Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
रीढ़ में, hematopoiesis प्रेरक microenvironments (आलों) द्वारा नियंत्रित किया जाता है। इसी तरह, अकशेरुकी मॉडल जीव ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में, लार्वा Hematopoietic जेबें (एचपीएस) के रूप में जाना प्रेरक microenvironments स्वयं renewing बृहतभक्षककोशिका वंश का विशेष रूप से विकास और रक्त कोशिकाओं (hemocytes) के विनियमन के लिए संरचनात्मक साइटों, के रूप में पहचान की गई है। HPs हैं segmentally भी परिधीय तंत्रिका तंत्र के संवेदी न्यूरॉन्स शामिल है जो लार्वा की एपिडर्मिस और मांसपेशियों की परतों के बीच जेब दोहराया। लार्वा में, निवासी (डंठल) hemocytes विरोधी apoptotic, चिपकने वाला और इन संवेदी न्यूरॉन्स से proliferative संकेतों और इस तरह के अस्तर मांसपेशियों और उपकला परतों के रूप में HPS के संभावित अन्य घटकों के संपर्क में हैं। HPs ईंधन से सामान्य विकास, निवासी hemocytes की क्रमिक रिहाई के दौरान मो की रिहाई में खत्म जो घूम hemocytes की जनसंख्याकायापलट की शुरुआत में निवासी hemocytes की ST। इम्यून हमले, शारीरिक चोट या यांत्रिक गड़बड़ी के संचलन में निवासी hemocytes की समय से पहले रिहाई को ट्रिगर। निवासी स्थानों और संचलन के बीच लार्वा hemocytes के स्विच चुनिंदा अलग करने और एकल ड्रोसोफिला लार्वा से रक्त कोशिकाओं के इन दो आबादी यों की एक आम मानक / प्रक्रिया के लिए की जरूरत को उठाती है। तदनुसार, इस प्रोटोकॉल जारी है और एकल लार्वा से निवासी और घूम hemocytes यों के लिए एक स्वचालित विधि का वर्णन है। विधि पूर्व vivo दृष्टिकोण की सुविधा है, और ड्रोसोफिला के विकास के चरणों और अन्य अकशेरुकी जीवों की एक किस्म की सेवा करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
अकशेरुकी मॉडल ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में अनुसंधान सहज उन्मुक्ति 1 की खोज के लिए प्रेरित किया है, और 2-4। ड्रोसोफिला hematopoiesis में आरंभ जो भ्रूण / लार्वा hemocytes के वंश में विभाजित किया जा सकता है, रक्त कोशिका विकास के विभिन्न पहलुओं की समझ में मदद की है भ्रूण और लार्वा में विस्तार, और लसीका ग्रंथि के वंश 4,5 hemocytes। यहाँ, हम ड्रोसोफिला लार्वा में मुख्य रूप से plasmatocytes (मैक्रोफेज) और कुछ क्रिस्टल कोशिकाओं 4 शामिल हैं जो लार्वा / भ्रूण hemocytes के वंश, पर केंद्रित है कि एक प्रोटोकॉल उपस्थित थे। एपिडर्मिस और लार्वा शरीर दीवार 5,6 की मांसपेशियों की परतों के बीच स्थित लार्वा में, भ्रूण के hemocytes जारी रहती है और उपनिवेश segmentally दोहराया और टर्मिनल Hematopoietic जेबें (एचपीएस)। स्वयं renewing मैक्रोफेज 6, स्थानीय ऊतक microenvironments 6 में उनकी प्रमुख निवास के रूप में उनकी प्रकृति के आधार पर, विकास 6.8 दौरान उभरते जल्द से जल्द रक्त कोशिकाओं से 7, और उनके वंश, यह रक्त कोशिका आबादी कशेरुकी स्वयं renewing ऊतक मैक्रोफेज, हाल ही में प्रजातियों 4,9,10 की एक किस्म में पहचान एक स्वतंत्र माइलॉयड वंश के समान माना जाता है। हालांकि, ड्रोसोफिला में, कुछ या इन निवासी कोशिकाओं के सभी भी प्लास्टिसिटी ऐसे क्रिस्टल कोशिकाओं 11,12 के रूप में अन्य रक्त प्रकार की कोशिकाओं को जन्म देने के लिए दिखा।
लार्वा hemocytes मुख्य रूप से निवासी (डंठल) कर रहे हैं, लेकिन विभिन्न HPs के बीच एक गतिशील स्थिर राज्य में हैं। 3 instar लार्वा pupariation 5-7 दृष्टिकोण के रूप में वे उत्तरोत्तर विशेष रूप से, संचलन में जारी किए हैं। Hemolymph 4,6,13 में इम्यून प्रतिवर्ती उत्तरार्द्ध मामले में चुनौतियों, समय से पहले करने के लिए चोट या यांत्रिक गड़बड़ी के नेतृत्व, निवासी hemocytes की लामबंदी।
पिछले अध्ययनों कि निवासी सुझाव दिया है और घूम चुके हैंलार्वा hemocytes इसी वंश के हैं, लेकिन उनके चिपकने वाला या घर वापस आना गुण 6,7,13,14 में मतभेद है। निवासी hemocytes बनाम घूम के चुनिंदा अलगाव परिधीय तंत्रिका तंत्र के संवेदी न्यूरॉन समूहों एपिडर्मिस और मांसपेशियों की परतों से लाइन में खड़ा है और आगे बंदरगाह रहे हैं HPs 6। ड्रोसोफिला लार्वा HPs से प्रेरक संकेतों के लिए अपने जोखिम, सुझाव निवासी hemocyte आबादी में प्रसार का ऊंचा स्तर का पता चला (पीएन) और जिगर समारोह oenocytes 6 जैसी। कार्यात्मक, उत्परिवर्ती और आनुवंशिक सेल पृथक प्रयोगों HPs में मौजूद संवेदी न्यूरॉन्स लार्वा hemocytes 6 की पौष्टिकता अस्तित्व और स्थानीयकरण का समर्थन करने वाले प्रदर्शन किया है।
यहाँ हम विशिष्ट अलगाव और निवासी की मात्रा का ठहराव और एकल ड्रोसोफिला लार्वा से घूम hemocytes, और यांत्रिक hemocyte जुटाने के लिए एक प्रोटोकॉल के लिए एक विधि का वर्णन है। तरीकों पूर्व vivo के लिए इस्तेमाल किया जा सकताhemocytes के अध्ययन और आगे इस तरह के प्यूपा और वयस्क, और अन्य अकशेरुकी सिस्टम के रूप में अन्य ड्रोसोफिला विकास के चरणों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों निवासी और घूम hemocytes के बीच भेद नहीं था, इस प्रोटोकॉल निवासी रक्त कोशिकाओं के अध्ययन के लिए एक आम मानक प्रदान करता है और अकशेरुकी रक्त कोशिका अनुसंधान की स्थिरता बढ़ाने में मदद मिलेगी।
सबसे पहले, hemocyte भरो / परिमार्जन परख अंतर अलगाव और फ्लोरोसेंट प्रोटीन चिह्नित निवासी और एकल ड्रोसोफिला लार्वा से hemocyte आबादी घूम के स्वचालित मात्रा का ठहराव का वर्णन करता है; प्रोटोकॉल नियमित रूप से और टाइल स्कैन सुसज्जित सूक्ष्मदर्शी के लिए दो विकल्प (चित्रा 1) प्रदान करता है। नतीजतन, घूम hemocytes का प्रतिशत और लार्वा प्रति hemocytes की कुल संख्या प्राप्त कर रहे हैं। विधि उनके रक्त कोशिका के बीच फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कि ट्रांसजेनिक ड्रोसोफिला लार्वा पर निर्भर करता हैआबादी। hemocyte ड्राइवर या रिपोर्टर के चुनाव रक्त कोशिकाओं की आबादी कल्पना और मात्रा निर्धारित है जो, यानी, परिणाम को निर्धारित करता है। मुख्य रूप से लेबल करने के लिए मैक्रोफेज निवासी और ड्रोसोफिला लार्वा 6 की घूम hemocyte आबादी के विशाल बहुमत शामिल है, जो (plasmatocytes), उपयुक्त ट्रांसजीन (द्वारा HML Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, PXN -GAL4 16, Crq-Gal4 शामिल एच Agaisse 16), या भक्षक-Gal4 17; क्रिस्टल कोशिकाओं की अपेक्षाकृत छोटी आबादी लेबलिंग के लिए, उपयुक्त लाइनों BcF6-सीएफपी और -GFP 18, या (जे पोलक 19 से) LZ-GAL4 हैं, लेबलिंग lamellocytes के लिए एक विशेष सेल प्रकार मुख्य रूप से प्रतिरक्षा चुनौतियों और चोट 13 से प्रेरित, जैसे, MSNF9mo-mCherry 17 में इस्तेमाल किया जा सकता है। कुछ ट्रांसजेनिक ड्राइवरों विभेदित रक्त की एक श्रेणी में व्यक्त कर रहे हैंसभी लार्वा रक्त कोशिकाओं को 20 के बारे में 80% लेबल जो GAL4 20, – जैसे वह के रूप में कोशिकाओं और पूर्वज,। GAL4 ड्राइवरों का इस्तेमाल किया जाता है, जहां यूएएस GFP या अन्य फ्लोरोसेंट प्रोटीन यूएएस ट्रांस्जीन के साथ संयोजन की आवश्यकता है, सभी मामलों में है कि कृपया ध्यान दें। परिणाम अनुभाग में, इस विधि लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर रक्त कोशिका संख्या और परिसंचरण व्यवहार पर नजर रखने के लिए प्रयोग किया जाता है।
(- 60 मिनट 30) 6 दूसरा, hemocyte अशांति परख बाद में फिर से पालन करने के लिए और घर HPS करने की एक सीमित समय सीमा के भीतर hemocytes की क्षमता के मूल्यांकन की अनुमति देता है जो बाहरी हेरफेर, द्वारा निवासी hemocytes अलग करने के लिए बनाया गया एक पिछले चरण का वर्णन है। आम तौर पर यह परख लार्वा प्रति hemocytes घूम का प्रतिशत निर्धारित करने के लिए भरो / परिमार्जन परख के बाद है। हम vortexing बुद्धि से अशांति का उपयोग करता है, जो इस परख (चित्रा -1), के लिए एक सरल प्रोटोकॉल प्रस्तुतज कांच के मोती, बजाय एक पेंट ब्रश के साथ एकल लार्वा के हेरफेर के पहले 6 वर्णित है। परिणाम अनुभाग में, इस परख hemolymph में है कि क्षणिक अलग hemocytes नाव प्रदर्शित करने के लिए प्रयोग किया जाता है और hemocytes घूम के अंश में बरामद किया जा सकता है। परख जैसे, विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि या उत्तेजना की स्थिति की तुलना निवासी साइटों के लिए अपनी घर वापस आना / आसंजन में hemocytes के मतभेद, जिसका अंदाजा लगाना भी उपयोगी है। इस यांत्रिक हेरफेर एक प्रतिवर्ती प्रक्रिया को दर्शाता है और आम तौर पर एक छोटी समय सीमा 4,13 में प्रतिवर्ती नहीं कर रहे हैं, जो infection- या चोट प्रेरित निवासी hemocyte जुटाना, से अलग है कि कृपया ध्यान दें।
यहाँ, हम मात्रात्मक एकल ड्रोसोफिला लार्वा से निवासी और घूम रक्त कोशिकाओं को ठीक है, और इन दो hemocyte आबादी यों की पहली विधि का वर्णन है। प्रोटोकॉल इमेजिंग और स्वचालित सेल गिनती के द्वारा पीछा घूम और निवासी रक्त कोशिकाओं के अनुक्रमिक रिहाई, शामिल हैं। 60 मिनट वसूली की अवधि 6 – लारवल निवासी hemocytes क्षणिक, यांत्रिक गड़बड़ी से संचलन में मोटे तौर पर एक 30 के भीतर उलट हो जाता है एक प्रक्रिया है कि जुटाए जा सकता है। तदनुसार, इस प्रोटोकॉल को दो तरह से परीक्षण किया गया था, (1) लार्वा और लार्वा विकास के पाठ्यक्रम पर hemocytes घूम के अंश प्रति कुल hemocyte नंबर का आकलन करने से, और (2) प्रयोगात्मक एक स्वचालित पद्धति का उपयोग करके निवासी hemocytes dislodging से, जो की पुष्टि hemocyte स्थानीयकरण और निवासी में hemocyte संख्या और घूम आबादी के तंग सहसंबंध। इसके अलावा, विधि के reproducibility सह द्वारा प्रदर्शन किया गयाजैविक प्रतिकृति के दो डेटासेट mparing।
अतीत में, प्रयोगशालाओं लार्वा hemocytes 6,13,21 यों की तकनीक की एक सीमा का इस्तेमाल किया है। इस प्रोटोकॉल पुनः प्राप्त करने और एक आसानी से निभा मंच प्रदान करने, ड्रोसोफिला लार्वा से निवासी और घूम रक्त कोशिका आबादी यों की एक आम मानक स्थापित करता है। वर्णित विधि निवासी hemocytes और उनके microenvironment की भूमिका पर ध्यान केंद्रित है कि अध्ययन के लिए महत्वपूर्ण है, hematopoietic 4-6 जेब, और फ्लोरोसेंट प्रोटीन जंगली प्रकार में transgene-ले जाने के ड्रोसोफिला तनाव और आनुवंशिक रूप से संशोधित पृष्ठभूमि का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है। प्रोटोकॉल भी निवासी hemocytes या (4 में समीक्षा) कुल hemocyte संख्या में परिवर्तन की लामबंदी से चलाता है कि प्रतिरक्षा चुनौती या चोट, और आनुवंशिक रूप से या पर्यावरण की दृष्टि से प्रेरित संकेतन के बाद hemocyte लामबंदी पर ध्यान केंद्रित है कि अध्ययन के लिए प्रासंगिक है। यह समय से पहले di के मामलों में ध्यान दिया जाना चाहिएलसीका ग्रंथि प्रजातियों बनाम भ्रूण / लार्वा भेद fferentiation और लसीका ग्रंथि से hemocytes की रिहाई के लिए प्रयोग किया जाता फ्लोरोसेंट hemocyte रिपोर्टर की अभिव्यक्ति पैटर्न द्वारा सीमित किया जा सकता है।
यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल इमेजिंग रहते हैं, fluorescently लेबल hemocytes पर निर्भर करता है। भविष्य में, यह immunocytochemistry का उपयोग कर, जैसे, निर्धारण के बाद जारी की कोशिकाओं का पता लगाने की अनुमति के लिए संशोधित किया जा सकता है। विधि hemocytes की बहाली और उनके हेरफेर पूर्व अनुमति देता है के बाद से इस मामले में, प्रोटोकॉल आसंजन ऊष्मायन बार बढ़ रही है, और इस तरह के concanavalin ए, के रूप में चिपकने वाला स्लाइड कोटिंग जोड़कर उदाहरण के लिए रक्त कोशिकाओं की पूरी आसंजन, यह सुनिश्चित करने के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता विवो, यह विकास, सेल जैविक और जैव रासायनिक अध्ययन की एक विस्तृत रेंज को फायदा होगा। निवासी और घूम रक्त कोशिकाओं सभी ड्रोसोफिला के postembryonic विकास के चरणों और अन्य अकशेरुकी 22, suggesti के दौरान पाए जाते हैंएनजी इस विधि की है कि अनुकूलन ड्रोसोफिला लार्वा hematopoietic प्रणाली से परे अध्ययन की एक विस्तृत रेंज को फायदा होगा।
The authors have nothing to disclose.
हम उड़ शेयरों के लिए जेस्पर Kronhamn और दान Hultmark, माइकल Galko, और ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र धन्यवाद। सांख्यिकीय विश्लेषण के साथ सलाह के लिए कोर्टनी Onodera के लिए विशेष धन्यवाद। हम पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए कैटरीना सोना, और कल्पना Makhijani, कैटरीना गोल्ड, Derynck प्रयोगशाला के सदस्यों, और पांडुलिपि पर चर्चा और टिप्पणियों के लिए Nystul प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देता हूं। इस काम के निर्णायक बायोमेडिकल रिसर्च (PBBR), ब्रॉड केंद्र, हेलमैन फाउंडेशन, अमेरिकन कैंसर सोसायटी आरएसजी डीडीसी-122,595, अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन 13BGIA13730001, राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन 1,326,268, स्वास्थ्य 1R01GM112083-01 के राष्ट्रीय संस्थानों और के लिए UCSF कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया (KB करने के लिए) 1R56HL118726-01A1।
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |