Abstract
Neben etablierten Verfahren wie Western Blot, werden neue Verfahren benötigt wird, um schnell und leicht in experimentellen Modellen der Synucleopathien quantifizieren Krankheit assoziierten α-Synuclein (aS D). Eine transgene Mauslinie (M83) Überexpression des menschlichen A53T aS und spontan die Entwicklung einer dramatischen klinischen Phänotyp zwischen acht und 22 Monate alt sind, gekennzeichnet durch Symptome wie Gewichtsverlust, Erschöpfung, und schwere motorische Einschränkungen, wurde in dieser Studie verwendet. Für die molekulare Analyse von & alpha; S D (krankheitsassoziierten aS) in diesen Mäusen ein ELISA wurde entwickelt, um spezifisch zu quantifizieren aS D in kranken Mäusen. Analyse des Zentralnervensystems in diesem Mausmodell zeigte die Anwesenheit von & alpha; S D hauptsächlich in den kaudalen Hirnregionen und des Rückenmarks. Es gab keine Unterschiede in der & alpha; S D Verteilung zwischen verschiedenen experimentellen Bedingungen, die zu einer klinischen Erkrankung, dh in uninoculATED und normal alternden transgenen Mäusen und bei Mäusen mit Gehirnextrakten von kranken Mäusen eingeimpft. Der spezifische Nachweis von & alpha; S D Immunreaktivität unter Verwendung eines Antikörpers gegen Ser129 phosphoryliert aS durch ELISA im wesentlichen mit der durch Western-Blot und Immunhistochemie erhalten korreliert. Unerwarteterweise wurden ähnliche Ergebnisse mit mehreren anderen Antikörpern gegen den C-terminalen Teil des & alpha; S beobachtet. Die Ausbreitung von aS D, was auf die Beteiligung eines "Prion-ähnlichen" -Mechanismus kann somit leicht überprüft und in diesem Mausmodell unter Verwendung eines ELISA-Ansatz quantifiziert werden.
Protocol
Alle Verfahren und Protokolle mit Tieren waren nach EG-Richtlinie 86/609 / EWG und nach kommt, der Französisch Nationalkomitee für die Prüfung der Ethik in der Tierversuche (Protokoll 11-0043) ratifiziert. Die Tiere wurden untergebracht und versorgt in ANSES genehmigt Versuchsanlagen in Lyon (Genehmigung B 69387 0801).
1. Herstellung der Mäuse
- Euthanize Mäuse durch eine intraperitoneale Injektion von letalen Dosis von Natrium-Pentobarbital.
- Rufen Sie die gesamte Gehirn aus dem Schädel der Maus und legen Sie sie in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale auf Eis bis zur Extraktion.
- Extrahieren Sie das Halsmark.
HINWEIS: Extract aS entweder von einem der Gehirnhälften nach sagittalen Schnitte oder seziert Gehirn der Maus, erhältlich nach den in Tabelle 1 aufgeführten Experimente.
| Experiment | Mice Inokulum (Hirn-Äquivalent) | Überlebenszeit (Dpi) | Median / maximale Überlebens (Tage alt) | aS d Nachweis durch ELISA / WB / IHC |
| 1 | Ungeimpften Mäusen | 441 ± 166 | 419/736 | 8/8 |
| 2 | Inokulierten Mäusen (0,2 mg) | 150 ± 52 | 140/241 | 9/9 |
Tabelle 1. Liste der Experimente an M83 Mäusen durchgeführt. Die Impfungen wurden nach 6 Wochen bei Versuch 2 im striato kortikalen Bereich mit 20 ul eines Gehirnhomogenisat eines kranken Maus (1% G / V in 5% Glucose) nach durchgeführt wird, Anästhesie von 6 Wochen alt homozygote Mäuse M83 um 3% Isofluran Einatmen. dpi: Tage nach inoculation.
2. aS Extraktion von Gehirnhälften
- Sagittal geschnitten das Gehirn zwei Hälften zu erhalten. Wiegen Sie jede Hälfte in einem ribolysis Röhrchen mit Mahlkugeln.
- Vorbereitung High Salt (HS) Puffer, der 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 750 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% Phosphatase und Protease-Inhibitor-Cocktails. Hinzuzufügen Hochsalzpuffer zu den Gehirnhälften bis 20% (Gewicht / Volumen) Homogenate erhalten.
- Vorbereitung der Proben aus den Gehirnhälften unter Verwendung eines mechanischen Homogenisators bei 6,0 m / s für 23 s zweimal. Nach der ersten 23 sec Homogenisierung, legen Sie die Röhrchen mit den Homogenaten auf Eis für 2 min vor der zweiten 23-sec-Zyklus.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g für 5 min auf ungeschliffenen Gehirnteilen zu beseitigen. Wiederherstellen der Überstände, teilen sich in 200 ul Aliquots und halten sie bei -80 ° C für die anschließende ELISA-Analyse.
3. aS Extraktion aus Dissected Hirnregionen
- Sezieren eingesamte Gehirn in einem 35 mm Kunststoff-Petrischale auf Eis mit einem geringen Stromlupe (8-fache Vergrößerung) mit Hilfe von zwei forcipes deren Enden zusammen, außer wenn der Zerlegung des Hippocampus gehalten. 10 Minuten dürfen nicht überschritten werden, um Gehirn Integrität zu bewahren. Legen Sie das Gehirn wieder richtig herum und rufen Sie die folgende Gehirnregionen in dieser Reihenfolge:
- Getrennten der zwei Riechkolben mit einer Pinzette gerade hinter der Lampe angeordnet. Nehmen Sie es aus dem Gehirn durch eine Abwärtsbewegung. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Lampe.
- Gently Keil in die Zange zwischen den beiden Cortex und verschieben Sie es nach vorne, um die Dissoziation der beiden Cortex erleichtern. Halten das Gehirn in Platz mit einer Pinzette, verwenden Sie eine andere, um die Rinde aus dem Hippocampus zu trennen.
- Positionieren Sie die Pinzette 2 mm unterhalb der Hirnrinde. Aufrechterhaltung eines leichten Druck an der Zange, bis die Oberseite des Hippokampus sichtbar ist. Ziehen Sie weg der erste Teil des Kortex, und wiederholen Sie mit dem zweiten Teil. Verwenden Sie die Pinzette, um die beiden zu trennen Cortexab Hippocampus und Bewegung in Richtung der Vorderseite des Gehirns.
- Positionieren Sie die offene Zange um einen der hippocampi. Schließen Sie die Zange an der Unterseite des Hippocampus dann nehmen Sie es vorsichtig, Wiederherstellung so weit wie möglich. Wiederholen Sie den Vorgang für die zweite Hippocampus.
- Positionieren Sie die offene Zange unterhalb einer der striata und sanft trennen sie vom Gehirn. Verwenden Sie die Pinzette, um alle verbleibenden Kortex aus dem Striatum zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die zweite Striatum.
- Mithilfe der Pinzette vorsichtig betätigen um 2 mm die Kontur des Kleinhirns, um eine Trennung des Kleinhirns aus dem Gehirn zu erleichtern. Legen Sie die Pinzette gerade hinter dem Kleinhirn und entfernen Sie sie, indem Sie die Pinzette nach vorn.
- Verwenden Sie den breiten Teil der Zange, um das Mittelhirn, um zu erhöhen, klar zu sehen, wo es den Hirnstamm verbindet. Stellen Sie eine vertikale Inzision an der Kreuzung entfernen Sie dann die Hirnstamm.
- Positionieren Sie die Zange hinter dem Mittelhirn, die ichs von vier abgerundeten Strukturen. Einzuschneiden vertikal, bis der Mittelhirn wurde vollständig vom übrigen Gehirn abgetrennt.
- Vorbereitung Homogenaten variable% (Gewicht / Volumen) in HS Puffer, abhängig von der Menge des verfügbaren Geweben, also 5% Homogenat für ein Gewicht zwischen 10 und 30 mg, 10% für ein Gewicht zwischen 30 und 80 mg, 20% für ein Gewicht von über 80 mg.
- Fügen Sie ein ausreichendes Volumen von HS-Puffer zu den seziert Hirnregionen, um die erwartete% Homogenat zu erhalten.
- Vortex und überprüfen Sie, dass die Gewebe sind vollständig in der HS-Puffer eingetaucht.
- Homogenisieren Proben aus den seziert Hirnregionen oder Halsmark mit einer Gewebemühle aus einem Borosilikatglas Rohr und zwei Stößel, A und B zusammengesetzt ist vorbereitet
- Pour jede Gehirnregion, direkt in das Rohr gequetscht werden. Legen Stößel A in das Rohr und zurückgezogen werden. Wiederholen Sie diese Bewegung etwa zehnmal, um das Gewebe zu distanzieren. Dann nutzen Stößel B um continue Mahlen des Gewebes mit weiteren 20 Bewegungen. Übertragen Sie die Homogenate in ein 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml Transferpipette.
- Zentrifugieren Sie die Probe bei 1000 × g für 5 min bei 4 ° C, um alle ungemahlenen Gehirnteilen zu beseitigen. Rufen Sie die Überstände, unterteilen Sie diese in 200 ul Aliquots und halten sie bei -80 ° C für die anschließende ELISA-Analyse.
4. Erkennung von aS durch ELISA
- Verdünnt den Beschichtungsantikörper zu 0,01 ng / ml. Entweder anti-aS Kaninchen polyklonale oder monoklonale Antikörper Klon 42 in 50 mM Na 2 CO 3 / NaHCO 3 (pH 9,6).
- Bestreichen Sie die 96-Well-Mikroplatten mit 100 ul pro Vertiefung dieser Beschichtungslösung, und lassen Sie bei 4 ° CO / N. Verwenden Sie die Anti-aS polyklonalen Kaninchen-Antikörper, der in der Beschichtungslösung für ELISAs mit Detektionsantikörper syn514, Klon 42, LB509, AS11, 4D6 oder 8A5. Verwenden des Anti aS monoklonale Antikörper Klon 42 als Beschichtungslösungin Kombination mit der anti-pSer129 aS Nachweisantikörper.
HINWEIS: Wenn nötig, können die Platten bei 4 ° C für eine Woche vor dem ELISA aufbewahrt werden ausgeführt. - Verwenden Sie einen Plattenwäscher, um die Platten fünfmal mit 300 ul phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit 0,05% Tween 20 (PBST) pro Vertiefung waschen. Von diesem Schritt an ist Inkubation bei RT.
- Fügen Sie 200 ul PBS T20 Blockierungspuffer pro Vertiefung. Es wird 1 h bei 150 Upm. Fünfmal mit PBST, waschen.
- Verdünnen Sie die Hirnhomogenaten (Verdünnung 1: 100 der 20% Homogenate, 1.50 der 10% Homogenate und 1.25 der 5% Homogenate in PBST BSA 1%), und fügen Sie 100 ul in jede Vertiefung. Dann inkubieren für 2 Stunden unter Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute. Fünfmal mit PBST, waschen.
- Fügen Sie die verschiedenen aS Nachweis-Antikörper in PBST mit BSA 1% an den in der Materialliste genannten Verdünnungen. Inkubieren für 1 h bei 150 Upm. Fünfmal mit PBST, waschen.
- Fügen Sie entweder Anti-Maus oder Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Konjugate, verdünnt 1: 8.000 in PBST mit 1% BSA für 1 h ergänzt unter Schütteln bei 150 UpM. Fünfmal mit PBST, waschen.
- 100 l 3,3 ', 5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) in jede Vertiefung und Inkubation für 15 min im Dunkeln unter Schütteln bei 150 Umdrehungen pro Minute.
- Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 100 ul 1 N HCl pro Vertiefung messen Sie dann die Absorption bei 450 nm mit der Mikroplatten-Reader.
- Für die Datenanalyse, subtrahieren Sie die in einem gut mit allen Reagenzien, außer irgend Maus Hirnproben (leere well) aus den für jede der untersuchten Proben gemessenen OD-Werte erhaltenen OD-Wert.
5. Epitopkartierung
- Zuführen Epitopkartierung nach der von Osman 16 beschriebenen Verfahrens. Kurz gesagt, spot Peptide des menschlichen α-Synuclein-Sequenz mit 12 Aminosäuren auf Nitrocellulose mit 10 überlappenden Aminosäuren.
- Blockieren mit 50 mM Tris / 150 mM NaCl-Puffer pH 10, das 0,05% Tween 20 und 5% Milchpulver. Inkubieren des Antikörpers in der Blockierungslösung bei einer Konzentration von 2 ug Antikörper pro ml bei 2-10 ° CO / N.
- Dreimal mit 50 mM Tris / 150 mM NaCl-Puffer, pH 10, enthaltend 0,05% Tween 20 Inkubation mit Ziege-Anti-Maus-IgG-HRP-Konjugat Waschen der Membran. Die Membran noch fünf Mal mit dem gleichen Puffer dann Fleck mit einem Western-Blot-TMB Färbekit waschen.
6. Statistische Analyse
- Verwenden Sie die R-Software und nlme Paket zu Mixed-Effects-Regressionen durchführen, um OD modellieren. Für jeden Vergleich, führen Sie eine gemischte Wirkung Regressionsmodell. Verwenden Sie eine feste Wirkung auf eine symptomatische von asymptomatischen Gruppen zu unterscheiden.
- Verwenden Sie ein Zufallseffekt, um die Variabilität der Wiederholungen für eine bestimmte Maus anzupassen. Überprüfen homoscedasticity durch die Untersuchung der Residuen und, wenn nötig, verwenden Sie die Varianz Funktionen, um die Varianz Struktur innerhalb der Gruppe von Fehlern in Einklang mit Pinheiro und Bates 1 zu modellieren7. Legen Sie 0,05 als Signifikanzschwelle von P.
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Representative Results
In dieser Studie verwendeten ELISAs spezifisch identifizierten Krankheit assoziierten & alpha; S (& alpha; S D) in Hirnhomogenaten in einem Hochsalzpuffer von kranken M83 Mäusen hergestellt. Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch pSer129 aS (p = 0,0074), der ELISA leicht unterscheidet alte, kranke Mäuse (> 8 Monate alt) von jungen (2-5 Monate), M83 gesunden Mäusen (Abbildung 1). Mehrere andere Antikörper zeigten ähnlich hohe Signale (> 0,6 OD) nur in Hirnhomogenaten von kranken Mäusen. Dies ist der Fall für 4D6 (p = 0,01), LB509 (p = 0,0047) und 8A5 (p <0,001), die gegen verschiedene Sequenzen der C-terminalen Teil des Proteins (124-134, 115-122 und 129-140 jeweils) und, in einem viel geringeren Ausmaß, syn514 gegen das N-terminale Ende (2-12) des Proteins (p = 0,0003). Darüber hinaus die AS11 monoklonalen Antikörper im Labor gegen Menschen fibrillar rekombinanten & agr; S 18 nach der Immunisierung von C57BL / 6S (B6 aS-null) 19 hergestelltMäuse mit einer Deletion der α-syn-Locus zeigte ähnlich hohen Signale (p <0,01) nur in Hirnhomogenaten von erkrankten Mäusen. Dieser Antikörper wurde nun gezeigt, dass die Aminosäuresequenz (P) VDPDNEAY (E) & alpha; S zu erkennen, die der 118-125-Sequenz des menschlichen α-Synuclein.
Dagegen unter diesen experimentellen Bedingungen Analysen von Hirnhomogenaten mit dem Klon 42 gegen einen zentralen Bereich des α-Synuclein (91-96 Sequenz) Direkter Nachweis-Antikörper, zeigte eine sehr niedrige Signal sowohl kranken und gesunden M83 Mäusen. Es konnte nicht zwischen den zwei Populationen von Mäusen (p = 0,1158). Junge M83 Mäuse zeigten jedoch eine höhere Immunreaktivität als habe nicht transgenen Mäusen B6C3H (M83 genetischen Hintergrund Linie). Der Kontrast war noch größer mit C57BL / 6S (B6 aS-null) Mäusen, die eine gelöschte α-syn-Locus haben. Dies deutet darauf hin, dass die geringe Immunreaktivität in M83 Mäusen entspricht niedrigen Signalerfassung der normalen aS. Die analytical Empfindlichkeit dieses ELISA war im Vergleich zu einem beurteilt zuvor beschriebenen Western-Blot-Verfahren 4 zum Nachweis von unlöslichen Ser129 phosphoryliert α-Synuclein, durch Prüfen, unter Verwendung sowohl ELISA und Western-Blot-Verfahren, serielle Verdünnungen von Hirnhomogenaten von demselben kranken M83 hergestellt Mausgehirn (Abbildung 2). Ungefähre 10 ug Gehirn Mittel ausreichen, um ein positives Signal für die ELISA Hirnhomogenat von diesem kranken Maus zu erreichen, sowohl mit LB509 und PSer129 Antikörper. Im Gegenteil wurden mindestens 200 ug Gehirn Äquivalente benötigt pSer129 aS in der Sarkosyl-unlösliche Fraktion durch Western-Blot mit dem gleichen Antikörper PSer129 15 analysiert detektieren. Dies zeigt an, dass der ELISA hat eine analytische Sensitivität etwa 20-fache der Western-Blot-Verfahren.
Bei kranken und alten M83-Mäuse (3A), Hirnhomogenaten aus dem Mittelhirn, Hirnstamm und Rückenmark sho wed markiert Immunreaktivität sowohl mit LB509 und PSer129 Antikörper im ELISA. Es wurde jedoch keine nachweisbare Immunreaktivität in anderen Gehirnregionen beobachtet, einschließlich des Riechkolbens, Großhirnrinde, Striatum, Hippocampus, Thalamus und Hypothalamus. Der ELISA gab ein schwaches Signal für das Kleinhirn. Die Immunreaktivität in den verschiedenen Regionen des Gehirns von M83-Mäuse entwickeln eine beschleunigte klinischen Erkrankung im Anschluss an die Injektion eines Hirnextrakt von einem kranken M83 Maus 4 (3B) nicht zu unterscheiden war von der in Alter (> 8 Monate alt) nicht inokulierten M83 Mäusen beobachtet. Diese Ergebnisse stimmen mit den durch Western blot (3C) und Immunhistochemie 15 erzielt wurden, die eine viel größere Abscheidung von Ser129 α-Synuclein in den caudalen Regionen des Gehirns und des Rückenmarks.
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Abbildung 1. ELISA Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein (aS D) ganz Hirnhomogenaten von M83 Mäusen. Der ELISA Kombinieren Kaninchen-anti-aS polyklonalen (Beschichtung) mit syn514, LB509, AS11, 4D6, 8A5 (Detektion) oder Klon 42 (Beschichtung) mit Anti-pSer129 aS (PSer129) (Detektion) Antikörpern unterscheiden kranken Mäusen von gesunden M83 Mäusen wohin ELISA mit anti-aS polyklonalen Kaninchen (Beschichtung) / clone42 (Detektion) nicht. Die sechs Kranken, alten M83-Mäuse von 11 bis 16 Monate alten zeigte Anzeichen von Immunreaktivität mit den anti α-syn-Antikörper (mit Ausnahme von Klon 42-Antikörper). Dies war nicht der Fall für entweder den sechs jungen, gesunden Mäusen 2-5 Monate alt Alter, oder mit den zusätzlichen Kontrollen einschließlich B6C3H (genetischen Hintergrund der M83-Mäuse) oder B6 aS-null-Mäuse. Die Fehlerbalken stellen SD Geändert von Bétemps 15.
Figur 2. Vergleich der analytischen Sensitivität des Nachweises von & alpha; S D durch ELISA und Western-Blot. A. Ein positives Signal wurde mit ELISA auf 12,5 ug Gehirn Äquivalente sowohl LB509 und PSer129 Antikörper von zweifachen Verdünnungen von Hirnhomogenaten von einem Kranken erhalten Maus. Die geschätzte Cutoff-Ebene für die Unterscheidung von kranken und gesunden Mäusen, die den von Proben von gesunden M83 Mäusen während drei Minuten vor sechs Wiederholungen von ELISA Maßnahmen + 3 Standardabweichungen erhalten Mittel, waren 0,030 und 0,020 für LB509 und PSer129 Nachweisantikörper bzw. . Sie werden als eine Zeile in der gleichen Farbe wie diejenige für jeden der Antikörper verwendet wird. B. durch Western-Blot-Analyse der unlöslichen Fraktionen nach Ultrazentrifugation in die Präsentation erhaltence von Sarkosyl, wurden 200 ug Gehirn Mittel benötigt, um mit der gleichen PSer129 Antikörper nachzuweisen aS D. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind auf der linken Seite des Blots gekennzeichnet. Mit freundlicher Genehmigung von Bétemps 15 abgedruckt.
Fig. 3 Nachweis von krankheitsassoziierten α-Synuclein (aS D) in verschiedenen Gehirnregionen von M83-Mäuse mittels ELISA und Western-Blot. ELISA identifiziert aS D mit PSer129 oder LB509 Nachweisantikörper in M83 Mäusen während der normalen Alterung (A) (n = 1, 4 Wiederholungen, Mittelwert ± SD) oder nach der Inokulation von 6 Wochen alten Mäusen M83 mit einem Hirnhomogenisat aus einem kranken M83 ( B) (n = 1, 4 Wiederholungen, Mittelwert ± SD). (C) & alpha; S D durch W identifiziertenestern tupfen mit dem Nachweisantikörper PSer129 EP1536Y in den gleichen neuro-anatomische Regionen in Mäusen mit einem Hirnhomogenat von einem kranken M83 Maus eingeimpft. Molekulargewichtsmarker (in kDa) sind auf der linken Seite der Platte C. Gleiche Mengen an Gesamt-Proteine wurden in jeder Zeile für äquivalente Belastung verwendeten Gels angegeben. Die folgenden acht neuro-anatomische Bereiche von kranken M83 Mäusen getestet: OB: olfaktorische Birne, Cx: Großhirnrinde, Hallo: Hippocampus, St: Striatum, Me: Mittelhirn, Cb: Kleinhirn, BS: Hirnstamm, SC: Halsmark . Geändert von Bétemps 15.
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Discussion
Die Verwendung eines ELISA wurde gezeigt, spezifisch nachzuweisen aS D direkt von Maushirn-Homogenaten bei der Krankheit in den M83 transgenes Mausmodell. In der Tat, könnte dies ohne weiteres zu unterscheiden ELISA kranken Mäusen M83 M83 von gesunden Mäusen mit nur ganze Hirnhomogenaten in Hochsalzpuffer.
Die wichtigsten Schritte für eine erfolgreiche Ergebnisse mit diesen ELISA sind: richtig sezieren die verschiedenen Regionen der Maus-Gehirne von der Entwicklung der notwendigen Fingerfertigkeit, um Schäden bei der Präparation zu verhindern; Durchführung Probenverdünnungen ausschließlich in HS-Puffer; und die Auswahl von Antikörpern, da nicht alle Antikörper in einem ELISA-Format zu arbeiten.
Einige Variabilität in aS-D-Spiegel war dennoch offensichtlich zwischen verschiedenen Mäusen. Diese Ergebnisse sind gleichbedeutend mit der Western-Blot-Nachweis des typischen aS D Muster nur in kranken M83 Mäusen nachgewiesen durch Untersuchung des sarkosyl unlösliche Anteile nach der Erfassung mit einem Antikörper gegen Ser129 phosphoryliert aS 15. Dies zeigt, dass ELISA-Immunreaktivität entspricht den spezifischen Nachweis von & alpha; S D.
In Übereinstimmung mit früheren Western-Blot-Analysen 15, erfasst diese ELISA-Immunreaktivität nach der Sektion des Gehirns von kranken M83 Mäuse in den kaudalen Teile des Gehirns, dh, Mittelhirn und Hirnstamm sowie im Halsmark. Keine Immunreaktivität im Riechkolben, Großhirnrinde, Striatum oder des Hippocampus, in Übereinstimmung mit früheren Daten, die anzeigen, dass der Hippocampus wurde von pathologischen Prozesses 6 im Falle von Mäusen, die durch Fibrillen alpha beimpft verschont, außer in sehr geringen Mengen nachgewiesen -synuclein in den Hippocampus 15. Die Verteilung der aS D erschien so bemerkenswert einheitlich insgesamt, unabhängig von der experimentellen Bedingungen, die included entweder normale Alterung von Mäusen oder beschleunigte Entwicklung der Krankheit nach intrazerebraler Inokulation von Hirnhomogenaten von kranken M83 Mäusen.
Darüber hinaus ist die Assayleistung besser als die zuvor beschriebenen Western-Blot-Methode. Die analytische Sensitivität des ELISA erschienen höher, wie von der Nachweisgrenze unter Verwendung von seriellen Verdünnungen einer Hirnhomogenisat aus einem kranken M83 Maus (12,5 ug für ELISA vs 200 ug für die Western-Blot-Assay) in diesem Test erhaltenen gezeigt. Die Empfindlichkeit des ELISA blieb jedoch geringer als die von immunhistochemischen Nachweis, die & alpha; S D in den einzelnen Zellen und in Frontalhirnregionen detektiert, wie der Großhirnrinde 15. Die Empfindlichkeit des Tests kann jedoch weiter durch die Verwendung verschiedener Antikörper und / oder optimierten Erkennungssystemen wie Chemilumineszenznachweis wie zuvor beschrieben 13 verbessert werden.
Es ist wichtigfestzustellen, dass verschiedene andere Antikörper, die andere Formen des Proteins, und insbesondere ein nicht-phosphorylierten Form (mit dem 4D6 monoklonalen Antikörper 20 erkannt) ergab ähnliche Ergebnisse mit diesen ELISA, zusätzlich zu dem monoklonalen Antikörper, der spezifisch pSer129 aS. Dieser ELISA Ansatz zeigte auch Immunreaktivität mit Antikörpern, die spezifisch menschliche aS (LB509) und bis zu einem viel geringeren Ausmaß, Maus aS (D37A6) in den gleichen kranken Tieren und / oder Hirnregionen von kranken Mäusen 15. Auf der anderen Seite wurde keine Immunreaktivität mit der ELISA-Analyse von kranken Mäusen unter Verwendung des M83-Klon 42-Antikörper gegen einen mittleren Bereich der & alpha; S (91-96) beobachtet 21,22, was einem Epitop, das unter diesen Bedingungen ELISA kryptischen sein könnte. Dieser ELISA-Format könnte in M83 Maushirnen sowohl Ser129 phosphoryliert aS erkennen, wie durch Foulds 11 in menschlichem Plasma beobachtet und nicht phosphorylierte, gegebenenfalls oligomere Formen, wie in Humein Plasma und Zerebrospinalflüssigkeit 12,14. Im Gegensatz zu früher veröffentlichten ELISAs, unsere ELISA-Format nicht verwendet den gleichen Antikörper in Erfassung und Erkennung, die oligomere Form von aS erkennen, noch Antikörper bekannt Konformationsänderungen zu sein, wie die in Unterberger Studien verwendet 5G4-Antikörper.
Anders als bei der Western-Blot-Verfahren verwendet werden, um die zuvor in Hirnhomogenaten von M83 4-Mäuse erkennen aS D hat die ELISA keine Konzentrationsschritt erfordern, wie beispielsweise durch Ultrazentrifugation mit Sarkosyl, um die krankheitsassoziierten Protein 23 zu erkennen. Krankheitsassoziierten aS wurde zuvor in M83 Mäusen durch sequentielle Extraktion unter Verwendung von Puffern von zunehmender Stärke 2,6 identifiziert. Von einem praktischen Standpunkt aus, speichert diese quantitativen Assay erhebliche Zeit und Reagenzien im Vergleich zu den Western-Blot Verfahrens.
In dieser Studie, machte detaillierte aS molekulare Analysen unter Verwendung eines ELISA-Ansatz es möglich,leicht zu quantifizieren Immunreaktivität mit verschiedenen Antikörpern in kranken Mäusen M83. Sie könnte Licht auf die molekularen Mechanismen in aS Aggregation während Synucleinopathien aus quantitativer Sicht beteiligt zu vergießen. Dieser ELISA Ansatz könnte daher die Basis für eine schnelle und einfache Werkzeug, um in verschiedenen biologischen Proben mit einem zuverlässigen Marker für die Pathologie, wie Ser129 phosphoryliert aS die Foulds 11 glaubt, zeigt mehr versprechen als diagnostischer Marker als der nicht phosphorylierten erkennen aS D Protein. Kürzlich wies er darauf hin, dass Maßnahmen des Gesamt aS oder möglicherweise von nicht phosphorylierten aS könnte als Surrogat-Marker für die Progression der Erkrankung in PD verwendet werden, da das Niveau der Gesamt aS neigt nach dem Auftreten der ersten Symptome 24 im Laufe der Zeit zu erhöhen .
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Damien Gaillard für Impfungen danken und Follow-up von Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von ANSES (Französisch Agentur für Lebensmittel, Umwelt- und Arbeitsschutz) und durch einen Zuschuss von der Stiftung France Parkinson unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LB509 | Abcam | ab27766 | Detection antibody 1/2,000 |
| AS11 | Produced at Anses | Detection antibody 1/1,000 | |
| 4D6 | Abcam | ab1903 | Detection antibody 1/2,000 |
| PSer129 | Abcam | ab59264 | Detection antibody 1/3,000 |
| PSer129 EP1536Y | Abcam | ab51253 | Detection antibody 1/1,000 |
| syn514 | Abcam | ab24717 | Detection antibody 1/500 |
| clone 42 | BD Biosciences | 610787 | Coating and detection antibody (1/2,000) |
| 8A5 | Provided by Dr. Anderson | Detection antibody 1/2,000 | |
| polyclonal anti-αsyn antibody | Millipore | AB5038P | Coating antibody |
| Anti-mouse IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 1010-05 | |
| Anti-rabbit IgG HRP conjugate | Southern Biotech | 4010-05 | |
| Goat anti-mouse IgG HRP conjugate | Dianova | 115-035-164 | |
| HS buffer | Adjust at pH 7.5 and keep at 4 °C | ||
|
Euromedex | 26-128-3094-B | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | EU0007-B | |
|
Sigma | 43815 | |
| PBS | Adjust at pH 7.5 | ||
|
Euromedex | 1309 | |
|
Euromedex | 2018 | |
|
Euromedex | 1112-A | |
|
Euromedex | P017 | |
| Tween 20 | Euromedex | 2001-C | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| DTT 1 mM | Sigma | 43815 | Stock solution 100 mM, toxic |
| 1% phosphatase cocktail | Pierce | 78428 | |
| 1% protease inhibitor cocktail | Roche | 04 693 132 001 | 50x concentrated |
| Microplate MaxiSorpTM | Thermo Scientific | 442404 | |
| Tampon carbonate 50 mM pH 9.6 | |||
|
Sigma | 71360 | 2.86 g/L |
|
Merk | 6329 | 3.36 g/L, pH 9.6 |
| Superblock T20 PBS blocking buffer | Pierce | E6423H | 10x concentrated |
| TMB | Sigma | T0440 | Used for ELISA |
| TMB | Analytik Jena AG | 847-0104200302 | Used for epitope mapping |
| HCl 1 N | Chimie plus | 40030 | |
| Ribolyser | Thermo | Fast prep FP120 | keep on ice at this step |
| Grinding tubes | Biorad | 355-1197 | |
| Plate washer | Tecan | Columbus Pro | |
| Plate reader | Biorad | Model 680 | |
| Low power magnifier | VWR | 630-1062 | 8X magnification |
| Forceps Dumont#7 | WPI | 14097 | For dissection steps |
| Transfer pipette 1ml Samso | Samso | 043231 | |
| 1.5 ml tubes | Dutscher | 033290 | |
References
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