur AEL of 3e instar) werden onderzocht (Figuur 4) . Hemocyte nummers uitgebreid in de loop van de larvale ontwikkeling, correleren met en hoger dan eerdere schattingen op basis van lichtmicroscopie kleurstof gekleurd larven 7 en live tellen van fluorescerend eiwit gelabeld hemocytes door de larvale cuticula 6. In de 1 e instar larven bijna alle hemocytes waren gevestigd en dat de fractie van circulerend hemocytes geleidelijk steeg in de loop van larvale ontwikkeling (Figuur 4B, C), consistent met eerdere publicaties 6,7.
Vervolgens hebben we onderzocht of de methode trouw bewaakt de overgang van hemocytes tussen de bewoner en de verspreiding van de bevolking. Gebruik te maken van het verschijnsel dat resident hemocytes transient kan losmaken mechanische verstoring en zij opnieuw hechten aan hun locaties resident spontaan 6, we gedispergeerd resident hemocytes door vortexen met glasparels zoals beschreven in de hemocyte Disturbance Assay. Inderdaad, mechanische verstoring van larven tot een drastische stijging van de populatie circulerende hemocytes ten koste van de bewoner hemocytes (figuur 5). Na een herstelperiode van 45 minuten was hemocytes grotendeels teruggekeerd naar hun hechtende toestand, zowel door visuele inspectie en door de alssessed percentage circulerende cellen (figuur 5D, E). Zoals verwacht, de totale hemocyte aantallen stabiel gebleven in de tijd, ondanks de verschuiving van hemocytes tussen de circulerende en resident populaties.
Een aantal extra overwegingen rekening gehouden. Om te bevestigen dat vortexen niet leiden tot grote weefselbeschadiging te vortexen met glasparels werd uitgevoerd in aanwezigheid van trypan blauw (Sigma) gedurende verschillende tijdsperioden (1, 5, 20 min). Zowel 1 en 5 min wervelen veroorzaakte geen duidelijke weefselontwrichting, terwijl 20 min vortexen leidde tot kleine beschadigingen, die lijkt op beschadiging door naalden steken als positieve controle (Supplemental figuur 1). Terwijl inwendige beschadiging van de epidermis of andere weefsels zonder cuticula schade niet kan worden uitgesloten, lijkt dit scenario nogal onwaarschijnlijk hemocytes van 1 min en 5 min behandelde larven opnieuw gehecht in het verwachte patroon en tijd, wat suggereert larvale integriteit niet compromisd (Supplemental figuur 1). Daarentegen larven gevortext 20 min last van een gebrek aan re-adhesie, en zelfs niet tonen binding van circulerende hemocytes epidermale wond plaatsen, zoals eerder 14 beschreven.
Uiteindelijk om reproduceerbaarheid van de werkwijze te tonen, vergeleken we biologische replicaten van 2,5 mm larven van de bovengenoemde twee experimenten, die werden uitgevoerd door verschillende onderzoekers. Zoals geïllustreerd in figuur 2 Hulp beide cohorten gaf vergelijkbare totale aantal hemocytes per larve en het percentage circulerende hemocytes. Student's t test toonde geen significante verschillen, wat suggereert dat de methode reproduceerbaar en breed toepasbaar.
