Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
척추 동물에서 조혈는 유도 미세 환경 (틈새)에 의해 조절된다. 마찬가지로, 무척추 동물 모델 생물 초파리에서 애벌레 조혈 포켓 (HP의)로 알려진 유도 미세 환경은 자기 갱신 식세포 혈통 특히 개발 및 혈액 세포 (혈구)의 규제 해부학 사이트로 확인되었다. HP의이 6063과 같은 말초 신경계의 감각 뉴런을 포함 유충의 표피와 근육층 사이 주머니를 반복했다. 유충에서, 상주 (고착) 혈구 세포는 항 세포 사멸, 접착제이 감각 신경 세포에서 증식 단서 및 라이닝 근육과 상피 층과 HP의 잠재적으로 다른 구성 요소에 노출되어있다. HP의 연료에서 정상적인 개발, 주민 혈구 세포의 점진적 해제하는 동안 개월의 릴리스에서 절정 순환 혈구 세포의 인구,변태의 시작 부분에 상주 혈구의 일. 면역 공격, 부상 또는 기계적 장애는 혈액 순환에 상주 혈구 세포의 조기 석방을 트리거합니다. 거주 장소와 순환 사이 유생 혈구 세포의 스위치를 선택적으로 분리하고 단일 초파리 유충으로부터 혈액 세포의 이러한 두 집단을 정량화하는 표준 공통 / 절차에 대한 필요성을 제기한다. 따라서,이 프로토콜은 해제하고 하나의 유충에서 주민과 순환 혈구 세포를 정량화 할 수있는 자동화 된 방법을 설명합니다. 상기 방법은 생체 외 접근법을 용이하게하고, 초파리 발달 단계 및 다른 무척추 동물 유기체의 다양한 서비스를 제공하도록 적응 될 수있다.
무척추 동물 모델 초파리 melanogaster의 연구는 선천성 면역 (1)의 검색을 구동하고 있으며, 2-4. 초파리 조혈은에 유래 배아 / 유생 혈구 세포의 혈통로 분할 될 수 혈액 세포 발달의 여러 측면의 이해를 용이하게했다 배아 및 유충에 확장 한 임파선의 혈통은 4,5 혈구. 여기, 우리는 초파리 유충에 주로 plasmatocytes (대 식세포) 거의 결정 세포 (4)을 포함 애벌레 / 배아 혈구 세포의 혈통에 초점을 맞춘 프로토콜을 제시한다. 표피와 애벌레 몸 벽 5,6의 근육 층 사이에있는 유충에서 배아의 혈구가 지속 및 식민지 6063 반복 터미널 조혈 포켓 (HP의). 자기 갱신 대 식세포 (6), 지방 조직의 미세 환경 (6)에서의 주된 거주지로 그 성격을 바탕으로개발 중에 6,8- 나오는 초기 혈액 세포에서 7 일 및 그 혈통,이 혈액 세포 집단은 척추 자기 갱신 조직 대 식세포, 최근 종 4,9,10 다양한 식별 독립적 골수성 리니지 유사한 것으로 간주된다. 하지만, 초파리에서, 이러한 일부 또는 모든 셀 거주자 또한 소성은 액정 셀 (11, 12)과 같은 다른 혈액 세포 유형을 야기 할 나타낸다.
유생 혈구 세포는 주로 상주 (고착)이지만, 다양한 HP의 사이의 동적 안정 상태에있다. 3 차 령 유충이 pupariation 5-7에 접근 그들은 점진적으로 특히, 순환으로 방출된다. 체액 4,6,13에 면역 가역 후자의 경우에 도전, 조기 부상 또는 기계적 교란 납, 주민 혈구 세포의 동원.
이전의 연구는 주민 제안 및 순환 한애벌레 혈구 세포는 같은 혈통이지만, 자신의 접착제 또는 유도 속성 6,7,13,14 다르다. 상주 혈구 대 순환의 선택적 분리는 말초 신경계의 감각 신경 세포 클러스터를 표피와 근육 층으로 지어 더욱 항구 된 HP의 6. 초파리 애벌레 HP의에서 유도 단서에 노출을 제안, 주민 혈구 인구에 확산의 높은 수준을 보여 (PNS) 및 간 기능은 oenocytes 6 닮은. 기능적으로, 돌연변이와 유전자 세포 제거 실험은 HP의에 존재하는 감각 뉴런이 애벌레 혈구 6의 영양 생존과 현지화를 지원하는 것을 증명하고있다.
여기에서 우리는 특정 고립과 주민의 정량화 및 단일 초파리 유충에서 순환 혈구 세포 및 기계 혈구 동원을위한 프로토콜하는 방법을 설명합니다. 방법은 생체 외에서 사용될 수있다그리고 혈구 세포의 연구는 또한 이러한 번데기 성인 및 다른 시스템과 같은 다른 무척추 초파리 발달 단계에 적용 할 수있다. 이전의 연구는 거주자 순환 혈구 세포를 구별하지 않았기 때문에,이 프로토콜은 상주 혈액 세포의 연구를위한 공통 표준을 제공하고 무척추 혈액 세포 연구의 일관성을 증가시키는 것을 도울 것이다.
우선, 혈구 블리드 / 긁 세이 차동 분리 및 형광 단백질 표시된 거주자 단일 초파리 유충 혈구 집단 순환 자동 정량 설명; 프로토콜은 일반 타일 스캔 갖춘 현미경을위한 두 가지 옵션 (그림 1)를 제공합니다. 결과적으로, 순환 혈구 세포의 백분율 및 애벌레 당 혈구 세포의 총 수를 얻을 수있다. 방법은 혈액 세포 중에서 형광 단백질을 발현 형질 전환 초파리 유충에 의존인구. 혈구 드라이버 또는 리포터의 선택은 혈액 세포의 집단을 가시화하고 정량하는, 즉 결과를 판정한다. 주로 레이블을 지정하려면 대 식세포 주민과 초파리 유충 (6)의 순환 혈구 인구의 대다수를 포함한다 (plasmatocytes)는, 적합한 유전자는 (기준 HML Δ-을 DsRed 6 HmlΔ -GAL4 15 Pxn -GAL4 16 Crq-GAL4 포함 H. Agaisse 16), 또는 먹는-GAL4 (17); 액정 셀의 비교적 작은 모집단을 표지 용, 적합한 라인 BcF6-CFP 및 -GFP (18), 또는 (J. 폴록 19) LZ-GAL4이고; 라벨링 lamellocytes 위해 특화된 세포 유형은 주로 면역 도전 부상 (13)에 의해 유도는, 예를 들면, MSNF9mo mCherry-17을 사용할 수있다. 일부 형질 드라이버는 차별화 된 혈액의 범위로 표현되는유생 모든 혈액 세포 (20)의 약 80 % 레이블 GAL4 20, – 예컨대 그와 같은 세포 및 전구 세포. GAL4 드라이버가 사용되는 경우 UAS-GFP 또는 다른 형광 단백질 UAS – 유전자와 결합이 필요하며, 모든 경우에주의하시기 바랍니다. 결과 섹션에서,이 방법은 유충 발달의 과정을 통해 혈액 세포 수 및 순환 동작을 모니터링하기 위해 사용된다.
(- 60 분 30) (6) 둘째, 혈구 방해 분석 이후에 다시 부착하고 집에 HP의에 제한된 시간 내에 혈구의 능력에 대한 평가를 할 수 있습니다 외부 조작에 의해 주민 혈구 세포를 분리하도록 설계 이전 단계에 대해 설명합니다. 일반적으로 상기 분석은 당 유충 혈구 세포 순환의 비율을 결정하기 위해 블리드 / 긁 분석으로 이어진다. 우리는 소용돌이로 교반 재치에 의해 방해를 사용하여이 분석 (그림 1D)에 대한 단순화 된 프로토콜을 제시H 유리 비드보다는 페인트 브러시 단일 유충의 조작 이전에 설명 된 바와 같이 6. 결과 섹션에서,이 분석은 체액에 그 일시적으로 분리 된 혈구 세포 부유물을 입증하기 위해 사용되며, 순환 혈구 세포의 분획에서 회수 할 수있다. 분석은 예를 들어, 다양한 유전 적 배경이 나 자극 조건을 비교 상주 사이트에 자신의 유도 / 접착 혈구의 차이를 정량화하는 것이 유용하다. 이 기계 조작 가역 과정을 반영하고 일반적으로 짧은 시간 4,13에 되돌릴 수없는 infection-이나 부상에 의한 주민 혈구 동원, 구별됩니다.
