Mouse Naïve CD4<sup> +</sup> Isolamento T cellulare e<em> In vitro</em> Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari
Summary
Naïve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of naïve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.
Abstract
Antigen inexperienced (naïve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a naïve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during naïve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of naïve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing naïve cells to various T helper effector lineages in vitro.
Introduction
Il concetto di linee o di sottoinsiemi di CD4 + T helper distinti (gi), le cellule è stato intorno dal momento che la seconda metà del 20 ° secolo 1. Riconoscimento dell'antigene cognate in presenza di segnali di costimolazione risultati in vari cicli di proliferazione cellulare e l'eventuale differenziazione in cellule effettrici Th. Il tipo di cellule Th generati durante questo processo dipende sull'ambiente citochina presente durante l'attivazione 2. Inizialmente, le cellule Th naive sono stati pensati per polarizzarsi in 2 linee distinte seguenti recettore delle cellule T (TCR) attivazione, costimolazione CD28 legatura, e la segnalazione di citochine. 1 le cellule helper tipo (Th1) sono caratterizzati dalla loro produzione effettore della citochina IFNγ nonché la loro esigenza di IL-12 di segnalazione durante il processo di differenziazione 3,4. Alla fine si è scoperto che le cellule Th1 differenziate hanno un profilo genetico che è più tipicamente caratterizzata by l'espressione del fattore di trascrizione famiglia scatola T, Tbx21 (T-bet), che è considerato il principale regolatore del programma genetico Th1 5. Inoltre, IL-12 e IFNγ può promuovere espressione T-bet 6,7. Nella risposta immunitaria, le cellule Th1 sono importanti per la difesa contro i patogeni intracellulari e forti promotori di infiammazione autoimmune. In contrasto, cellule helper di tipo 2 (Th2) richiedono IL-4 per il loro sviluppo e le citochine effettrici, tra IL-4, IL-5 e IL-13, sono importanti per guidare le risposte delle cellule B e sono patogeni allergia 8, 9. Simile a cellule Th1, le cellule Th2 sono stati trovati ad esprimere la propria principale regolatore trascrizionale, chiamato GATA-3 10,11. È interessante notare la presenza di citochine polarizzanti e la generazione di una specifica linea Th sono antagonisti allo sviluppo di altri 2,12, suggerendo che solo un particolare sottoinsieme Th può diventare dominante durante un re immunitariorisposta.
Poiché l'identificazione delle linee Th1 e Th2, ulteriore lavoro ha dimostrato ancora più unica sottogruppi di cellule T helper, incluse follicolare helper (TFH), IL-9-produzione (Th9), e IL-22-produzione (Th22) (recentemente rivisto in 13). Ai fini di esperimenti di differenziazione in vitro, questo protocollo si concentrerà solo su due sottoinsiemi gi altri, chiamati cellule T regolatorie (Treg) e-17-producono IL cellule CD4 + T (Th17). Cellule T regolatrici CD25 + possono verificarsi in natura (nTreg) nel timo; cellule Th naïve possono anche essere indotti (iTreg) per diventare normativa in periferia (rivisto in 14,15). Entrambi i tipi di Tregs esprimono un fattore di trascrizione caratteristico, definito scatola forkhead P3 (Foxp3), che è critica per i loro meccanismi di soppressione effettori che includono la produzione solubili anti-infiammatori mediatore, IL-2 consumo, e delle cellule meccanismi contatto-dipendente 14,15. La mancanza di Foxp3 risultati espressione di una grave, multiorgano malattia autoimmune chiamati disregolazione immunitaria, poliendocrinopatia, enteropatia, la sindrome X-linked (IPEX), dimostrando il ruolo critico di questo sottoinsieme Th nel risolvere l'infiammazione e regolazione tolleranza periferica di auto antigeni 16. In vitro, le cellule helper CD4 + T naive up-regolano Foxp3 e diventare impegnati nel programma Treg dopo stimolazione con IL-2 e TGF-β 14,15. Ci possono essere da moderata a notevole plasticità in linee cellulari T CD4 +, soprattutto se si considera solo la produzione di citochine (rivisto in 17,18). Tuttavia, ai fini di protocolli di differenziamento in vitro, discuteremo ogni sottoinsieme come un lignaggio unico.
Recentemente, un sottogruppo di cellule Th17 che produce la citochina IL-17 è stato identificato come un lignaggio unico con funzioni pro-infiammatorie che sono particolarmente patogeni durante l'infiammazione autoimmune 19-21. Cellule Th17 esprimono un fattore di trascrizione unico, chiamato retinoidi legati orfano recettore gamma t (RORγt) che coordina il programma genetico Th17 22. TGFβ è importante per la generazione di Th17 lineage attraverso l'induzione di RORγt. Tuttavia, l'effetto di segnalazione TGFβ è creduto per indurre unico impegno Th17 su synergizing con IL-6 (valutata in 12). Ulteriori studi hanno dimostrato che una varietà di altri segnali che possono regolare positivamente impegno Th17, comprese IL-1β, aumento del sodio, e TLR segnalazione 23-26. Altri studi hanno suggerito che i patogeni cellule Th17 in vivo sono quelli che ignorano di fatto la segnalazione TGFβ e invece si basano su una combinazione di IL-1, IL-6 e IL-23 per la loro differenziazione 27. Così, le cellule Th17 possono essere ricavati da una varietà di vie di segnalazione; ai fini del presente protocollo, comunemente usato il (TGFβ e IL-6), percorso per Th17 lineage impegnosarà presentato.
I protocolli di differenziazione descritti di seguito per tutti i lignaggi effettrici si basa su anticorpi fisso come stimoli per il TCR e CD28 durante l'intero corso dell'esperimento. Tuttavia, altri hanno dimostrato che l'attivazione TCR con l'antigene cellule presentanti l'28 o cross-linking anti-CD3 e anti-CD28 con anticorpi criceto per 2 giorni 29 sono anche mezzo altamente efficace per indurre la generazione di vari sottoinsiemi Th. Il protocollo presentato qui si basa su metodi precedentemente segnalati per isolare le cellule CD4 + T murine da organi linfoidi secondari 30 e la generazione di cellule Th17 31. Una differenza importante è che questo protocollo si basa sull'utilizzo di un cell sorter isolare le cellule CD4 + T naive dai tessuti linfoidi. Tuttavia, molte aziende offrono ora i kit di separazione rapidi che possono arricchire le cellule T CD4 + naïve, che può essere in grado di bypassare il requisito fo l'ordinamento seconda dell'esperimento. I metodi e reagenti presentati in questo protocollo sono ciò che abitualmente usiamo e troviamo per essere il più efficace. Tuttavia, tenere presente che esistono reagenti e metodi alternativi per molti dei passi presentati di seguito e spetta al laboratorio individuo per determinare che cosa funziona meglio per i loro scopi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mentre la milza contiene cellule Th naïve, la percentuale di questa popolazione in linfonodi è molto più alta. La mancata corretta identificazione e rimozione dei linfonodi in questo protocollo si tradurrà in una scarsa resa di cellule naïve. Questo può essere particolarmente difficile in topi di età superiore o topi maschi che hanno più tessuto grasso. Come mostrato in Figura 1, fissaggio e spinatura corretta degli arti animali e la pelle consentirà di facilitare la visualizzazione dei linfono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desiderano ringraziare tutti i membri del laboratorio di Reynolds a Rosalind Franklin University of Medicine and Science, e il laboratorio di Chen Dong presso l'Università del Texas MD Anderson Cancer Center per l'ottimizzazione di questo protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione per JMR dal National Institutes of Health (K22AI104941).
Materials
| Complete RPMI: | Warm in a 37 oC water bath before use | ||
| RPMI 1640 Media | Life Technologies | 11875119 | |
| 10 % FBS | Life Technologies | 26140-079 | |
| 1000X 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| 100X Pen/Strep | Life Technologies | 15140122 | |
| 100X L-glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| 120 micron nylon mesh | Amazon | CMN-0120-10YD | Cut into 2 cm2 squares and autoclave |
| Alternative: 100 micron cell strainers | Fisher | 08-771-19 | Alternative to cutting nylon mesh |
| autoMACS running buffer | Miltenyi | 130-091-221 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| autoMACS rinsing solution | Miltenyi | 130-091-222 | Warm in a 37 oC water bath before use |
| CD4 beads | Miltenyi | 130-049-201 | |
| ACK lysis buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| Cytokines: | |||
| Human (h) IL-2 | Peprotech | 200-02 | |
| Recombinant mouse (rm) IL-4 | Peprotech | 214-14 | |
| rmIL-6 | R & D Systems | 406-ML-025 | |
| rmIL-12 | Peprotech | 210-12 | |
| hTGFb | R & D Systems | 240-B-010 | |
| Antibodies: | |||
| 2C11 (anti-CD3) | BioXcell | BE0001-1 | |
| 37.51 (anti-CD28) | BioXcell | BE0015-1 | |
| 11B11 (anti-IL-4) | BioXcell | BE0045 | |
| XMG1.2 (anti-IFNg) | BioXcell | BE0055 | |
| anti-CD62L-FITC | BioLegend | 104406 | Use at 1:100 |
| anti-CD25-PE | BioLegend | 102008 | Use at 1:400 |
| anti-CD4-PerCP | BioLegend | 100434 | Use at 1:1000 |
| anti-CD44-APC | BioLegend | 103012 | Use at 1:500 |
| Phorbol 12-myristate 13 acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P-8139 | Prepare a stock at 0.1 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I-0634 | Prepare a stock at 0.5 mg/ml in DMSO and freeze aliquots at -20 oC |
| Brefeldin A | eBioscience | 00-4506-51 | Use at 1:1000 |
References
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