Figuur 1. hemocyte Bleed / Schraap en Verstoring Assay s etup en schema. (A) Single Image Slide Setup: vijf 2mm pleinen voor beeldvorming met een 5x doelstelling (B) Tile Scan Slide Setup:. Vier 3 mm pleinen voor de beeldvorming bleed / schaafwonden van ≤2.5 mm larven met een scan microscoop tegel. Aanbevolen doelstellingen voor de beeldvorming 5X of 10X. (C) Bleed / Schraap Assay schema en resulteert kwantificeringen behulp ImageJ. (D) In de Verstoring Assay, wordt de hemocyte patroon mechanisch verstoord door vortexen larven met glaskralen. Larven mogen herstellen gedurende 45 min gedurende welke hemocytes opnieuw hechten aan het hematopoietisch zakken. De lijm eigenschappen van hemocytes kan worden bepaald door deze methode, het kwantificeren van het percentage hemocytes in omloop na verstoring. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Bleed / Schraap Assay om circulerende en resident hemocytes los. (A) Aan een larve randen, ventrale incisies in de achterste en voorste einden van de larven worden gemaakt (schaar symbool). (B) Hemocytes in omloop zal stromen uit de insnijdingen en vestigen op het oppervlak van de schuif. (C) De lymfeklier (LG) is gelegen en vastgepind, zonder doorprikken het. Resident hemocytes worden vrijgegeven door prikken en / of schrapen van de larve met een naald. (D) Resident hemocytes op dia. (E, F) De Schraap proces wordt herhaald totdat alle resident hemocytes worden vrijgegeven. De larvale karkas met de intacte lymfeklier wordt achtergelaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Geautomatiseerde kwantificering van hemocytes behulp ImageJ. (A, B) Na het openen van een beeld hemocyte bestand in ImageJ de Tweede Drempel wordt bijgesteld wanneer alle cellen in het beeld. (C, D) analyseren deeltjes vereist het instellen van de cel pixelgrootte, circulariteit, en het resultaat uitlezing formaat (bijv Overlay overzichten). (E) Samenvatting venster met het aantal hemocytes. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Representatieve resultaten (1). Hemocyte aantal en resident staat over de loop van de larvale ontwikkeling. (A) Overzicht van de larvale stadia gebruikt; 1 ste larvestadium (48 uur AEL; ~ 1.2 mm lengte); 2e instar (80 uur AEL; 2,5 mm lengte); 3 e instar (96 uur AEL; ~ 3,5 mm lengte). Genotype is Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Hij-GAL4. Stages werden bevestigd door de beoordeling van larvale mouthhooks. (B) Bar diagram van circulerende en resident hemocyte nummers op de respectievelijke larvale stadia. (C) Percentage van circulerende hemocytes. Merk op dat de fractie van circulerende hemocytes verhoogt onevenredig in de loop van de larvale ontwikkeling. (D) Totaal hemocytes, als gevolg van de som van de circulerende en resident hemocytes per larve. Hemocytes werden gekwantificeerd met behulp van de Bleed / Schraap methode; n ≥ 6 larven / conditie, foutbalken tonen standaarddeviatie, bevindingen bevestigd in 3 onafhankelijke repliceren experimenten.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Representatieve resultaten (2). Effecten van mechanische verstoring van hemocyte residentie. (AC) Voorbeeld van een larve voor en na vortexen met glasparels, gevolgd door 45 min recovery (A) Geen storing control.; hemocytes worden gelokaliseerd in Hematopoëtische Zakken (B) Verstoorde hemocyte patroon op 0 min na vortexen larven in een suspensie van glazen kralen en water (C) hemocyte patroon op 45 minuten van het herstel na de verstoring..; veel hemocytes hebben verplaatst naar de Hematopoïetische Pockets; Let vergrote dorsale-schip verbonden clusters en dorsale strepen die overheersende plaatsen van vroege post-verstoring accumulatie (pijlen) zijn. Genotype is Hml Δ-GAL4, UAS-GFP; Hij-GAL4 x YW. (D) Percentage van circulerende hemocytes gekwantificeerd door de Bleed / Schraap methode. (E) Totaal hemocytes, als gevolg van de som van de circulerende en resident hemocytes per larve. n ≥ 4 larven / conditie, foutbalken tonen standaarddeviatie, bevindingen bevestigd in 3 onafhankelijke repliceren experimenten. T-toets om betekenis te bevestigen, NS (niet significant), ** (p ≤ 0,05), ** (p ≤ 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Hier beschrijven we de eerste methode kwantitatief recupereren inwoner circulerende bloedcellen uit één Drosophila larven en kwantificeren beide hemocyte populaties. Het protocol bestaat uit de opeenvolgende release van circulerende en resident bloedcellen, gevolgd door beeldvorming en geautomatiseerde cel tellen. Larvale bewoner hemocytes kan kortstondig worden gemobiliseerd in omloop door mechanische storing, een proces dat bekend is dat een groot deel worden teruggedraaid binnen een 30-60 min herstelperiode 6. Dienovereenkomstig werd dit protocol getest op twee manieren, (1) door beoordeling van de totale hemocyte aantal per larve fractie van circulerend hemocytes de loop van larvale ontwikkeling en (2) van experimenteel losmaken resident hemocytes toepassing van een geautomatiseerde werkwijze, die bevestigd strakke correlatie van hemocyte lokalisatie en hemocyte nummer in de bewoner en de verspreiding van de bevolking. Bovendien is de reproduceerbaarheid van de methode werd aangetoond door comparing twee datasets van biologische herhalingen.
In het verleden zijn diverse laboratoria technieken voor larvale hemocytes 6,13,21 kwantificeren. Dit protocol voorziet in een gemeenschappelijke norm op te halen en te kwantificeren resident en circulerende bloedcellen populatie van Drosophila larven, die een makkelijk aanpasbaar platform. De beschreven methode is essentieel voor studies naar de rol van de bewoner hemocytes en hun micro-omgeving, de hematopoietisch Zakken 4-6, en is geschikt voor fluorescent eiwit-dragende transgene Drosophila stammen in wild type en genetisch gemodificeerde achtergronden bestuderen. Het protocol is ook relevant voor studies die zich richten op hemocyte mobilisatie na immuun uitdaging of letsel, en genetisch of ecologisch geïnduceerde signalering dat de mobilisatie van de bewoner hemocytes of veranderingen in totaal hemocyte aantal (beoordeeld in 4) activeert. Opgemerkt wordt dat in het geval van voortijdige differentiation en afgifte van hemocytes uit de lymfeklier, onderscheiden embryonale / larvale versus lymfeklier lijnen kan worden beperkt door het expressiepatroon van de fluorescente reporter hemocyte gebruikt.
De hier gepresenteerde protocol is gebaseerd op imaging levend, fluorescent-gelabelde hemocytes. In de toekomst kan het worden gewijzigd om de detectie van vrijgekomen cellen mogelijk na fixeren, bijvoorbeeld met behulp van immunocytochemie. In dit geval moet het protocol worden aangepast om volledige hechting van de bloedcellen, bijvoorbeeld door verhoging adhesie incubatietijden en toevoeging klevende glijbekleden zoals concanavaline A. Daar de werkwijze maakt ophalen van hemocytes en hun manipulatie ex vivo, het zal profiteren van een breed scala van ontwikkelings-, celbiologische en biochemische studies. Resident en circulerende bloedcellen worden gevonden tijdens alle postembryonic ontwikkelingsstadia van Drosophila en andere ongewervelden 22, suggesting dat de aanpassing van deze methode zullen profiteren van een breed scala van studies buiten de Drosophila larvale hematopoietische systeem.
Acknowledgments
Wij danken Jesper Kronhamn en Dan Hultmark, Michael Galko en de Bloomington Stock Center for the fly voorraden. Speciale dank aan Courtney Onodera advies met statistische analyse. Wij danken Katrina Goud voor kritische lezing van het manuscript, en Kalpana Makhijani, Katrina Gold, de leden van de Derynck laboratorium, en leden van de Nystul laboratorium voor discussie en commentaar op het manuscript. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de UCSF Programma voor Doorbraak Biomedical Research (PBBR), Brede Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122.595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health en 1R01GM112083-01 1R56HL118726-01A1 (naar KB).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 cm/9 cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
| Water squirt bottle | |||
| Metal spoon/spatula | |||
| Thin paintbrush | e.g., a "liner" | ||
| Glass cavity dish | |||
| PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
| Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g., 2 mm squares. | ||
| Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
| Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
| Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
| 2 x 1 ml syringes with needles (27 G ½") | Becton Dickinson | For dissections. | |
| Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2 mm) | Fine Science Tools | ||
| Glass beads, 212 - 600 μm | Sigma | ||
| 2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
| Vortex mixer | Fisher Scientific | ||
| Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. | Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | ||
| Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
| Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (e.g., Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |
References
- Lemaitre, B., Hoffmann, J. The host defense of Drosophila melanogaster. Annu Rev Immunol. 25, 697-743 (2007).
- Evans, C. J., Hartenstein, V., Banerjee, U. Thicker than blood: conserved mechanisms in Drosophila and vertebrate hematopoiesis. Dev Cell. 5, 673-690 (2003).
- Wood, W., Jacinto, A. Drosophila melanogaster embryonic haemocytes: masters of multitasking. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 542-551 (2007).
- Gold, K. S., Brückner, K. Drosophila as a model for the two myeloid blood cell systems in vertebrates. Experimental hematology. 42, 717-727 (2014).
- Makhijani, K., Brückner, K. Of blood cells and the nervous system: Hematopoiesis in the Drosophila larva. Fly. 6, 254-260 (2012).
- Makhijani, K., Alexander, B., Tanaka, T., Rulifson, E., Brückner, K. The peripheral nervous system supports blood cell homing and survival in the Drosophila larva. Development. 138, 5379-5391 (2011).
- Lanot, R., Zachary, D., Holder, F., Meister, M.
- Holz, A., Bossinger, B., Strasser, T., Janning, W., Klapper, R. The two origins of hemocytes in Drosophila. Development. 130, 4955-4962 (2003).
- Sieweke, M. H., Allen, J. E. Beyond stem cells: self-renewal of differentiated macrophages. Science. 342, 1242974 (2013).
- Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R.
- Bretscher, A. J., et al. The Nimrod transmembrane receptor Eater is required for hemocyte attachment to the sessile compartment in Drosophila melanogaster. Biology Open. 1-9, (2015).
- Leitao, A. B., Sucena, E. Drosophila sessile hemocyte clusters are true hematopoietic tissues that regulate larval blood cell differentiation. eLife. , (2015).
- Markus, R., et al. Sessile hemocytes as a hematopoietic compartment in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 4805-4809 (2009).
- Babcock, D. T., et al. Circulating blood cells function as a surveillance system for damaged tissue in Drosophila larvae. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 10017-10022 (2008).
- Sinenko, S. A., Mathey-Prevot, B. Increased expression of Drosophila tetraspanin, Tsp68C, suppresses the abnormal proliferation of ytr-deficient and Ras/Raf-activated hemocytes. Oncogene. 23, 9120-9128 (2004).
- Stramer, B., et al. Live imaging of wound inflammation in Drosophila embryos reveals key roles for small GTPases during in vivo cell migration. J Cell Biol. 168, 567-573 (2005).
- Tokusumi, T., Shoue, D. A., Tokusumi, Y., Stoller, J. R., Schulz, R. A. New hemocyte-specific enhancer-reporter transgenes for the analysis of hematopoiesis in Drosophila Genesis. 47, 771-774 (2009).
- Gajewski, K. M., et al. Identification of a crystal cell-specific enhancer of the black cells prophenoloxidase gene in Drosophila. Genesis. 45, 200-207 (2007).
- Lebestky, T., Chang, T., Hartenstein, V., Banerjee, U. Specification of Drosophila hematopoietic lineage by conserved transcription factors. Science. 288, 146-149 (2000).
- Zettervall, C. J., et al. A directed screen for genes involved in Drosophila blood cell activation. Proc Natl Acad Sci USA. 101, 14192-14197 (2004).
- Shim, J., Mukherjee, T., Banerjee, U. Direct sensing of systemic and nutritional signals by haematopoietic progenitors in Drosophila. Nature cell biology. 14, 394-400 (2012).
- Hartenstein, V. Blood cells and blood cell development in the animal kingdom. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 677-712 (2006).
