Summary
Os invade parasita da malária e repetições dentro das células vermelhas do sangue. A avaliação precisa da invasão merozoite e parasitemia é fundamental para avaliar o curso da infecção da malária. Aqui nós descrevemos um protocolo de citometria de fluxo com base para a medição desses parâmetros em um modelo de rato da malária.
Protocol
Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as políticas da Universidade Macquarie e conformado com o Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica (NHMRC) Código australiano de prática. O trabalho foi realizado sob as Ética Nenhum Acordo ARA 2012/017 aprovados e obtido da Comissão de Ética Animal da Universidade de Macquarie. Todas as experiências foram realizadas em ratinhos SJL / J a menos que indicado de outra forma.
1. Ratos e Experimental Malaria Infection
- Camundongos com temperatura controlada (21 ° C) com um ciclo claro-escuro de 12:12 hr casa.
- Descongelar uma aliquota de criopreservado P. chabaudi Adami DS com 5% de hemácias parasitadas (PRBCs) e injetar 200 mL na cavidade intra-peritoneal de camundongos C57BL / 6 camundongo doador.
- Monitorar doador rato parasitemia a cada 1-2 dias, utilizando a citometria de fluxo, conforme descrito na Seção 3-4 do presente protocolo. Uma vez que os doadores atinge 5-15% parasitemia, coleta de sangue por punção cardíaca, como segue:
- Aspirar 100 ul de solução de heparina (300 U / ml de heparina em solução de Ringer rato (MTR) (NaCl 154 mM, KCl 5,6 mM, MgCl2 1 mM, 2,2 mM de CaCl2, 20 mM de HEPES, 10 mM de glucose, 30 U / ml heparina, pH 7,4, filtro de 0,22 ^ M esterilizado)) numa seringa de 1 ml com uma agulha G 26.
- Anestesiar o mouse por inalação com 5% de isoflurano, confirmando a profundidade desejada da anestesia, pela ausência de resposta de retirada pedal e dos reflexos da córnea.
- Coloque rato sobre o seu lado e perpendicularmente agulha de inserção, logo abaixo do cotovelo, através das costelas, e no coração. Puxe o êmbolo da seringa lenta e gire a agulha até 0,5-1 ml de sangue é obtido.
- Execute eutanásia humanitária por deslocamento cervical sob anestesia.
- Calcular as concentrado de hemácias por volume de sangue do dador assumindo uma contagem de sangue de 9 x 10 6 de RBC / ul (ou seja, se o doador estava em 10% quando a parasitemia sacrificados, o sangue conterá 9 x 10 5CH / ul). Dilui-se sangue parasitadas em solução salina de Krebs (NaCl 126 mM, KCl 2,5 mM, NaHCO 3 25, 1,2 mM de NaH 2 PO 4, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM de CaCl2, 0,2% de glucose, pH 7,2, filtro de 0,22 ^ M esterilizado) tamponada de modo que a concentração é de 1 x 10 4 concentrado de hemácias por 200 ul e 200 ul injectar na cavidade intraperitoneal de ratinhos necessárias para a marcação de RBC e experimento transfusão.
- Monitorar parasitemia a cada 1-2 dias, utilizando a citometria de fluxo, conforme descrito nas secções 3-4 deste protocolo.
2. A marcação de hemácias e Transfusão
- Recolha de sangue heparinizado a partir de murganhos, por punção cardíaca, tal como descrito no passo 1.3, e colocar em gelo. Manter sangue a 4 ° C em todos os momentos. Colete aproximadamente 200 sangue ul por mouse para ser injetado. Se necessário, dividida em duas amostras de sangue e tratar uma amostra de como desejar.
NOTA: Desta forma, a invasão do samp tratadale pode ser comparado com um controlo, uma amostra não tratada (ver Figura 1 para esquemática). - Prepara-se uma solução de cada etiqueta fluorescente RBC 2x.
- Dilui-se uma solução estoque a 2 mg / ml de Atto 633-N-hidroxisuccinimida (NHS Atto-633) em MTR, de modo que a concentração é de 20 ug / ml.
- Dilui-se uma solução estoque de 25 mg / ml de biotina-N-hidroxissuccinimida (biotina-NHS) em MTR, de modo que a concentração é de 250 ug / ml.
- Dividir as amostras de sangue em dois tubos e adicionar um volume igual de 2x solução Atto 633-NHS para um tubo, e um volume igual de 2x a biotina-NHS para outro tubo. Misturar imediatamente. Incubar sangue a 4 ° C durante 1 h, com agitação lenta constante, ou, alternativamente, misturar cada amostra de 10 - 15 min.
- Lavar 3 vezes sangue marcadas com MTRC (MTR + 0,5% albumina de soro bovino (BSA), filtro de 0,22 ^ M esterilizado) como se segue:
- Adicionar pelo menos dois volumes de MTRC, centrifugar a 750 xg durante 5 minutos, remover o sobrenadante, e resuspend o sedimento em, pelo menos, 2 volumes de MTRC. Repita mais duas vezes.
- Após a lavagem final, centrifugar a 750 xg durante 5 min e combinar o sangue sedimentadas em diferentes combinações (ou seja, sem tratamento Atto 633 / Biotina tratada e não tratada Biotina / tratada Atto 633). Adicionar MTR para fazer até um volume de 200 mL por rato para ser injetado.
- Injetar sangue marcado intravascular em camundongos infectados roedor malária ou controles não infectados como se segue:
- Execute transfusão a 2 - 15% parasitemia no auge de parasita esquizogonia.
NOTA: isto ocorre aproximadamente a meio do ciclo escuro (ou seja, entre 12-2 da manhã de um ciclo de luz normal, ou 12-2 pm em um ciclo de luz inverso). - Camundongos morna usando uma lâmpada de calor por 5-10 minutos para aumentar o fluxo sanguíneo, mas tomar precauções para não superaquecer os ratos. Coloque os ratos em um dispositivo de retenção e intravascular injetar 200 mL de sangue marcado (aproximadamente 1 - 2 x 10 9 RBCs) através da veia da cauda.
- Execute transfusão a 2 - 15% parasitemia no auge de parasita esquizogonia.
- Coletar amostras de sangue em diferentes momentos após a injeção, conforme descrito na Seção 3.
NOTA: As taxas de invasão pode ser quantificada inferior a 10 minutos após a injecção, dependendo da parasitemia do rato destinatário.
3. Recolha de amostras de sangue e Preparação para citometria de fluxo
- Preparar 50 ml de solução de coloração por amostra, e um pouco mais, no dia da experiência como se segue:
- Descongelar uma aliquota de 6 JC-1 mM armazenado a -20 ° C em dimetil-sulfóxido (DMSO).
- Quente 50 ul de MTRC por amostra, e um pouco mais, a 37 ° C.
- Embora a vórtex continuamente MTRC pré-aquecido, adicionar JC-1, de modo que a concentração final é de 12 uM. Isto é feito para reduzir a formação de JC-1 agregados; se agregados que formam, fazer tubo não centrífuga, pois isso vai evitar manchas.
NOTA: Uma pequena quantidade de agregação não afetará o resultado. - Adicionar anti-CD45 da APC eFluor 780 e anti-CD71 PerCP eFluor 710 de modo a que a concentração final é de 1 ug / ml. Se o experimento RBC marcado, adicionar estreptavidina PE-Cy7 de modo que a concentração final é de 1 ug / ml.
- Realizar cauda sangramento por amputação da ponta da cauda ou a laceração do vaso sanguíneo dentro da cauda. Coloque uma gota de sangue da cauda para um pequeno pesar barco ou lâmina de vidro. Após a coleta de sangue, garantir que o sangramento parou. Pipeta 3 ul de sangue da cauda em 50 ul de solução de coloração pré-aquecido a 37 ° C e incubar as amostras a 37 ° C durante 20 min.
- Descongelar uma aliquota de 4 mM de Hoechst 33342 armazenado a -20 ° C em água destilada (se usando um laser 355 nm) ou Hoechst 34580 2 mM armazenado a -20 ° C em água destilada (se usando um laser de 405 nm). Prepare 500 mL por amostra, além de extra, de uma solução de 4 mm ou 2 M de Hoechst em MTRC, respectivamente.
- Adicionar 500 uL de 4 uM Hoechst33342 ou 2 uM Hoechst 34580 para as amostras e incuba-se à temperatura ambiente durante 20 min.
- Centrifugar células a 750 xg durante 3 min a 4 ° C, o sobrenadante de descarte, adicionar 700 ul MTRC e analisar por citometria de fluxo.
4. Citometria de Fluxo
- Analisar amostras usando um laser 355/488/633 nm ou 405/488/633 instrumento a laser nm.
- Amostras de filtrar através de um filtro de células 35 mM imediatamente antes da análise. Enxágüe filtro de células com água destilada entre amostras e re-uso.
- Grave eventos suficientes para que a menor população contém, pelo menos, 500 eventos (geralmente 1.000.000 - 10.000.000 Eventos totais por amostra).
- Excite Hoechst 33342 usando um laser de 355 nm e detectar eventos através de um filtro 460/50. Excitar a Hoechst 34580 usando um laser de 405 nm e detectar eventos através de um filtro 460/50. Excitar JC-1, anti-CD71 PerCP eFluor 710 e PE-estreptavidina Cy7 utilizando um laser de 488 nm e detectar eventos através de um 530/40, 692/40, e filtrar 750LP respectivoly. Excite Atto 633 e anti-CD45 APC eFluor 780 usando um laser de 633 nm e detectar eventos através de um filtro de 670/30 ou 750LP respectivamente.
- Realizar análise e compensação usando citometria de fluxo apropriado software de análise da seguinte forma:
- Selecione as células inteiras e não incluem ruído, resíduos, e plaquetas com base em FSC / propriedades SSC (Figura 2A). Selecione células individuais com base em qualquer largura de pulso de disparo (Figura 2B) ou usando a área do pico do FSC e à altura (Figura 2C).
- Escolher a eritrócitos maduros, e excluir progenitores e leucócitos de RBC, com base na fluorescência negativa nas PerCP eFluor 710 e 780 APC eFluor canais (Figura 2D).
- Se a realização do experimento RBC marcado, selecione cada população de hemácias marcadas com base em PE-Cy7 e Atto 633 fluorescência e analisá-las separadamente (Figura 3A).
- Selecione concentrado de hemácias com base em fluorescência positiva para ambos JC-1 e Hoechst (
5. cálculos e estatísticas
- Calcular a parasitemia por divisão do número de concentrado de hemácias pelo número total de glóbulos vermelhos (ou seja, o número de eventos em Q2 portão dividido pelo número de eventos no portão G4). Ao realizar o ensaio de invasão de parasitemia as duas populações marcados podem ser calculadas dividindo o número de concentrado de hemácias marcadas pelo número de glóbulos vermelhos marcados em que a população (isto é, o número de eventos que são tanto em portas de L1 e Q2, dividido pelo número de eventos no portão L1).
NOTA: Rotulado parasitemia varia consideravelmente dependendo de fatores como a parasitemia endógeno e número de merozoites circulantes. Por esta razão, é útil para relatar a proporção de parasitemia, que é calculado como a parasitemia da população marcada tratados dividido pelo parasitemia da população de controlo marcado em cada ratinho individual. Para corrigir possíveis efeitos da tintura, relatório resulta umaé uma relação média parasitemia nas duas combinações de corantes. - Determinar a significância estatística dos índices usando o teste t uma amostra com 1 como a média hipotética.
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Representative Results
Medição da parasitemia.
Para a medição da parasitemia, células sanguíneas devem primeiro ser seleccionado, e o ruído, detritos e plaquetas excluídos, com base no FSC / SSC propriedades (Figura 2A). Dependendo do citómetro usado, células individuais devem, então, ser seleccionado com base em qualquer largura de impulsos de disparo (Figura 2B), ou FSC altura de pico com razão de área (Figura 2C). Restante eventos deve ser composto de leucócitos, manchado positivo para APC eFluor 780, progenitores RBC (incluindo reticulócitos), manchado positivo para PerCP eFluor 710, e os glóbulos vermelhos maduros, negativo para ambas as manchas (Figura 2D). Depois de selecionar a população em idade madura RBC, os eventos devem separar em quatro populações quando JC-1 fluorescência é plotado contra Hoechst 33342 (Figura 2E, F) ou Hoechst 34580 (Figura 2G, H) de fluorescência. A população positiva dupla representa eritrócitos parasitados, enquanto o rpopulações emaining são ou hemácias não infectadas (dupla negativa), HJ-hemácias (Hoechst positivo, JC-1 negativo), ou células desconhecidas (JC-1 positivo, Hoechst negativo). Notavelmente, JC-1 pode passar de fluorescência máximo a 529 nm e um pico largo a emissão a 590 nm, dependendo do potencial de membrana mitocondrial da célula. Independentemente dessa mudança JC-1 ficam fluorescentes fortemente no 530/40 nm canal, tornando este canal mais adequado para análise. No entanto, em alguns casos, pode ser útil para fluorescência adicionalmente ficha no 585/42 nm canal, que pode fornecer uma indicação do potencial de membrana mitocondrial de células. Em amostras não infectados menos de 0,007% dos eventos deve ser dupla positivo (Figura 2E, G). Este resultado vai depender da limpeza do citómetro de fluxo e pode variar consideravelmente, uma limpeza extensiva antes da análise pode melhorar os resultados. HJ-GVs representam 0,3-0,9% de eritrócitos maduros, fazendo com que a adição do corante JC-1 crítica para o accmedição de urato de baixa parasitemia.
Análise da invasão dos merozoítos.
Após a injecção de glóbulos vermelhos marcados em ratinhos infectados as taxas relativas de invasão para as duas populações marcados podem ser determinadas. As amostras de sangue devem ser recolhidas e preparadas como descrito para a medição de parasitemia com a adição de Estreptavidina PE Cy7. O momento em que a amostra é feita depende das condições experimentais e os resultados da análise desejada. Em geral, um ponto de tempo mais cedo será melhor reflectir um fenótipo invasão, embora possa ser benéfica para recolher vários pontos de tempo para aumentar a precisão. Para a análise de citometria de fluxo de dados, os glóbulos vermelhos maduros deve ser seleccionada como na Figura 2. A partir destas células, Atto 633 e eritrócitos marcados com biotina podem ser identificados com base na fluorescência nos canais 670/30 e 750LP respectivamente (Figura 3A). De agora em diante as três populações RBC (Atto 633, biotina, e sem rótulo)devem ser analisados separadamente. Em cada uma destas populações de parasitemia pode ser determinada com base na coloração com Hoechst e JC-1 (Figura 3B-D).
Figura 1. Representação esquemática do ensaio de invasão do parasita in vivo. Um exemplo de como este ensaio pode ser utilizado para determinar as taxas relativas de invasão nos eritrócitos tratados de acordo com a questão biológica do utilizador é mostrado. O sangue recolhido de ratos não infectados é dividido em dois tubos. Um tubo é tratado como desejado enquanto a outra amostra deixada sem tratamento (A). Os tubos são novamente divididos com uma marcada com NHS-biotina e a outra com NHS-Atto 633 (B). As amostras são então combinadas em duas combinações; Marcado com biotina GVs tratados com Atto 633 hemácias não tratadas marcadas e Atto 633 rotulados GVs tratados com Bioestanho marcado hemácias não tratados (C). Estas duas combinações são injectadas separadamente, em dois lotes de ratinhos infectados durante esquizogonico a 2 - 15% de parasitemia (D). Um total de 6 ratinhos receptores é recomendado para ganhar significado estatístico no resultado, embora mais ou menos pode ser usado se necessário. Adaptado de Lelliott et al. 14, publicado originalmente pela BioMed Central.
Figura 2. A medição da parasitemia por citometria de fluxo. Debris, o ruído, e as plaquetas são removidas de análise baseada em FSC / propriedades SSC (A). As células individuais são então seleccionados a partir das células restantes com base em qualquer largura de impulsos de disparo (B), ou pico FSC na razão de área (C). Os tipos de célula podem ser distinguidos com base na coloração positiva com CD45 APC eFluor780 (leucócitos), CD71 PerCP eFluor 710 (progenitores RBC), ou coloração negativa (amadurecer hemácias) (D). Depois de selecionar os glóbulos vermelhos maduros, as células são ou: Hoechst e JC-1 positivas (hemácias parasitadas), Hoechst, JC-1 negativo positivo e Hoechst negativo (células desconhecidos), ou dupla positivo e JC-1 negativo (hemácias contendo corpos Howell Jolly) (RBC não infectadas). Uninfected e P. chabaudi amostras infectadas corados com Hoechst 33342 (E, F), ou Hoechst 34580 (G, H), são mostrados. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Análise da invasão merozoite em duas populações marcadas RBC in vivo. Parcelas são de hemácias maduras, fechadocomo na Figura 2. As duas populações de glóbulos vermelhos marcados podem ser seleccionados com base na sua etiqueta (A). Atto 633 células marcadas no canal de fluorescência 670/30 (L1), as células marcados com biotina se ligam a estreptavidina e fluorescência no canal PE-Cy7 (L3) e as células não marcadas são negativas para estas manchas (L4). Em cada uma dessas populações hemácias parasitadas podem ser identificadas com base em Hoechst e JC-1 coloração positiva (Q2) (BD). Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Descrevemos um método para a medição de ambos parasitemia e merozóitos de invasão in vivo amostras. Em relação à medida da parasitemia, este método oferece uma vantagem sobre os métodos anteriores em que 10-13 HJ-GVs podem ser distinguidas a partir de concentrado de hemácias, reduzindo assim o número de eventos positivos falsos. Enquanto HJ-hemácias são geralmente rara em humanos, alguns estudos relatam altos níveis em ratos 15,16 fazendo a distinção entre essas células e concentrado de hemácias importantes para a medição exacta do roedor parasitemia. Usando este método, o limite de detecção para parasitemia é de aproximadamente 0,007% 14, embora seja possível reduzir esse preço tão baixo quanto 0,0005% sob as condições certas. Notavelmente, este limite é ditada pela limpeza do citómetro de fluxo usado e a capacidade para obter um grande número de eventos numa quantidade razoável de tempo. O problema mais comum associado com o uso desta técnica é insuficiente wit coloraçãoh JC-1. A fluorescência de JC-1 depende do potencial da membrana mitocondrial do parasita, e parasitas deve ser saudável, a fim de se obter uma óptima coloração. O armazenamento prolongado de parasitas ou de fixação deve ser evitada antes da coloração.
Cuidados também devem ser exercidos quando se analisa parasitas que tenham sido objecto de intervenções farmacológicas, pois isso também pode afetar o grau de coloração com JC-1. Nestes casos, pode ser útil analisar parasitemia baseado em fluorescência de Hoechst sozinho, em comparação com a parasitemia com a adição do corante JC-1. Com efeito, esta pode proporcionar uma medida de contagem de parasitas, bem como uma indicação geral de saúde do parasita. Finalmente, o corante JC-1 pode transferir a sua fluorescência a partir de um pico a 529 nm para um pico a 590 nm através da formação de J-agregados. A formação destes agregados depende da concentração de corante, que por sua vez depende do potencial da membrana mitocondrial da célula. A perda de potenti membrana mitocondrialai provoca uma mudança na fluorescência em direcção 529 nm, o que pode indicar células são apoptóticas. Em nossos concentrado de hemácias experiência corados com JC-1 sempre exibiu um padrão de fluorescência semelhante que era de aproximadamente igual intensidade, tanto no 530/40 nm canal eo 585/42 nm canal. No entanto, em alguns estudos, tais como aqueles que empregam intervenções medicamentosas, pode ser vantajoso para monitorizar as alterações na razão entre a fluorescência de 530/40 nm e o canal de 585/42 nm canal para todas as indicações de perda de potencial de membrana mitocondrial. É também importante notar que, JC-1 é particularmente susceptível à degradação e deve ser preparada a partir de uma alíquota congelada conforme descrito, enquanto que os ciclos de congelamento / descongelamento deve ser evitado. Após a coloração, JC-1 de fluorescência é relativamente estável com pouca ou nenhuma redução da fluorescência, pelo menos, ao longo de várias horas.
Para o ensaio de invasão in vivo, os dois factores mais críticos são a consistência na rotulagem pr RBCocesso e o tempo de injecção de sangue marcado. Para a marcação de RBC, a quantidade mínima de corante deve ser usado para evitar qualquer interferência com a capacidade do parasita para invadir o RBC, a qual foi criada como uma possibilidade, quando o uso de rótulos de superfície 7. Sob as condições de rotulagem descritos aqui invasão não é inibida 14, no entanto deve ser dada uma atenção especial à manutenção de concentrações de etiqueta consistentes e corantes devem ser mudados, a fim de evitar quaisquer imprecisões devido a inibição da invasão pelo selo RBC. Como parasitas submetidos a um ciclo de invasão sincronizada, é importante que as células marcadas são injectadas no momento certo do ciclo de vida do parasita. Isto deve ser feito de modo a maximizar o número de eventos de invasão, e, portanto, a exactidão do ensaio. Na nossa experiência, a invasão de pico ocorre aproximadamente a meio do ciclo de escuro, fazendo um quarto ciclo de luz inverso vantajosa para este ensaio.
O two ensaio de invasão etiqueta oferece um método preciso para determinar merozoite eficiência invasão em diferentes tipos de RBC in vivo. Esta abordagem, portanto, permite uma comparação entre RBC tratados, ou seja, tripsinizadas, e testemunha de hemácias. Alternativamente, os glóbulos vermelhos de ratos geneticamente modificados podem ser comparadas com as de ratinhos de controlo, ou glóbulos vermelhos de diferentes parâmetros fisiológicos ou idade diferente poderia ser comparada. Enquanto um ensaio semelhante foi descrito para a medição de invasão in vitro 9, o ensaio aqui fornece o potencial para contabilizar os efeitos apenas presentes in vivo, incluindo a influência do sistema imunitário, o que pode alterar potencialmente mecanismos de invasão do parasita 17-19. Finalmente, este ensaio tem o potencial de fornecer insights patologias tais como a depuração imunológica de concentrado de hemácias, e o crescimento do parasita, se o concentrado de hemácias dentro das populações marcadas são monitorizados durante um período prolongado.
Sobre Umll, um protocolo detalhado para a medição exacta de parasitemia in vivo em amostras é descrito, que tem uma vantagem sobre os ensaios anteriores em que HJ-GVs podem ser distinguidas a partir de concentrado de hemácias. Além disso, um ensaio está descrito, para a quantificação da eficácia invasão em diferentes tipos de RBC in vivo.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Reconhecemos financiar o apoio do Conselho de Pesquisa Nacional de Saúde e Medicina (conceder APP605524, 490037 e 1047082), o Australian Research Council (conceder DP12010061), a Estratégia Nacional de Infra-estrutura Collaborative Research, da Austrália e do fundo de investimento de Educação do Departamento de Inovação, Indústria , Ciência e Investigação. PML é um receptor de um prêmio de Pós-Graduação da Austrália.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| Hoechst 34580 | Sigma-Aldrich | 63493 | Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water |
| JC-1 Dye | Life Technologies | T-3168 | Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO |
| Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 | eBioscience | 47-0451-80 | Clone 30-F11 |
| Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 | eBioscience | 46-0711-80 | Clone R17217 |
| Atto 633 NHS ester | Sigma-Aldrich | 1464 | Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin | Thermo Fisher Scientific | 21335 | Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF |
| Streptavidin PE-Cyanine7 | eBioscience | 25-4317-82 | Streptavidin PE-Cy7 |
| Heparin | Sigma-Aldrich | H478 | |
| 35 µM filter cap tubes | Becton Dickinson | 352235 | |
| Flow cytometer: BD LSRFortessa | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD FACSAria II | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: BD Influx | Becton Dickinson | ||
| Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer | Beckman Coulter |
References
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