Drosophila blood cells, or hemocytes, cycle between resident sites and circulation. In the larva, resident (sessile) hemocytes localize to inductive microenvironments, the Hematopoietic Pockets, while circulating hemocytes move freely in the hemolymph. The goal of this protocol is the standardized isolation and quantification of these two, behaviorally distinct but interchanging, hemocyte populations.
I virveldyr, er hematopoiesen regulert av induktive microenvironments (nisjer). Likeledes, i virvelløse modellorganisme Drosophila melanogaster, induktive microenvironments kjent som larve Hematopoetiske Pockets (HPS) har blitt identifisert som anatomiske områder for utvikling og regulering av blodceller (hemocytes), spesielt av den selvfornyende makrofag avstamning. HPS er segmentvis gjentas lommer mellom epidermis og muskellagene av larven, som også består av sensoriske neuroner i det perifere nervesystem. I larve, er bosatt (fastsittende) hemocytes eksponert for anti-apoptotiske, klebende og proliferative signaler fra disse sensoriske nevroner og eventuelt andre komponenter i HPS, som for eksempel foring muskel og epitel-sjikt. Under normal utvikling, gradvis frigjøring av fastboende hemocytes fra HPS brensel befolkningen i sirkulerende hemocytes, som kulminerer i utgivelsen av most av de fastboende hemocytes i begynnelsen av metamorfose. Immun overgrep, fysisk skade eller mekanisk forstyrrelse utløse tidlig frigjøring av fastboende hemocytes i sirkulasjon. Bryteren av larver hemocytes mellom fastboende steder og sirkulasjonen øker behovet for en felles standard / prosedyre for å selektivt isolere og kvantifisere disse to populasjoner av blodceller fra enkelt Drosophila larver. Følgelig beskriver denne protokollen en automatisert metode for å frigjøre og kvantifisere bosatt og sirkulerende hemocytes fra enkelt larver. Fremgangsmåten muliggjør ex vivo metoder, og kan være tilpasset til å tjene en rekke utviklingsstadier av Drosophila og andre virvelløse organismer.
Forskning i virvelløse modellen Drosophila melanogaster har drevet oppdagelsen av medfødt immunitet 1, og har lagt til rette forståelsen av ulike aspekter av blodcellenes utvikling 2-4. Drosophila hematopoiesen kan deles inn avstamning av embryonale / larve hemocytes, som stammer i embryo og ekspandere i larven, og avstamning av lymfekjertel hemocytes 4,5. Her presenterer vi en protokoll som fokuserer på linjen av embryonale / larve hemocytes, som i Drosophila larve består hovedsakelig plasmatocytes (makrofager) og få krystallceller 4. I larven, hemocytes av embryoet vedvarer og kolonisere segmentvis gjentatte og terminal Hematopoetiske Pockets (HPS) som ligger mellom epidermis og muskel lag av larvekroppen veggen 5,6. Basert på deres natur som selvfornyende makrofager 6, deres dominerende bolig i lokale vev microenvironments 6, 7, og deres slektslinje fra de tidligste blodcellene vekstutvikling under 6,8, denne blodcellepopulasjonen anses lik virveldyr selv-fornyende vevsmakrofager, en uavhengig myeloide cellelinjen nylig identifisert i en rekke arter 4,9,10. Men i Drosophila, noen eller alle av disse residente celler fra viser også plastisitet for å gi opphav til andre blodcelletyper som for eksempel krystallcellene 11,12.
Larve hemocytes er hovedsakelig bosatt (fastsittende), men er i en dynamisk steady-state mellom ulike HPS. De blir gradvis frigjort i sirkulasjonen, spesielt som 3. instar larver nærmer pupariation 5-7. Immun utfordringer, skade eller mekanisk forstyrrelse føre til en for tidlig, i sistnevnte tilfelle reversible, mobilisering av bosatt hemocytes inn hemolymph 4,6,13.
Tidligere studier har antydet at beboeren og sirkulerendelarve hemocytes er av samme avstamning, men varierer i sine klebende eller homing egenskaper 6,7,13,14. Selektiv isolering av sirkulerende versus bosatt hemocytes avslørt forhøyede nivåer av spredning i de fastboende hemocyte befolkningen, noe som tyder på deres eksponering for induktive signaler fra HPs 6. Drosophila larve HPs er omgitt av epidermis og muskellagene og videre havnen sensoriske nervecellen klynger av det perifere nervesystemet (PNS) og leverfunksjonen likner oenocytes 6. Funksjonelt, har mutant og genetiske celle ablasjon eksperimenter viste at sensoriske nevroner stede i HPs støtte trofisk overlevelse og lokalisering av larver hemocytes 6.
Her beskriver vi en fremgangsmåte for spesifikk isolering og kvantifisering av beboer og sirkulerende hemocytes fra enkelt Drosophila larver, og en protokoll for mekanisk hemocyte mobilisering. Metodene som kan anvendes for ex vivo-Studiet av hemocytes, og kan videre tilpasses andre Drosophila utviklingsstadier som puppe og voksen, og andre virvelløse systemer. Siden tidligere studier ikke skiller mellom beboer og sirkulerende hemocytes, gir denne protokollen en felles standard for studier av fastboende blodceller, og vil bidra til å øke konsistensen av virvelløse blodceller forskning.
Først beskriver Hemocyte Bleed / Skrap analysen differensial isolasjon og automatisert kvantifisering av fluorescerende protein-merket bosatt og sirkulerende hemocyte populasjoner fra enkelt Drosophila larver; protokollen gir to alternativer for regelmessige og flis skanne utstyrte mikroskoper (figur 1). Som et resultat, er den prosentandel av sirkulerende hemocytes og det totale antall hemocytes per larve oppnådd. Metoden baserer seg på transgene Drosophila larver som uttrykker fluorescerende protein blant sine blodlegemerbefolkning. Valget av hemocyte driver eller reporter avgjør utfallet, dvs. som populasjon av blodceller er visualisert og kvantifisert. Å merke hovedsak makrofager (plasmatocytes), som utgjør det store flertallet av de fastboende og sirkulerende hemocyte befolkningen i Drosophila larve 6, egnede transgener inkluderer HML Δ-DsRed 6, HmlΔ -GAL4 15, Pxn -GAL4 16, Crq-GAL4 (ved H. Agaisse 16), eller eater-GAL4 17; for merking av relativt liten bestand av krystall celler, egnede linjer er BcF6-CFP og -GFP 18, eller LZ-GAL4 (av J. Pollock 19), for merking lamellocytes, en spesialisert celletype i hovedsak forårsaket av immun utfordringer og skader 13, f.eks kan MSNF9mo-mCherry brukes 17. Noen transgene driverne er uttrykt i en rekke differensiert blodceller og stamfedre, som han – GAL4 20, som etiketter ca 80% av alle larveblodceller 20. Vær oppmerksom på at i alle tilfeller der GAL4 driverne er brukt, sammen med UAS-GFP eller annen fluorescerende protein UAS-transgenet er nødvendig. I Resultater seksjonen, blir denne metoden brukt til å overvåke blodcelletall og sirkulasjon oppførsel i løpet av larveutviklingen.
For det andre beskriver Hemocyte Forstyrrelse analysen et foregående trinn laget for å løsne fastboende hemocytes av ekstern manipulasjon, som senere gjør evalueringen av evne til hemocytes å re-holde og hjem til HPs innenfor en begrenset tidsramme (30 – 60 min) 6. Vanligvis er denne analysen er etterfulgt av Lufte / Skrap-analysen for å bestemme prosentandelen av sirkulerende hemocytes per larve. Vi presenterer en forenklet protokoll for denne analysen (figur 1D), som bruker forstyrrelse ved virvling with glassperler, snarere enn manipulering av enkelt larve med en pensel som tidligere beskrevet seks. I Resultater seksjonen, blir denne analysen anvendes for å demonstrere at forbigående frittliggende hemocytes flyter i hemolymph og kan utvinnes i fraksjonen av sirkulerende hemocytes. Analysen er også nyttig å kvantifisere forskjeller i hemocytes i deres homing / vedheft til bosatt områder, sammenligner for eksempel ulike genetiske bakgrunn eller stimulerings forhold. Vær oppmerksom på at dette mekanisk manipulasjon reflekterer en reversibel prosess og er forskjellig fra infection- eller skade-indusert bosatt hemocyte mobilisering, noe som vanligvis ikke er reversible i et kort tidsperspektiv 4,13.
Her beskriver vi den første metoden for å kvantitativt gjenopprette boende og sirkulerende blodceller fra enkelt Drosophila larver, og kvantifisere disse to hemocyte populasjoner. Protokollen omfatter sekvensiell utgivelsen av sirkulerende og bosatt blodceller, etterfulgt av bildebehandling og automatisert celletelling. Larve bosatt hemocytes kan forbigående mobilisert i omløp ved mekanisk forstyrrelse, en prosess som er kjent for å være stor grad reversert i løpet av en 30 – 60 min utvinning perioden 6. Følgelig ble denne protokollen testet på to måter, (1) ved å vurdere den totale hemocyte antallet per larve og fraksjon av sirkulerende hemocytes i løpet av larveutvikling, og (2) ved eksperimentelt løsner hørende hemocytes ved hjelp av en automatisert metode, som bekreftet stramt korrelasjon av hemocyte lokalisering og hemocyte nummer i boende og sirkulerende populasjoner. I tillegg ble reproduserbarhet av fremgangsmåten vist ved komparing to datasett av biologiske replikater.
I det siste har laboratorier benyttet en rekke teknikker for å kvantifisere larve hemocytes 6,13,21. Denne protokollen etablerer en felles standard for å hente og kvantifisere boende og sirkulerende blodcellepopulasjoner fra Drosophila larver, noe som gir en lett tilpasningsdyktig plattform. Metoden er beskrevet er kritisk for studier som fokuserer på rollen som bosatt hemocytes og deres mikromiljøet, Lommer på Hematopoietiske 4-6, og er egnet til å studere fluorescerende protein transgene førende Drosophila stammer i villtype og genmodifiserte bakgrunn. Protokollen er også relevant for studier som fokuserer på hemocyte mobilisering etter immun utfordring eller skade, og genetisk eller miljømessig indusert signale som utløser mobilisering av fastboende hemocytes eller endringer i total hemocyte nummer (anmeldt i 4). Det bør bemerkes at, i tilfeller av for tidlig differentiation og frigjøring av hemocytes fra lymfekjertel, skille embryonale / larve versus lymfekjertel linjene kan være begrenset av uttrykket mønster av fluorescerende hemocyte reporter brukt.
Protokollen som presenteres her er avhengig av bildebehandling levende, fluorescently merkede hemocytes. I fremtiden kan det bli modifisert for å muliggjøre påvisning av frigjorte celler etter fiksering, for eksempel ved hjelp av immunocytokjemi. I dette tilfelle kan protokollen må tilpasses for å sikre fullstendig adhesjon av blodceller, for eksempel ved å øke adhesjonen inkubasjonstider, og tilsetning av klebeglidebelegg, slik som concanavalin A. Siden metoden tillater gjenfinning av hemocytes og deres manipulasjon ex vivo, vil det gagne et bredt spekter av utviklings, cellebiologiske og biokjemiske studier. Boende og sirkulerende blodceller blir funnet under alle postembryonic utviklingsstadier av Drosophila og andre virvelløse dyr 22, suggesting at tilpasning av denne metoden vil dra et bredt spekter av studier utover Drosophila larve blodkreft system.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Jesper Kronhamn og Dan Hultmark, Michael Galko, og Bloomington Stock senter for flue aksjer. Spesiell takk til Courtney Onodera for råd med statistisk analyse. Vi takker Katrina Gold for kritisk lesing av manuskriptet, og Kalpana Makhijani, Katrina Gold, medlemmer av Derynck laboratoriet, og medlemmer av Nystul laboratorium for diskusjon og kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra UCSF Program for Gjennombrudd Biomedical Research (PBBR), Broad Center, Hellman Foundation, American Cancer Society RSG DDC-122595, American Heart Association 13BGIA13730001, National Science Foundation 1.326.268, National Institutes of Health 1R01GM112083-01 og 1R56HL118726-01A1 (til KB).
6cm/9cm Petri dishes | One for each genotype to be evaluated | ||
Water squirt bottle | |||
Metal spoon/spatula | |||
Thin paintbrush | e.g. a "liner" | ||
Glass cavity dish | |||
PAP pen: Super PAP PEN IM3580 | Beckman Coulter | ||
Glass slides | Each slide will have 5 or more PAP PEN squares drawn on them. Size of squares depends on the imaging objective and magnification of the microscope camera; e.g. 2mm squares. | ||
Moist chamber | This will be used to prevent slides and wells from drying out: sealed container with wet paper towels lining the sides/bottom | ||
Schneider’s Drosophila cell culture media | Invitrogen | ||
Cold block | This is a metal block (a.k.a. heating block) chilled in bucket containing ice; preferably black-colored or other dark, non-reflective color | ||
Two 1ml syringes with needles (27G ½) | Becton Dickinson | For dissections. | |
Optional: Surgical spring scissors (cutting edge 2mm) | Fine Science Tools | ||
Glass beads, 212-600 micron | Sigma | ||
2 ml Eppendorf tubes | Eppendorf | One per genotype evaluating | |
Vortex Mixer | Fisher Scientific | ||
Transgenic Drosophila larvae with fluorescently marked hemocytes. Suitable transgenes include: HmlΔ-DsRed (Makhijani et al., 2011), MSNF9mo-mCherry (Tokusumi et al., 2009), BcF6-CFP and -GFP (Gajewski et al., 2007), or HmlΔ-GAL4 (Sinenko and Mathey-Prevot, 2004), Pxn-GAL4 (Stramer et al., 2005), He-GAL4 (Zettervall et al., 2004), Crq-GAL4 (by H. Agaisse (Stramer et al., 2005)), or eater-GAL4 (Tokusumi et al., 2009) combined with UAS-GFP or other fluorescent protein transgenes. | |||
Fluorescence dissecting microscope | Leica | Here: Leica M205, optional with camera, imaging software and measuring module | |
Inverted fluorescence microscope with camera attachment | Leica or Keyence | With or without tile scanning function (eg. Leica DMI series, Keyence BIOREVO BZ-9000 series) |