여기서는 정량적 단일 초파리 유충으로부터 거주자 순환 혈액 세포를 회수하고, 이들 두 혈구 개체군을 정량화하는 첫 번째 방법을 설명한다. 프로토콜은 촬상 및 자동 셀 카운팅 하였다 순환 주민 혈구 연속 방출을 포함한다. 60 분간의 회복 기간을 6 – 유충 상주 혈구 세포는 일시적으로, 기계적 교란에 의해 순환에 주로 30에서 반전 될 것으로 알려진 프로세스를 동원 할 수있다. 따라서,이 프로토콜은 두 가지 방법으로 시험 하였다 (1) 유충 및 유충 발달의 과정 혈구 세포 순환 분획 당 총 혈구 수를 평가함으로써, (2) 실험적으로 자동화 된 방법을 사용하여 상주 혈구 세포를 빠지 의해 확정 된 혈구의 현지화 및 주민의 혈구 수와 순환 인구의 긴밀한 상관 관계. 또한, 본 방법의 재현성이 입증되었다 CO생물 복제의 두 데이터 세트를 mparing.
과거에는, 실험실 유생 6,13,21 혈구 세포를 정량화하는 방법의 범위를 사용 하였다. 이 프로토콜은 검색하고 쉽게 적응할 플랫폼을 제공 초파리 유충으로부터 거주자 순환 혈액 세포 집단을 정량화하는 공통 표준을 정한다. 설명하는 방법은 상주 혈구과 미세 환경의 역할에 초점을 연구에 중요하다, 조혈 4-6 포켓, 형광 단백질 야생 타입 유전자 운반 초파리 균주 및 유전자 변형 배경을 연구하기에 적합합니다. 이 프로토콜은 또한 거주자 혈구 세포 또는 (4 검토) 총 혈구 수의 변화 동원을 유발 면역 도전이나 부상, 유전 또는 환경 적으로 유도 신호 후 혈구 동원에 초점을 연구 관련이있다. 이는 조기 디 경우에 주목해야한다임파선 계통 대 배아 / 애벌레를 구별 fferentiation과 임파선에서 혈구 세포의 방출은, 사용 된 형광 혈구 기자의 발현 패턴에 의해 제한 될 수 있습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 영상 라이브, 형광 표지 된 혈구 세포에 의존한다. 향후, 이는 면역 세포 화학을 이용하여, 예를 들어, 고정 해제 후 세포의 검출을 허용하도록 변형 될 수있다. 방법은 혈구 세포의 검색과 그 조작 EX 할 수 있으므로이 경우, 프로토콜은 접착 배양 시간을 증가 및 콘 카나 발린 A의 같은 접착제 슬라이드 코팅을 추가하여, 예를 들어 혈구의 완전한 접착 성을 보장하도록 구성 될 필요가있다 생체, 그것이 발달, 세포 생물학, 생화학 적 연구의 다양한 혜택. 주민과 순환 혈액 세포는 모든 초파리의 postembryonic 발달 단계 및 기타 무척추 동물 (22), suggesti 동안 발견NG이 방법의 적응은 초파리 애벌레 조혈 시스템 연구 이후 다양한 혜택.
The authors have nothing to disclose.
우리는 플라이 주식에 대한 제스퍼 Kronhamn 댄 Hultmark, 마이클 Galko 및 블루밍턴 증권 센터 감사합니다. 통계 분석과 조언을 코트니 오노 데라 특별 감사. 우리는 원고의 중요한 읽기 카트리나 골드, 그리고 칼 파나 마히 자니, 카트리나 골드, Derynck 실험실의 구성원, 그리고 원고에 대한 토론과 의견 Nystul 실험실의 구성원을 감사드립니다. 이 작품은 혁신적인 생물 의학 연구 (PBBR), 넓은 센터, 헬만 재단, 미국 암 학회 (American Cancer Society) RSG DDC-122595, 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13BGIA13730001, 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 1326268, 건강 1R01GM112083-01의 국립 연구소와의 UCSF 프로그램에서 보조금에 의해 지원되었다 (KB에) 1R56HL118726-01A1.
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |