Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

في تقييم فيفو من القوارض المتصورة الطفيل وأقسومة الغزو من قبل التدفق الخلوي

doi: 10.3791/52736 Published: April 5, 2015

Summary

ويغزو الطفيلي الملاريا ومكررات داخل خلايا الدم الحمراء. تقييم دقيق للغزو أقسومة والطفيل هو بالتالي حاسما في تقييم مسار عدوى الملاريا. نحن هنا وصف التدفق الخلوي بروتوكول أساس لقياس هذه المعايير في نموذج الفأر من الملاريا.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وأجريت جميع الإجراءات وفقا لسياسات جامعة ماكواري ويتفق مع المجلس الوطني للصحة والبحوث الطبية (NHMRC) رمز الاسترالي من الممارسة. تم إجراء العمل في إطار أخلاقيات اتفاق لا ARA 2012/017 الموافقة والحصول عليها من لجنة الأخلاقيات الحيوانية في جامعة ماكواري. أجريت جميع التجارب على الفئران SJL / J ما لم ينص على خلاف ذلك.

1. الفئران والعدوى التجريبية الملاريا

  1. الفئران منزل تحت درجة حرارة رقابة (21 ° C) مع دورة ضوء الظلام 0:12 ساعة.
  2. ذوبان الجليد قسامة من cryopreserved P. chabaudi DS آدمي مع 5٪ مطفول كرات الدم الحمراء (pRBCs) وحقن 200 ميكرولتر في تجويف داخل الصفاق من C57BL / 6 الماوس المانحة.
  3. مراقبة المانحة الماوس الطفيل كل 1 - 2 أيام باستخدام التدفق الخلوي كما هو موضح في القسم 3-4 من هذا البروتوكول. بعد أن يصل المانحين 5-15٪ الطفيل، وجمع الدم عن طريق ثقب في القلب على النحو التالي:
    1. نضح 100 ميكرولتر من محلول الهيبارين (300 U / مل الهيبارين في حل الماوس قارع الأجراس (MTR) (154 مم كلوريد الصوديوم، 5.6 ملي بوكل، 1 ملم MgCl 2.2 ملي CaCl 20 ملي HEPES، 10 ملي الجلوكوز، 30 U / مل الهيبارين، ودرجة الحموضة 7.4، 0.22 ميكرومتر تصفية تعقيم)) في حقنة 1 مل مع إبرة 26 G.
    2. تخدير الماوس عن طريق الاستنشاق مع 5٪ isofluorane، مؤكدا عمق المطلوب من التخدير عن طريق عدم وجود استجابة دواسة الانسحاب وردود الفعل القرنية.
    3. ضع الماوس على جانبها وعموديا إبرة إدراج أسفل الكوع، من خلال الأضلاع، والى القلب. سحب حقنة المكبس ببطء وتدوير الإبرة حتى 0.5 - يتم الحصول على 1 مل من الدم.
    4. أداء القتل الرحيم إنسانية من قبل خلع عنق الرحم تحت التخدير.
  4. حساب pRBCs في حجم الدم المانحة على افتراض تعداد الدم من 9 × 10 6 RBC / ميكرولتر (أي إذا كان المتبرع بنسبة 10٪ الطفيل عندما ضحى، والدم يحتوي على 9 × 10 5pRBC / ميكرولتر). تمييع الدم مطفول في كريبس المالحة (126 ملم كلوريد الصوديوم، 2.5 ملي بوكل، 25 ملي NaHCO 1.2 ملي ناه 2 PO 1.2 ملي MgCl 2.5 ملي CaCl والجلوكوز بنسبة 0.2٪، ودرجة الحموضة 7.2، 0.22 ميكرومتر تصفية تعقيمها) مخزنة ذلك أن تركيز هو 1 × 10 4 pRBCs لكل 200 ميكرولتر وتضخ 200 ميكرولتر في تجويف داخل الصفاق من الفئران اللازمة لوضع العلامات RBC وتجربة نقل الدم.
  5. مراقبة الطفيل كل 1 - 2 أيام باستخدام التدفق الخلوي كما هو موضح في القسمين 3-4 من هذا البروتوكول.

2. وضع العلامات من كرات الدم الحمراء ونقل

  1. جمع الدم heparinized من الفئران عن طريق ثقب في القلب كما هو موضح في الخطوة 1.3، ووضع على الجليد. إبقاء الدم في 4 درجات مئوية في جميع الأوقات. جمع ما يقرب من 200 ميكرولتر الدم في الماوس ليتم حقنه. إذا لزم الأمر، وتقسيم الدم الى عينتين وعلاج عينة واحدة كما تريد.
    ملاحظة: في هذه الطريقة، غزو عصيدة تعامللو يمكن مقارنة إلى عنصر تحكم، عينة غير المعالجة (انظر الشكل رقم 1 لالتخطيطي).
  2. يعد حل 2X كل تسمية RBC الفلورسنت.
    1. تمييع 2 ملغ / مل من محلول المخزون أتو 633-N-Hydroxysuccinimide (أتو 633-NHS) في MTR ذلك أن تركيز 20 ميكروغرام / مل.
    2. تمييع 25 ملغ / مل محلول المخزون من البيوتين-N-Hydroxysuccinimide (البيوتين-NHS) في MTR ذلك أن تركيز 250 ميكروغرام / مل.
  3. تقسيم عينات الدم إلى أنبوبين وإضافة حجم مساو من 2X أتو 633-NHS حل للأنبوب واحد، وحجم مساو من 2X البيوتين-NHS إلى أنبوب آخر. مزيج الفور. احتضان الدم عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع خلط البطيء المستمر، أو بدلا من ذلك، مزيج عينة كل 15 - 10 دقيقة.
  4. غسل المسمى الدم 3 مرات مع MTRC (MTR + 0.5٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، 0.22 ميكرومتر تصفية تعقيمها) على النحو التالي:
    1. إضافة على الأقل 2 مجلدات من MTRC، الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 5 دقائق، وإزالة طاف، وresuspenد بيليه في لا يقل عن 2 مجلدات من MTRC. كرر 2 مرات أكثر.
    2. بعد غسل النهائي، الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 5 دقائق والجمع بين الدم مكعبات في تركيبات مختلفة (أي غير المعالجة أتو 633 / معاملة البيوتين، غير المعالجة البيوتين / تعامل أتو 633). إضافة MTR لجعل ما يصل الى حجم 200 ميكرولتر في الماوس ليتم حقنه.
  5. حقن الدم المسمى intravascularly إلى القوارض الفئران المصابة بالملاريا أو الضوابط غير المصابة على النحو التالي:
    1. أداء نقل عند 2 - 15٪ الطفيل في ذروة الطفيل تكاثر انشطاري.
      ملاحظة: يحدث هذا في منتصف المسافة تقريبا من خلال دورة الظلام (أي بين 12-2 من صباح يوم دورة الضوء العادية، أو 12-2 مساء يوم دورة ضوء العكسي).
    2. الفئران الدافئة باستخدام مصباح الحرارة لمدة 5-10 دقائق لزيادة تدفق الدم، ولكن اتخاذ الاحتياطات اللازمة لعدم ارتفاع درجة حرارة الفئران. وضع الفئران في جهاز الزجرية وintravascularly حقن 200 ميكرولتر الدم المسمى (حوالي 1 - 2 × 10 9 RBCS) عن طريق الوريد الذيل.
  6. جمع عينات الدم عند نقاط زمنية مختلفة بعد الحقن كما هو موضح في القسم 3.
    ملاحظة: معدلات الغزو يمكن كميا أقل من 10 دقيقة بعد الحقن، وهذا يتوقف على الطفيل من الماوس المتلقي.

3. جمع عينات الدم والتحضير للالتدفق الخلوي

  1. تجهيز 50 ميكرولتر من الحل تلطيخ لكل عينة، زائد إضافي، في يوم التجربة على النحو التالي:
    1. تذويب قسامة من 6 ملي JC-1 المخزنة في -20 درجة مئوية في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO).
    2. دافئ 50 ميكرولتر من MTRC لكل عينة، زائد إضافي، إلى 37 درجة مئوية.
    3. في حين vortexing لباستمرار MTRC استعد مسبقا، إضافة JC-1 بحيث التركيز النهائي هو 12 ميكرومتر. ويتم ذلك للحد من تشكيل JC-1 المجاميع. إذا المجاميع لا تشكل، هل أنبوب لا الطرد المركزي حيث سيؤدي ذلك إلى منع تلطيخ.
      ملاحظة: وهناك كمية صغيرة من تجميع لن يؤثر على النتائج.
    4. إضافة المضادةCD45 APC eFluor 780 ومكافحة CD71 PerCP eFluor 710 بحيث التركيز النهائي هو 1 ميكروغرام / مل. إذا بإجراء التجربة RBC المسمى، إضافة streptavidin PE-Cy7 بحيث التركيز النهائي هو 1 ميكروغرام / مل.
  2. أداء ذيل النزيف عن طريق بتر طرف الذيل أو تهتك في الأوعية الدموية داخل الذيل. ضع قطرة من الدم ذيل الصعود إلى وزن القارب أو الزجاج الشريحة الصغيرة. بعد جمع الدم، تأكد من أن النزيف قد توقف. ماصة 3 ميكرولتر من ذيل الدم إلى 50 ميكرولتر من الحل تلطيخ قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية، واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
  3. تذويب قسامة من 4 ملي هويشت 33342 المخزنة في -20 درجة مئوية في الماء المقطر (إذا باستخدام الليزر 355 نانومتر) أو 2 مم هويشت 34580 المخزنة في -20 درجة مئوية في الماء المقطر (إذا باستخدام الليزر 405 نانومتر). إعداد 500 ميكرولتر لكل عينة، بالإضافة إلى خارج، من حل 4 ميكرومتر أو 2 ميكرومتر من هويشت في MTRC، على التوالي.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من 4 ميكرومتر هويشت33342 أو 2 ميكرومتر هويشت 34580 لعينات واحتضان في RT لمدة 20 دقيقة.
  5. خلايا الطرد المركزي في 750 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية، وطاف نبذ، إضافة 700 ميكرولتر MTRC وتحليل التدفق الخلوي.

4. التدفق الخلوي

  1. تحليل العينات باستخدام الليزر 355/488/633 نانومتر أو 405/488/633 نانومتر أداة الليزر.
  2. مرشح عينات من خلال مصفاة الخلية 35 ميكرومتر على الفور قبل التحليل. شطف مصفاة الخلية مع الماء المقطر بين العينات وإعادة استخدامها.
  3. تسجيل ما يكفي من الأحداث بحيث أصغر السكان يحتوي على ما لا يقل عن 500 الأحداث (عادة 1،000،000 - 10،000،000 اجمالي الأحداث في العينة).
  4. تثير هويشت 33342 باستخدام الليزر 355 نانومتر، والكشف عن الأحداث من خلال مرشح 460/50. تثير هويشت 34580 باستخدام الليزر 405 نانومتر، والكشف عن الأحداث من خلال مرشح 460/50. تثير JC-1، ومكافحة CD71 PerCP eFluor 710 وStreptavidin PE-Cy7 باستخدام الليزر 488 نانومتر، والكشف عن الأحداث من خلال 530/40، 692/40، و750LP تصفية مختصلاي. تثير أتو 633 ومكافحة CD45 APC eFluor 780 باستخدام الليزر 633 نانومتر، والكشف عن الأحداث من خلال 670/30 أو 750LP مرشح على التوالي.
  5. لتحليل والتعويض باستخدام التدفق الخلوي المناسب برامج التحليل على النحو التالي:
    1. حدد الخلايا بأكملها واستبعاد الضوضاء، والحطام، والصفائح الدموية على أساس FSC / خصائص التعاون بين بلدان الجنوب (الشكل 2A). حدد الخلايا واحدة على أساس إما عرض الزناد نبض (الشكل 2B) أو باستخدام منطقة ذروة FSC إلى نسبة الارتفاع (الشكل 2C).
    2. حدد كرات الدم الحمراء الناضجة، واستبعاد الأسلاف RBC والكريات البيض، على أساس مضان سلبي في PerCP eFluor 710 و APC eFluor 780 قنوات (الشكل 2D).
    3. إذا بإجراء التجربة RBC المسمى، حدد كل السكان من كرات الدم الحمراء وصفت على أساس PE-Cy7 وأتو 633 مضان وتحليل هذه بشكل منفصل (الشكل 3A).
    4. حدد pRBCs على أساس مضان إيجابي لكلا JC-1 و هويشت (

5. الحسابات والإحصاء

  1. حساب الطفيل عن طريق قسمة عدد pRBCs من إجمالي عدد كرات الدم الحمراء (أي عدد من الأحداث في بوابة Q2 مقسوما على عدد من الأحداث في بوابة G4). عند إجراء فحص الطفيل الغزو اثنين من السكان وصفت يمكن أن تحسب بقسمة عدد من pRBCs وصفت من قبل عدد من كرات الدم الحمراء وصفت في ذلك السكان (أي عدد من الأحداث التي هي في كل بوابات L1 وQ2، مقسوما على عدد من الأحداث في بوابة L1).
    ملاحظة: تختلف إعتبر الطفيل اعتمادا كبيرا على عوامل مثل الطفيل الذاتية وعدد من merozoites المنتشرة. لهذا السبب، فإنه من المفيد للإبلاغ عن نسبة الطفيل، والذي يحسب مثل الطفيل للتعامل السكان وصفت مقسوما على الطفيل السيطرة المسمى السكان في كل فأر الفردية. لتصحيح آثار الصبغة الممكنة، النتائج التقريرليالي نسبة الطفيل متوسط ​​عبر مجموعات صبغ اثنين.
  2. تحديد الدلالة الإحصائية لنسب باستخدام عينة واحدة ر -test مع 1 كما يعني افتراضية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

قياس الطفيل.

لقياس الطفيل، ينبغي أولا أن يتم اختيار خلايا الدم، والضوضاء، والحطام والصفائح الدموية استبعاد، على أساس FSC / خصائص التعاون بين بلدان الجنوب (الشكل 2A). اعتمادا على عداد الكريات المستخدمة، وينبغي بعد ذلك يتم اختيار الخلايا واحد على أساس إما عرض الزناد نبض (الشكل 2B)، أو FSC ارتفاع الذروة إلى نسبة المساحة (الشكل 2C). المتبقية يجب أن تتكون أحداث الكريات البيض، ملطخة إيجابية لAPC eFluor 780، الأسلاف RBC (بما في ذلك الشبكيات)، ملطخة إيجابية لPerCP eFluor 710، وكرات الدم الحمراء الناضجة، السلبية لكل من هذه البقع (الشكل 2D). بعد اختيار السكان RBC ناضجة، يجب فصل الأحداث إلى أربعة السكان عندما يتم رسم JC-1 مضان ضد هويشت 33342 (الشكل 2E، F) أو هويشت 34580 (الشكل 2G، H) مضان. ويمثل السكان الإيجابي المزدوج كرات الدم الحمراء بالطفيلي، في حين أن صالسكان emaining إما كرات الدم الحمراء غير المصابة (المزدوج السلبي)، HJ-كرات الدم الحمراء (هويشت إيجابية، JC-1 سلبي)، أو خلايا غير معروفة (JC-1 إيجابية، هويشت سلبي). والجدير بالذكر أن JC-1 مضان قد تحول من كحد أقصى في 529 نانومتر إلى ذروتها الانبعاثات واسعة في 590 نانومتر، وهذا يتوقف على إمكانات غشاء الميتوكوندريا من الخلية. بغض النظر عن هذا التحول JC-1 سوف يتألق بقوة في 530/40 نانومتر قناة، مما يجعل هذه القناة الأكثر ملاءمة للتحليل. ومع ذلك، في بعض الحالات قد يكون من المفيد أن مضان قياسي بالإضافة إلى ذلك في 585/42 نانومتر القناة، والتي قد توفر مؤشرا على احتمال غشاء الميتوكوندريا من الخلايا. في عينات غير المصابة يجب أن يكون أقل من 0.007٪ من الأحداث الإيجابية المزدوج (الشكل 2E، G). وهذه النتيجة تعتمد على نظافة تدفق عداد الكريات ويمكن أن تختلف إلى حد كبير، وتنظيف واسعة النطاق قبل التحليل قد تحسن النتائج. حساب HJ-كرات الدم الحمراء ل0،3-0،9٪ من كرات الدم الحمراء الناضجة، مما يجعل من إضافة الصبغة JC-1 حاسمة لجنة التنسيق الإداريةقياس راتي من انخفاض الطفيل.

تقييم الغزو أقسومة.

بعد حقن كرات الدم الحمراء وصفت في الفئران المصابة يمكن تحديد معدلات الغزو النسبية إلى قسمين السكان المسمى. ينبغي أن تؤخذ عينات الدم وأعد كما هو موضح لقياس الطفيل مع إضافة Streptavidin PE Cy7. في الوقت الذي يتم أخذ العينة يعتمد على الظروف التجريبية والنتيجة المرجوة من التحليل. بشكل عام، فإن نقطة مرة سابقة تعكس أفضل النمط الظاهري الغزو، على الرغم من أنه قد يكون من المفيد لجمع نقاط زمنية متعددة لزيادة الدقة. لتحليل التدفق الخلوي البيانات، ينبغي اختيار كرات الدم الحمراء الناضجة كما في الشكل (2). من هذه الخلايا، أتو 633 والبيوتين وصفت كرات الدم الحمراء يمكن تحديدها على أساس مضان في القنوات 670/30 و750LP على التوالي (الشكل 3A). من هنا على السكان RBC الثلاثة (أتو 633، البيوتين، وليس لها علامة)ينبغي تحليلها بشكل منفصل. في كل من هذه المجموعات السكانية الطفيل يمكن تحديدها استنادا إلى تلطيخ مع هويشت وJC-1 (الشكل 3B-D).

الشكل (1)
ويظهر الشكل 1. تخطيطي لفي الجسم الحي الغزو الطفيلي الفحص. مثال على كيف يمكن استخدام هذا الاختبار لتحديد معدلات الغزو النسبية في كرات الدم الحمراء تعامل وفقا لمسألة البيولوجي المستخدم. وينقسم الدم التي تم جمعها من الفئران غير مصاب إلى أنبوبين. يتم التعامل مع أنبوب واحد على النحو المرغوب فيه في حين يتم ترك عينة أخرى غير المعالجة (A). وتنقسم الأنابيب مرة أخرى مع واحد المسمى مع NHS-البيوتين والآخر مع NHS-أتو 633 (B). ثم يتم الجمع بين العينات في مختبرين مجموعات. البيوتين وصفت كرات الدم الحمراء تعامل مع أتو 633 كرات الدم الحمراء غير المعالجة وصفت وأتو 633 المسمى كرات الدم الحمراء تعامل مع بيوالقصدير وصفت كرات الدم الحمراء غير المعالجة (C). يتم حقن هذه المجموعات اثنين على حدة إلى قسمين الكثير من الفئران المصابة خلال تكاثر انشطاري 2 - 15٪ الطفيل (D). ويوصى ما مجموعه 6 الفئران المتلقي لكسب دلالة إحصائية في النتيجة، على الرغم من أن أكثر أو أقل يمكن استخدامها إذا لزم الأمر. مقتبس من Lelliott وآخرون 14، التي نشرت في الأصل من قبل بيوميد الوسطى.

الشكل 2
الشكل 2. قياس الطفيل عن طريق التدفق الخلوي. تتم إزالة الحطام، والضوضاء، والصفائح الدموية من التحليل على أساس FSC / خصائص التعاون بين بلدان الجنوب (A). ثم يتم اختيار الخلايا واحد من الخلايا المتبقية على أساس إما عرض الزناد نبض (B)، أو FSC الذروة إلى نسبة المساحة (C). أنواع الخلايا ومن ثم يمكن تمييزها على أساس تلطيخ إيجابي مع CD45 APC eFluor780 (الكريات البيض)، CD71 PerCP eFluor 710 (الأسلاف RBC)، أو تلطيخ السلبية (تنضج كرات الدم الحمراء) (D). بعد اختيار كرات الدم الحمراء الناضجة، خلايا إما: هويشت وJC-1 الإيجابية (كرات الدم الحمراء مطفول)، هويشت، JC-1 سلبي إيجابية وسلبية هويشت (خلايا غير معروفة)، أو مزدوجة الإيجابية وJC-1 سلبي (كرات الدم الحمراء التي تحتوي على أجسام هاول جولي) (كرات الدم الحمراء غير المصابة). غير مصاب وP. chabaudi عينات المصابين ملطخة هويشت 33342 (E، F)، أو هويشت 34580 (G، H)، وترد. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3. تقييم الغزو أقسومة إلى قسمين المسمى السكان RBC في الجسم الحي. المؤامرات هي من كرات الدم الحمراء الناضجة، مسوركما في الشكل (2). ويمكن اختيار اثنين من السكان RBC المسمى على أساس التسمية من (A). أتو 633 الخلايا المسمى يتألق في قناة 670/30 (L1)، وخلايا البيوتين وصفت ربط لstreptavidin ويتألق في قناة PE-Cy7 (L3)، والخلايا غير المسماة سلبية لهذه البقع (L4). في كل من هذه المجموعات السكانية يمكن تحديد كرات الدم الحمراء تطفل على أساس هويشت وJC-1 تلطيخ إيجابي (Q2) (BD). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وصفناها طريقة لقياس كل من الغزو الطفيل وأقسومة العينات في الجسم الحي. من حيث قياس الطفيل، وهذه الطريقة يوفر ميزة على الطرق السابقة 10-13 في ذلك HJ-كرات الدم الحمراء يمكن تمييزها عن pRBCs، مما يقلل من عدد من الأحداث الإيجابية الكاذبة. بينما HJ-كرات الدم الحمراء وعادة ما تكون نادرة في البشر، وبعض الدراسات تفيد مستويات عالية في الفئران 15،16 جعل التمييز بين هذه الخلايا وpRBCs مهمة لقياس دقيق لالقوارض الطفيل. باستخدام هذه الطريقة في الحد من الكشف عن الطفيل ما يقرب من 0.007٪ 14، على الرغم من أنه من الممكن للحد من هذا منخفضة تصل إلى 0.0005٪ في ظل الظروف المناسبة. والجدير بالذكر أن وأملت هذا الحد من قبل نظافة تدفق عداد الكريات المستخدمة والقدرة على الحصول على أعداد كبيرة من الأحداث في كمية معقولة من الزمن. المشكلة الأكثر شيوعا المرتبطة باستخدام هذه التقنية غير كافية تلطيخ الطرافةح JC-1. مضان من JC-1 يعتمد على إمكانات غشاء الميتوكوندريا من الطفيليات، ويجب أن يكون الطفيليات صحي من أجل الحصول على تلطيخ الأمثل. لذا ينبغي تجنب التخزين لفترات طويلة من الطفيليات أو التثبيت قبل تلطيخ.

وينبغي أيضا الحرص عند تحليل الطفيليات التي كانت تخضع لتدخلات المخدرات، لأن هذا قد يؤثر أيضا على مدى تلطيخ مع JC-1. في هذه الحالات قد يكون من المفيد لتحليل الطفيل على أساس هويشت مضان وحده، بالمقارنة مع الطفيل مع إضافة الصبغة JC-1. والواقع أن هذا قد يوفر قدرا من عدد الطفيليات، وكذلك مؤشر العام للصحة الطفيلي. وأخيرا، فإن صبغ JC-1 قد يتحول مضان لها من ذروة في 529 نانومتر إلى ذروته في 590 نانومتر من خلال تشكيل J-المجاميع. تشكيل هذه المجاميع يعتمد على تركيز الصبغة، والتي تعتمد بدورها على إمكانات غشاء الميتوكوندريا من الخلية. فقدان غشاء الميتوكوندريا potentiيسبب آل تحولا في مضان نحو 529 نانومتر، والتي قد تشير إلى الخلايا هي أفكارك. في تجربتنا pRBCs ملطخة JC-1 عرضت دائما نمط مماثل مضان التي كانت كثافة متساوية تقريبا في كل من 530/40 نانومتر القناة و585/42 نانومتر القناة. ومع ذلك، في بعض الدراسات، مثل تلك التي تستخدم التدخلات المخدرات، قد يكون من المفيد لرصد التغيرات في نسبة مضان بين 530/40 نانومتر القناة و585/42 نانومتر قناة لأي مؤشرات على فقدان غشاء المحتملة الميتوكوندريا. ومن المهم أيضا أن نلاحظ أن JC-1 هو عرضة بشكل خاص للتدهور ويجب الطازجة من قسامة المجمدة كما وصفها، في حين ينبغي تجنب دورات تجميد / الذوبان. بعد تلطيخ، JC-1 مضان مستقرة نسبيا مع انخفاض ضئيلة أو معدومة في مضان، على الأقل على مدى عدة ساعات.

لفي الجسم الحي الغزو الفحص، وهما أهم العوامل الحاسمة هي الاتساق في RBC وضع العلامات والعلاقات العامةocess ووقت حقن الدم المسمى. لوضع العلامات RBC، يجب استخدام الحد الأدنى من صبغ لمنع أي تدخل في قدرة الطفيلي لغزو RBC، التي أثيرت هذا احتمال ممكن عند استخدام تسميات سطح 7. وفقا للشروط وضع العلامات الموضحة هنا لا تحول دون غزو 14، ولكن ينبغي إيلاء اهتمام دقيق للحفاظ على تركيزات التسمية متسقة، ويجب أن تنتقل الأصباغ، من أجل منع أي عدم دقة بسبب الغزو تثبيط من قبل التسمية RBC. كما تخضع الطفيليات دورة الغزو متزامنة، فمن المهم أن الخلايا المسمى يتم حقن في الوقت المناسب في دورة حياة الطفيليات. وينبغي القيام بذلك من أجل تحقيق أقصى قدر من عدد من الأحداث الغزو، وبالتالي دقة الفحص. في تجربتنا ذروة الغزو يحدث تقريبا في منتصف الطريق من خلال دورة الظلام، مما يجعل غرفة دورة الخفيفة عكس المفيد لهذا الاختبار.

رالتعليم الجامعي الغزو التسمية الفحص يوفر طريقة دقيقة لتحديد كفاءة الغزو أقسومة إلى أنواع مختلفة من RBC في الجسم الحي. وبالتالي يسمح هذا النهج مقارنة بين كرات الدم الحمراء المعالجة، أي trypsinized، وكرات الدم الحمراء السيطرة. بدلا من ذلك، يمكن مقارنة كرات الدم الحمراء من الفئران المعدلة وراثيا لتلك السيطرة على الفئران، أو كرات الدم الحمراء من المعلمات الفسيولوجية المختلفة أو مختلف الأعمار يمكن مقارنة. في حين وصفت مقايسة مماثل لقياس الغزو في المختبر الفحص يوفر هنا يمكن أن تشكل الآثار موجودة فقط في الجسم الحي، بما في ذلك تأثير جهاز المناعة، وهو ما قد يغير آليات الغزو الطفيلي 17-19. وأخيرا، يحتوي هذا الاختبار أيضا القدرة على توفير نظرة ثاقبة الأمراض مثل إزالة المناعي للpRBCs، والنمو الطفيلي، إذا تم رصد pRBCs داخل السكان وصفت على مدى فترة ممتدة.

Overaليرة لبنانية، وصفت بروتوكول مفصلة لقياس دقيق للالطفيل في الجسم الحي في العينات، التي لديها ميزة على المقايسات السابقة في هذا HJ-كرات الدم الحمراء يمكن تمييزها عن pRBCs. وعلاوة على ذلك، وصفت مقايسة لتقدير الكفاءة الغزو في مختلف أنواع RBC في الجسم الحي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

ونحن نعترف تمويل الدعم من مجلس البحوث الصحية والطبية الوطنية (منح APP605524، 490037 1047082 و)، ومجلس الأبحاث الأسترالي (منح DP12010061)، والاستراتيجية البنية التحتية البحوث التعاونية الوطنية في أستراليا وصندوق الاستثمار التعليم من قسم الابتكار والصناعة والعلوم والبحوث. حزب الرابطة الاسلامية هي المستفيدة من جائزة الدراسات العليا الاسترالية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bisBenzimide H 33342 trihydrochloride Sigma-Aldrich B2261 Hoechst 33342. Store a 4 mM stock solution at -20 °C in distilled water
Hoechst 34580 Sigma-Aldrich 63493 Store a 2 mM stock solution at -20 °C in distilled water
JC-1 Dye Life Technologies T-3168 Store small aliquots of 6 mM stock solution at -20 °C in DMSO
Anti-Mouse CD45 APC-eFluor 780 eBioscience 47-0451-80 Clone 30-F11
Anti-Mouse CD71 PerCP-eFluor 710 eBioscience 46-0711-80 Clone R17217
Atto 633 NHS ester Sigma-Aldrich 1464 Atto 633-NHS. Store a 2 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin Thermo Fisher Scientific 21335 Biotin-NHS. Store a 25 mg/ml stock solution at -20 °C in DMF
Streptavidin PE-Cyanine7 eBioscience 25-4317-82 Streptavidin PE-Cy7
Heparin Sigma-Aldrich H478
35 µM filter cap tubes Becton Dickinson 352235
Flow cytometer: BD LSRFortessa Becton Dickinson
Flow cytometer: BD FACSAria II Becton Dickinson
Flow cytometer: BD Influx Becton Dickinson
Flow cytometer: CyAn ADP Analyzer Beckman Coulter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Jacobberger, J. W., Horan, P. K., Hare, J. D. Analysis of malaria parasite-infected blood by flow cytometry. Cytometry. 4, (3), 228-237 (1983).
  2. Bianco, A. E., Battye, F. L., Brown, G. V. Plasmodium falciparum: rapid quantification of parasitemia in fixed malaria cultures by flow cytometry. Exp Parasitol. 62, (2), 275-282 (1986).
  3. Makler, M. T., Lee, L. G., Recktenwald, D. Thiazole orange: a new dye for Plasmodium species analysis. Cytometry. 8, (6), 568-570 (1987).
  4. Heyde, H. C., Elloso, M. M., van de Waa, J., Schell, K., Weidanz, W. P. Use of hydroethidine and flow cytometry to assess the effects of leukocytes on the malarial parasite Plasmodium falciparum. Clin Diagn Lab Immunol. 2, (4), 417-425 (1995).
  5. Pattanapanyasat, K., et al. Culture of malaria parasites in two different red blood cell populations using biotin and flow cytometry. Cytometry. 25, (3), 287-294 (1996).
  6. Grimberg, B. T., Erickson, J. J., Sramkoski, R. M., Jacobberger, J. W., Zimmerman, P. A. Monitoring Plasmodium falciparum growth and development by UV flow cytometry using an optimized Hoechst-thiazole orange staining strategy. Cytometry A. 73, (6), 546-554 (2008).
  7. Theron, M., Hesketh, R. L., Subramanian, S., Rayner, J. C. An adaptable two-color flow cytometric assay to quantitate the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum parasites. Cytometry A. 77, (11), 1067-1074 (2010).
  8. Bei, A. K., et al. A flow cytometry-based assay for measuring invasion of red blood cells by Plasmodium falciparum. Am J Hematol. 85, (4), 234-237 (2010).
  9. Clark, M. A., et al. RBC barcoding allows for the study of erythrocyte population dynamics and P. falciparum merozoite invasion. PLoS One. 9, (7), e101041 (2014).
  10. Malleret, B., et al. A rapid and robust tri-color flow cytometry assay for monitoring malaria parasite development. Sci Rep. 1, (118), (2011).
  11. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Quantitative measurement of Plasmodium-infected erythrocytes in murine models of malaria by flow cytometry using bidimensional assessment of SYTO-16 fluorescence. Cytometry A. 75, (3), 225-235 (2009).
  12. Jimenez-Diaz, M. B., et al. Improvement of detection specificity of Plasmodium-infected murine erythrocytes by flow cytometry using autofluorescence and YOYO-1. Cytometry A. 67, (1), 27-36 (2005).
  13. Jun, G., Lee, J. S., Jung, Y. J., Park, J. W. Quantitative determination of Plasmodium parasitemia by flow cytometry and microscopy. J Korean Med Sci. 27, (10), 1137-1142 (2012).
  14. Lelliott, P. M., Lampkin, S., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. A flow cytometric assay to quantify invasion of red blood cells by rodent Plasmodium parasites in vivo. Malar J. 13, (1), 100 (2014).
  15. Morohashi, K., et al. Structural and functional abnormalities in the spleen of an mFtz-F1 gene-disrupted mouse. Blood. 93, (5), 1586-1594 (1999).
  16. Shet, A. S., et al. Morphological and functional platelet abnormalities in Berkeley sickle cell mice. Blood Cells Mol Dis. 41, (1), 109-118 (2008).
  17. Duraisingh, M. T., et al. Phenotypic variation of Plasmodium falciparum merozoite proteins directs receptor targeting for invasion of human erythrocytes. EMBO J. 22, (5), 1047-1057 (2003).
  18. Okoyeh, J. N., Pillai, C. R., Chitnis, C. E. Plasmodium falciparum field isolates commonly use erythrocyte invasion pathways that are independent of sialic acid residues of glycophorin A. Infect Immun. 67, (11), 5784-5791 (1999).
  19. Dolan, S. A., Miller, L. H., Wellems, T. E. Evidence for a switching mechanism in the invasion of erythrocytes by Plasmodium falciparum. J Clin Invest. 86, (2), 618-624 (1990).
<em>في</em> تقييم <em>فيفو</em> من القوارض <em>المتصورة</em> الطفيل وأقسومة الغزو من قبل التدفق الخلوي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).More

Lelliott, P. M., McMorran, B. J., Foote, S. J., Burgio, G. In Vivo Assessment of Rodent Plasmodium Parasitemia and Merozoite Invasion by Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (98), e52736, doi:10.3791/52736 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter