Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Endokrin ve Ekzokrin yeniden programlanması ve Silahların Yayılmasını Önleme Modeli Olarak Pankreas kanalının bağlanmasını yoluyla Fare Pankreas Cerrahi Sakatlık

doi: 10.3791/52765 Published: August 7, 2015

Abstract

Bir embriyo veya yetişkin kök hücre farklılaşması ile in vivo veya ex vivo veya beta hücrelerinin üretimi pankreatik beta hücrelerinin genişlemesi, diyabet için bir tedavi olarak, insan doku adacığı transplantasyonundan verici kıtlığı hafifletmek için beta hücrelerinin yeni bir genleşebilen kaynaklar sağlar. Son gelişmeler bu amaca yönelik yapılmış olmasına rağmen, bir kök / progenitör hücreden beta hücre genişlemesi ve farklılaşmasını düzenleyen mekanizmalar karakterize edilmesi gerekmektedir. Burada, doku tekrar modellemesinde ve beta hücre proliferasyonu ve farklılaşmasının mekanizmaları incelemek için bir araç olarak işlev görebilir yetişkin fare pankreası bir yaralanma modeli için bir protokol açıklar. Kısmi kanalı ligasyonu (PDL) pankreas kuyruk bölgesi dışına ekzokrin ürünlerinin drenaj tıkanma sonucu ana pankreatik kanal cerrahi ligasyon içeren kemirgen pankreasın bir deneysel yaralanma olduğunu. tahribatını asiner atrofi, bağışıklık hücre infilt uyarmaktadırrasyon ve şiddetli doku yeniden. Biz daha önce endojen progenitör benzeri hücreler ve PDL sonra beta hücre çoğalmasında bir artış ifade Neurogenin (NGN) 3 aktivasyonunu bildirmiştir. Bu nedenle, PDL beta hücre dinamikleri katılan sinyalleri ve yetişkin pankreas endokrin progenitör özelliklerini incelemek için bir temel sağlar. , Hala faktörler ve yollar PDL beta hücre neojenezi ve çoğalmasına katkıda bulunan, büyük ölçüde belirsizdir yana, PDL için standart protokol laboratuvarlar arasında karşılaştırma için izin verecektir.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

300 milyondan fazla insanlara dünya çapında 1,2 etkileyen diyabet prevalansı artan, yetersiz beta hücre kitlesi doldurmak için, in vitro ve in vivo olarak, hem insülin üreten beta hücrelerinin yeni kaynaklar arama artırmıştır. 3 anahtar belirleme beta hücre çoğalması ve beta hücre neojenezi, örneğin, non-beta hücre veya projenitör hücresi beta hücrelerinin farklılaşmasını düzenleyen mekanizma ve faktörleri, diyabetlerde rejeneratif tedavilerin geliştirilmesi için yeni hedefler sağlayabilir.

Gelişmekte olan kemirgen pankreas olarak, endokrin hücre tipleri transkripsiyon faktörü Neurogenin3 (Ngn3) ifade eden, endokrin progenitör hücrelerin geçici popülasyonundan ayırt. 4,5 yetişkin kemirgen pankreas olarak, normal fizyolojik koşullar altında, beta hücre kütlesi optimal sayıda tutulan metabolik ihtiyaçlarını karşılamak için. Beta hücre boyutundaki değişiklikler,beta hücrelerinin potansiyel normal fizyolojik koşullar altında prolifere iken apoptoz ve çoğaltma nüfusun genelinde homojen beta hücre genişlemesi ve dönüş bitti. 6-8 başlıca mekanizmalar oluşturan, 9 onların çoğalması oranı düşüktür ve yeniden çoğaltma sınırlandırıldı yaş ve glukoz metabolizması etkilenir dinamik bir sessizlik dönemi veya refrakter dönem 6,7. 10 endokrin progenitör hücreler kadar normal yetişkin pankreas tespit edilmemiştir beri, neojenezini normal erişkin beta hücre büyümesine katkıda bulunduğu düşünülmektedir. 8

Bu nedenle, genişletilebilir ve bir roman, beta hücrelerinin muhtemelen sınırsız bir kaynak sağlayacak yeni beta hücrelerini verimli yeteneğine sahip yetişkin pankreasta bir fakültatif endokrin progenitör hücre tanımlaması.

Kısmi kanalı ligasyonu (PDL) beta hücre neogenesi indüklediği tarif edilmiş bir hayvan yaralanması modeliYetişkin pankreasın s. Bu modelde 11,12, pankreas kuyruk boşaltma ana pankreatik kanal cerrahi bağlanır. ekzokrin drenaj elde edilen tıkanma inflamatuvar ortamında enflamasyon ve ligasyon distal asinar atrofi. 12-14 ile birlikte ana dokuların yeniden indükler, Ngn3 indüklenir endokrin progenitör işaret ve beta hücre hacmi yeniden ekspresyonu, iki kat artar . Embriyonik tip endokrin progenitör hücre ve "sessizlik dönemi" olmadan-çoğaltılması yeniden eğilimli önceden varolan ve yeni kurulan beta hücrelerinin çoğalmasından ifade eden Ngn3 yeni beta hücrelerinin kuşağa beta hücre hacmi sonuçlarında bu iki katına. 11,15

Bu tür pankreatektomi 6,7,16-19 ve beta hücrelerinin 20 seçici ablasyonu gibi yaralanma modellerinde, beta hücre neojenezini ve çoğaltma yoğun tarif edilmiştir. Thes içinde Ancak, rejeneratif sonuçE modelleri hasarın ölçüde etkilenir ve azalmış ilk beta hücre kütlesi 21 ile ilişkilidir. PDL başlangıç ​​beta hücre kütlesi etkilenmez ve beta hücre neojenezini ve proliferasyon sağlam aktive olan bir cerrahi bir modeldir. Gerçekten de, PDL uygulanan farelerin pankreasında, Ngn3 ifade eden hücreler, kanalın epitelial yakınında tespit edilir. Bu hücreler, THP (FACS) kullanılarak Ngn3-GFP transgenik farelerin lige pankreas izole edilir ve E12.5 Ngn3 pankreas ve ex vivo kültür içinde bir nakil aşağıdaki işlevsel p hücrelere karşı ayırt etmek mümkün olabilir - / - . farenin 11 Benzer şekilde, Ngn3 CreERT olarak;. Ngn3 genini aktive hücreler sürekli olarak tamoksifen, enjeksiyon, etiket-pozitif Ngn3 hücresinden türetilmiş beta hücreleri PDL sonra tespit sonra etiketlenir ki burada R26 YFP fareler 15 Ayrıca, yeni oluşan beta hücreleri, önceden seyreltilmiş -existHedef spesifik kısa saç tokası RNA anlamlı beta hücre kitlesi ve beta hücre çoğalmasını sonra azalır kullanarak Ngn3 ifadesini azalmış beri beta hücrelerini ing ve tercihen beta hücrelerinin yüksek çoğalma potansiyeli gösteren, içinde küçük adacıklar bulun. 15 Ngn3 PDL sonra beta hücre genişlemesi için önemli olan PDL. 11 Özellikle, PDL sonra Ngn3 hücresinden türetilmiş beta hücrelerinin fraksiyonu ve beta hücre kütlesi kritik Ngn3 indüksiyonu 15 seviyesine bağlıdır. R26 iDTR fareler;. Bu, Ngn3 Ngn3 CreERT difteri toksin verilmesi ile ifade eden hücrelerin seçici şekilde kesip çıkarılması Ngn3 yüksek ifade seviyesi, pankreas gelişimi sırasında multipotent pankreatik progenitörlerinden endokrin bağlılık için kritik bir adım olduğu gözlemiyle uyumludur ek olarak 22 Özellikle küçük adacıkları azalma insülin içeriğine ve düşük beta hücre çoğalması ile sonuçlanır. 15

Ngn3 ifade indüksiyon birçok 11,15,16,23,24 tarafından onaylandıktan rağmen class = "jove_content">, PDL sonucuna ilişkin adacıklar hücreleri 24,25 ve tutarsızlıklar içinde Ngn3 ifadesi bizim ilk gözlemler meydan artan beta hücre kitlesi 26,27 arasında, Ngn3 görünümü PDL sonra kanal kaynaklı endokrin atalarıdır 24,26,28,29 ve artan beta hücre çoğalmasını 27 dile getirdi. 30

Bunlar çelişkili sonuçlar, en azından kısmen, en önemlisi fareler, post-operatif fizyolojik ve çevresel koşullar ve analizi, vücut ağırlığı, cinsiyet ve yaş ameliyat sonrası zaman noktalarında varyasyonlar dahil faktörlerin bir kombinasyonu isnat edilebilir Cerrahi teknik farklılıklar. Bizim ellerde 30 beta hücre çoğalması, insülin içeriği, beta hücre hacmi ve küçük adacıklar sayısı sürekli PDL sonra artmıştır. AyrıcaNgn3 mRNA sürekli artar ama biz doğrudan açıklama var olan PDL kuyruk pankreaslarından arasında Ngn3 mRNA ekspresyonu büyük farklılıklar vardır. Biz Ngn3 mRNA seviyesi, beta hücrelerinden 15 gelen beta hücre neojenezi derecesi ile ilişkili olabilir hipotezi, ama, bu da ispat gerektirir. Tüm deneysel varyasyonları kaldırmak olmamasına rağmen, PDL ameliyatı gerçekleştirmek için standart bir yöntem sonuçlarında daha iyi tekdüzelik sağlar ve beta hücre çoğalmasını ve neojenezini okuyan yeni yollar açar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Tüm manipülasyonlar Deneysel ve diğer bilimsel Amaçlı kullanılan Omurgalı Hayvanların Korunmasına İlişkin Avrupa Sözleşmesi tarafından verilen yönergeleri izleyin (ETS 123 ve ve 2010/63 / AB).

Çalışma Alanının 1. Hazırlanması

  1. Özel bir hazırlık alanı, cerrahi alanı ve kurtarma alanında sağlayın.
  2. Çevre kirletici maddelerin en aza indirmek için, bir düzgün akış kabininde Cerrahi işlemin tamamı yürütün.
  3. Hazırlık, cerrahi ve kurtarma alanında ihtiyaç duyulan (Gereç ve Yöntem listelendiği gibi) uygun aseptik teknik kullanılarak, sarf malzemeleri birleştirin.
  4. Cerrahi aletler cerrahi öncesi otoklavlanırlar emin olun.
  5. Ameliyat sırasında sıcaklık dengelenmesi için 38 ° C'lik bir sıcaklıkta bir çevrimli su ısıtma pedi sağlar. Steril su geçirmez ped ile ısıtma yastığı örtün.
  6. En azından 6.3X bir büyütme ile bir işletim mikroskop sağlayın.
  7. Bir enstrüman Steri kullanınBöyle sıcak bir boncuk sterilizatör olarak lizer, cerrahi işlemler arasında aletleri sterilize etmek.
  8. Düz kağıt yatak ile kaplı geniş bir kafes oluşan bir kurtarma alanı hazırlayın

2. Cerrahi Hayvanlar hazırlanması

  1. PDL ve sham için, 8 haftalık erkek fareler standart kafesler içine yerleştirilir ve muhafaza edilen, 12 saat ışık / 12 saat karanlık çevrimi ve standart kemirgen diyeti ile ad libitum kullanımı.
    Not: Burada, BALB / cJrJ fareleri kullanabilir ama biz de başarılı bir şekilde diğer suşları ve çeşitli transgenik suşları kullanılmıştır.
  2. (- 0.1 mg / kg 0.05) ameliyat öncesi 30 dakika önleyici analjezi gibi Buprenophine kullanın.
  3. 10 mg / ksilazin kg - ketamin 100 mg / kg ve 5 intraperitoneal enjeksiyonu ile farelere anestezi.
  4. Istemli hareket ve kas gevşeme kademeli kaybı gözlemleyerek doğru anesthetization değerlendirin. Ayak sıkıştırarak reflekslerin kaybı test edin.
  5. Önceki oftalmik merhem sürüngözlerin ent kuruluk anestezi altında iken.

3. Cerrahi Sitesi Hazırlama

  1. Antiseptik Klorheksidin çözümü ile toraks ve karın dezenfekte edin.
  2. 2,5 cm karın x 1.5 cm lik bir alanı tıraş.
  3. Daha sonra klorheksidin çözeltisi, alkol çözeltisi ve klorheksidin solüsyonunun, nihai uygulama ile ıslatılmış gazlı bez tıraş alanı dezenfekte.
  4. Hazırlanan cerrahi alan yukarı cerrahı bakacak şekilde cerrahi alanda hayvan yerleştirin.
  5. Vücudun geri kalanı kaplayan steril çalışma alanı oluşturmak için ise maruz dezenfekte karın bölgesini terk bir açıklığı olan bir su geçirmez cerrahi örtü kullanarak fare örtün. Anestezi derinliği prosedürü öncesinde fare izleyin.

4. Pankreas Kanal Ligasyonu

  1. Laparotomi
    1. Steril kullanarak göbek için kılıç şeklinde bir süreç uzanan deri bir üst orta hat kesi yapmakCerrahi bıçak. Altta yatan linea alba ve üst karın kadranı ortaya koymak için steril makas kullanılarak Periton ayırın.
    2. Steril% 0.9 sodyum klorür ile düzenli yağmurlama ile iç organların kuruma-out önleyin.
    3. Steril cımbız veya bez kullanarak, dalak ve pankreas dalak lob (kuyruk bölge) açığa superior mide geri çekin.
    4. Yavaşça visseral periton ile örtülü pankreas baş, boyun ve gövde bölgesini ortaya çıkarmak için sağ üst kadranda üst jejunumun duodenum ve bir kısmını geri çekin.
  2. Ligasyonu
    1. Pankreasın boyun bölgesinde pankreas ana kanalının anatomik pozisyonunu bulun.
    2. Visseral periton ve gastrokolik ligament, retroperitoneal erişim izni pankreas gövde ve kuyruk bölgesini açığa İnsizyon. Boyun bölgesini açığa çıkarmak amacıyla, bir Kocher manevrası gerçekleştirin. Ve duodenum ve baş kaldırınretroperitoneal kapalı pankreas inferior vena kava ve aşağıdaki aort onları yükseltme.
    3. Dikkatle boyun bölgesine altına spatula yerleştirin. Gastro-duodenal ve dalak lobu ayıran portal ven sol tarafında 6-0 Prolen iplik ile pankreatik kanal Arter.
    4. Loblar yeterince ayrılmasını temin ilk ligasyon yakın ikinci bir ligasyonu gerçekleştirin.
    5. Altta yatan kan damarları, yani üstün pancreaticoduodenal arter, alt pancreaticoduodenal arter ve splenik arter pankreas kısmını zarar görmemesi için çok dikkatli Arter.
    6. Karın boşluğuna geri organları yerleştirin.
    7. Kas / periton katman için ve cilt için kesintili sütür desen sürekli dikiş desen 4-0 poliglikol ipliksi parçacığı kullanarak kesi kapatın.

5. Sham Cerrahisi

  1. De tüm adımları uygulayın4.1.4 adımda 1 kayıtsız kalamayız. Pankreas maruz iken, pankreatik kanal ligasyonu yapmazlar.
  2. Aşama 4.1.4 sonunda geri karın boşluğuna iç organları yerleştirin.
  3. 4.2.7 açıklandığı gibi kesi kapatın.

6. Post-operasyonel Bakım ve İzleme

  1. Cerrahi işlem tamamlandıktan sonra, kurtarma alanında fareyi yerleştirin. Bu, normal vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi amacıyla bir ısıtma pedi üzerine yerleştirilir ve düz kağıt yatak ile kaplı bir kafes içerir.
  2. Kafes altına yerleştirilen nemlendirilmiş gıda post-operatif hipoglisemi önlemek için beslenme desteği sağlamak. Yumuşayana kadar bu amaçla, su ile ıslatılmış standart kemirgen diyeti granül kullanılır.
  3. Nemlendirilmiş gıda sıvı desteği sağla ve su ad libitum sağlar.
  4. Ameliyat sonrası 2 gün boyunca günde iki kez - (0.1 mg / kg 0.05) analjezi gibi Buprenophine kullanın. Tüm deneysel sırasında, Gözlem takibie yarasından veya davranış ve aktivite düzeyi damat azalma ile karakterize fiziksel bozulma, düşük iştah ve vücut ağırlığı kaybı sıvı veya irin salgılanması da dahil enfeksiyon olası belirtileri, oluşumu için fareler.

Başarılı PDL ve PDL Tail Hasat ve Sham Tail Pankreas 7. Değerlendirme

  1. Servikal dislokasyon ile fareler Euthanize.
  2. Kürk taşınmasını önlemek için karın bölgesini yeniden tıraş.
  3. Karın deri ve kas tabakası açın ve pankreas iyi erişim elde etmek için deri ve kas geniş bir alanı kaldırmak.
  4. Steril cımbız veya bez kullanarak, mide, dalak ve pankreas dalak lob (kuyruk bölge) açığa superior çekilir.
  5. Yavaşça pankreas gastro-duodenal lob (baş bölgesi) ortaya çıkarmak için üst jejunumun duodenum ve bir kısmını dışarı çekin.
    Not: PDL pankreasın bağlandı bölümünün artık küçültülür ve neredeyse haline gelmiştirsaydam adacıklar küçük beyaz noktalar olarak görünür böylece. Pankreas baş kısmı opak pembe ve görülebilir lobuli farklı exocrine olduğunu.
  6. Steril makas kullanarak, dalak boyunca keserek, dalak gelen pankreas kuyruk kısmını lige ayırmak. İç organlara pankreas kuyruk bölgesini bağlayan bağ dokusu gevşek kesin.
  7. Bitişik harfleri ve hasat edilen dokudan buna hemen bitişik doku dışında, hemen ligasyon önünde PDL kuyruk bölgesini kesin.
  8. Sahte kuyruk doku izole etmek için, adımları 7.5 ile 7.1 izleyin. Kullanımı Steril makas dalak boyunca keserek dalak sahte pankreas kuyruk bölgesini ayrı. İç organlara kuyruk pankreas bağlayan pankreas boyun bölgesi içine kesme ve bağ dokusu gevşek keserek kuyruk bölgesini izole edin
    Not:, sahte pankreas kuyruk ve baş bölgesi Hem opak pembe ayrı iki parçayı ayırmak için,boyun bölgesinde pankreas kesti.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

PDL asiner atrofi ve inflamasyon indükler ama vücut ağırlığı ve glisemiyi etkilemez

Mide ve duodenum bitişiğinde bulunan organın başkanı etkilenmemiş kalırken 8 haftalık erkek BALB / c farelerde, pankreas kuyruk ekzokrin enzimleri drenaj kanalı bağlanır. Yaş, cinsiyet ve kilo eşleştirilmiş erkek BALB / c fareler pankreatik kanal ligasyonu dışında kısmi kanal ligasyonu cerrahisi tüm adımları yansıtan sahte cerrahi, geçmesi. Pankreas dokusu 14, 30 gün sonrası cerrahi, 7, 3 hasat edilmiştir.

PDL doğru gerçekleştirildiğinde, fareler sağlıklı görünen ve yapay olarak ameliyat edilmiş farelere kıyasla (Şekil 1B) belirgin bir vücut ağırlığı farklılığı (Şekil 1A) ya da glisemiyi göstermezler. Ekzokrin asinar dokusu P bağlanmış kısmının bir ebat küçültme ve ağırlık olarak elde edilen PDL cerrahi (Şekil 2A-E), sonra, yavaş yavaş kaybolur DL pankreas (Şekil 3), buradan sonra adlandırılan PDL kuyruk. Üç gün sonrası PDL, asiner doku morfolojisi bozulur ve asiner hücreleri apoptoz (Şekil 4) geçmesi ve büyük olasılıkla CD45 + bağışıklık hücreleri (Şekil 5) infiltre tarafından yutulmuş edilir hale gelir. 7. günde PDL, birçok asinar lobülleri fibrotik (Şekil 6) ve adipoz doku (Şekil 2C-e) Kalan asinar hücreleri asinar-to-duktal metaplazi maruz kalır ile ikame edilir. 14 gün sonrası PDL, adacıklar çıplak gözle görünür hale böylece saydam görünür PDL kuyruk pankreas yapma asiner hücreler (Şekil 2A-E) yoksun olan lobuli neredeyse tüm asiner (Şekil 3) tarafından. Asinar apoptoz başlatma ile aynı zamanda, duktal epitelyum hücre döngüsü aktivitesinde bir artış (Şekil 7) görülmektedir.

PDL insülin + beta hücre hacminde bir artışa neden olur

ontent "> olmayan bağlanmış Sham kuyruğu ile karşılaştırıldığında PDL kuyruk toplam beta hücre hacmi iki katına PDL sonra. beta hücre hacmi 4 um bölümlerde INS + alanı ölçülerek, iki hafta, 36 um birbirinden oluşturan bütün doku kapsayan beta hücre boyutu yana otomatik bütün -Doku optik tomografi (OPT). 15 ile PDL sonra değiştirilmez gösterilebilir toplam pankreas hacminin% 10. PDL iki hafta olmayan bağlanmış pankreas göre ameliyat sonrası insülin içeriğinde bir artışa neden olur beta hücre hacmindeki artış beta hücre sayısındaki bir artışın sonucudur.

PDL beta hücre çoğalmasında artış ve Ngn3 ifade aktivasyonunu uyaran

Pankreata Sham veya PDL ameliyattan 7 gün sonra ve 14 gün hasat Beta hücre çoğalması immünohistokimyasal (İHK) boyama ile analiz edilir. proliferasyon belirleyicisi Ki-67 pozitif beta hücrelerinin yüzdesi ile belirlenirotomatik olmayan bir şekilde, tek tek hücrelerin spection. 7 ve 14 gün sonra PDL ameliyatı sonrası, PDL kuyruk beta hücre çoğalması anlamlı olmayan bağlandı pankreas göre artmıştır edilir.

PDL olmayan bağlandı pankreas ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde Ngn3 PDL kuyruk artar embriyonik adacık progenitör marker ifadesi sonra 3 gün içinde. Ngn3 transkript maksimum seviyeleri 1 hafta içinde ulaştı ve daha sonra yavaş yavaş azaldı. Biz rutin olarak duodenum istikrarlı Ngn3 seviyesine göre PDL pankreasta mRNA Ngn3 kodlayan seviyesini ifade ederek Ngn3 gen aktivasyonunu ölçün. Son zamanlarda PDL neojenezi ölçüde Ngn3 gen aktivasyonu düzeyine bağlı olabileceğini öne sürdü. 15,30

Figür 1
Şekil 1. PDL vücut ağırlığı veya glisemiyi etkilemez. Vücut ağırlığı (g) (A) ve glisemi (mg/ DL) sahte operasyona (beyaz çubuklardan (B)) ve PDL fareler (siyah çubuklar) cerrahi sonrası farklı zaman noktalarında (gün 0, 7, 14 ve 30) ölçüldü ve plasebo ile PDL arasında anlamlı bir fark yoktu herhangi bir zaman noktasında çalıştırılabilir fareler. Başlangıçta Xu ve ark. Tarafından yayınlanan figür, 2008. 11. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Şekil 2. PDL asinar hücreleri kademeli bir kaybına yol açar. Sahte operasyona kuyruk pankreas (A) ile karşılaştırıldığında gün 3 (B) hematoksilen-eozin boyama, 7 (C), 14 (D) ve 30 (E) cerrahi sonrası ortaya PDL kuyruk pankreas, morfolojik değişim. 3 gün sonrası ligasyonu anda, asiner dokusunun sadece ince bir aksama o olabilirbserved (B). 7 gün ligasyonu sonrası anda, asiner dokusu ciddi bozulur ve duktal kompleksleri (C) oluşturmuşlardır. 14 gün sonrası ligasyonu anda, birkaç asiner hücreleri kalır ve duktal yapıların yerini lobuli asinar, (Panel C ve E bir yıldız (*) ile gösterilir) lifli bir ağ ve adipositler. Bu rakamın büyük halini görmek için tıklayınız .

Şekil 3,
Şekil 3. hasatta PDL kuyruk. Sham kuyruk (A) ve gün 14 sonrası ameliyat hasat PDL kuyruk (B). PDL kuyruk dramatik Sham kuyruk oranla boyutu azalır. Resim (C) in situ gün 14 sonrası muayenehanesinde PDL kuyruk gösterir. Nedeniyle asiner hücrelerin kaybı, PDL kuyrukana pankreatik kanal açıkça görülebilir, yarı saydam görünür (siyah ok ile gösterilen) ve adacıklar küçük beyaz noktalar olarak görünür (beyaz ok ile gösterilen) 'dir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4,
Şekil 4. PDL asiner apoptoz uyarmaktadır. Ameliyat sonrası 3. gün ve günde 7 cerrahi sonrası en asiner bölmesindeki apoptotik organları ortaya 3, 7 ve 14 gün PDL kuyruk bölünmüş-Kaspaz 3 immün, asiner hücreler neredeyse yok iken gün 14. Büyütme barlarda PDL kuyruk 25 mikron bulunmaktadır. Başlangıçta Xu ve ark. Tarafından yayınlanan figür, 2008. 11. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

= "Şekil 5" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig5.jpg" />
Şekil 5. PDL bağışıklık hücre infiltrasyonu uyarmaktadır. Yalancı pankreas kıyasla 7 gün ameliyattan sonra PDL kuyruk bağışıklık hücrelerinin yüksek sayıda varlığını gösteren lökosit işaretleyici CD45 için immün. Büyütme çubukları 50 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 6,
Şekil 6. PDL fibrozis neden olur. Alfa düz kas aktin için immün sahte pankreas ile karşılaştırıldığında 14 gün ameliyattan sonra PDL kuyruk lifli ağı varlığını gösterir. Büyütme çubukları 50 mikron bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

</ Html"Şekil 7" src = "/ files / ftp_upload / 52765 / 52765fig7.jpg" />
Şekil 7. PDL kanalı, hücre çoğalmasında bir artışa neden olur. Kanalı hücre markeri olan sitokeratin 19 (CK19) ve proliferasyon markör BrdU için çift immüno-lekeleme kanal hücrelerinin hücre döngüsü aktivitesinde bir artış gösterir. Büyütme çubuklar 25 mikron bulunmaktadır. Başlangıçta Xu ve ark. Tarafından yayınlanan figür, 2008. 11. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Supplies for preparation area 
Hibiscrub  Regent Medical 5601IE5F11 Chlorhexidin diglucon
Ketamin Ceva BE-V202526 anesthesia
Rompun(2%) (Xylazin) Bayer BE-V041815 anesthesia
Duratears Alcon 34335-8 ointment for eyes
Razor
Supplies for surgical area 
Leica Operating microscope Leica 10446320
Hot bead sterilizer Fine Science Tools (FST) 18000-45
autoclaved surgical instruments Fine Science Tools (FST)
Recirclulating water heating pad Gaymar Industries, Inc. TP702
Adhesive OP-towel BARRIER 706500-07
OP-tape BARRIER 381035-00
Stella 3/5 Compresse de gaze (Sterile) Lohmann&Rauscher International 35968
Mini Plasco 0.9% NaCl solution B.BRAUN 3521680
6-0 prolene suture Ethicon 8706H
4-0 polyglycol suture Ethicon SL-607
Supplies for recovery area
Paper bedding (paper towel)
Vetergesic ecuPhar BE-V342955
Materials for analysis
Taqman Ngn3 primer Integrated DNA technologies Mm.PT.56a.33574796.gs
Taqman CycloA primer Integrated DNA technologies Mm.PT.39a.2.gs
anti-Rabbit Cleaved Caspase 3 antibody (D175) Cell Signaling 5A1E
anti-mouse/rat Ki-67 antibody eBioscience 14-5698-82
monoclonal anti-actin alpha-Smooth muscle-Cy3 (mouse) Sigma 085K4889
anti-rat Cytokeratin 19  DSHB
monoclonal Mouse anti-BrdU Dako M0744
Hoechst Sigma 33342

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shaw, J. E., Sicree, R. A. Global estimates of the prevalence of diabetes for. Diabetes Res Clin Pract. 87, 4-14 (2010).
  2. Danaei, G., et al. National, regional, and global trends in fasting plasma glucose and diabetes prevalence since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 370 country-years and 2·7 million participants. Lancet. 378, 31-40 (2011).
  3. Borowiak, M., Melton, D. A. How to make beta cells. Current opinion in Cell Biology. 21, 727-732 (2009).
  4. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 1607-1611 (2000).
  5. Gu, G., Dubauskaite, J., Melton, D. A. Direct evidence for the pancreatic lineage: NGN3+ cells are islet progenitors and are distinct from duct progenitors. Development. 129, 2447-2457 (2002).
  6. Dor, Y., Brown, J., Martinez, O. I., Melton, D. A. Adult pancreatic beta-cells are formed by self-duplication rather than stem-cell differentiation. Nature. 429, 41-46 (2004).
  7. Teta, M., Rankin, M. M., Long, S. Y., Stein, G. M., Kushner, J. A. Growth and regeneration of adult beta cells does not involve specialized progenitors. Dev Cell. 12, 817-826 (2007).
  8. Bonner-Weir, S. Perspective: Postnatal pancreatic beta cell growth. Endocrinology. 141, 1926-1929 (2000).
  9. Brennand, K., Huangfu, D., Melton, D. All beta cells contribute equally to islet growth and maintenance. PLoS Biol. 5, e163 (2007).
  10. Salpeter, S. J., Klein, A. M., Huangfu, D., Grimsby, J., Dor, Y. Glucose and aging control the quiescence period that follows pancreatic beta cell replication. Development. 137, 3205-3213 (2010).
  11. Xu, X., et al. Beta cells can be generated from endogenous progenitors in injured adult mouse pancreas. Cell. 132, 197-207 (2008).
  12. Wang, R. N., Kloppel, G., Bouwens, L. Duct- to islet-cell differentiation and islet growth in the pancreas of duct-ligated adult rats. Diabetologia. 38, 1405-1411 (1995).
  13. Yasuda, H., et al. Cytokine expression and induction of acinar cell apoptosis after pancreatic duct ligation in mice. Journal of interferon, & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 19, 637-644 (1999).
  14. Van Gassen, N., et al. Macrophage dynamics are regulated by local macrophage proliferation and monocyte recruitment in injured pancreas. European journal of immunology. (2015).
  15. Van de Casteele, M., et al. Neurogenin 3+ cells contribute to beta-cell neogenesis and proliferation in injured adult mouse pancreas. Cell Death Dis. 4, e523 (2013).
  16. Xiao, X., et al. No evidence for beta cell neogenesis in murine adult pancreas. The Journal of clinical investigation. 123, 2207-2217 (2013).
  17. Ackermann Misfeldt, A., Costa, R. H., Gannon, M. Beta-cell proliferation, but not neogenesis, following 60% partial pancreatectomy is impaired in the absence of FoxM1. Diabetes. 57, 3069-3077 (2008).
  18. Lee, C. S., De Leon, D. D., Kaestner, K. H., Stoffers, D. A. Regeneration of pancreatic islets after partial pancreatectomy in mice does not involve the reactivation of neurogenin-3. Diabetes. 55, 269-272 (2006).
  19. Bonner-Weir, S., Sharma, A. Pancreatic stem cells. The Journal of pathology. 197, 519-526 (2002).
  20. Nir, T., Melton, D. A., Dor, Y. Recovery from diabetes in mice by beta cell regeneration. The Journal of clinical investigation. 117, 2553-2561 (2007).
  21. Bouwens, L., Rooman, I. Regulation of pancreatic beta-cell mass. Physiol Rev. 85, 1255-1270 (2005).
  22. Wang, S., et al. Neurog3 gene dosage regulates allocation of endocrine and exocrine cell fates in the developing mouse pancreas. Developmental biology. 339, 26-37 (2010).
  23. Pan, F. C., et al. Spatiotemporal patterns of multipotentiality in Ptf1a-expressing cells during pancreas organogenesis and injury-induced facultative restoration. Development. 140, 751-764 (2013).
  24. Kopp, J. L., et al. Sox9+ ductal cells are multipotent progenitors throughout development but do not produce new endocrine cells in the normal or injured adult pancreas. Development. 138, 653-665 (2011).
  25. Wang, S., et al. Sustained Neurog3 expression in hormone-expressing islet cells is required for endocrine maturation and function. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 9715-9720 (2009).
  26. Kopinke, D., et al. Lineage tracing reveals the dynamic contribution of Hes1+ cells to the developing and adult pancreas. Development. 138, 431-441 (2011).
  27. Rankin, M. M., et al. beta-Cells are not generated in pancreatic duct ligation-induced injury in adult mice. Diabetes. 62, 1634-1645 (2013).
  28. Solar, M., et al. Pancreatic exocrine duct cells give rise to insulin-producing beta cells during embryogenesis but not after birth. Dev Cell. 17, 849-860 (2009).
  29. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43, 34-41 (2011).
  30. Van de Casteele, M., et al. Partial duct ligation: beta-cell proliferation and beyond. Diabetes. 63, 2567-2577 (2014).
  31. Zhang, J., Rouse, R. L. Histopathology and pathogenesis of caerulein-, duct ligation-, and arginine-induced acute pancreatitis in Sprague-Dawley rats and C57BL6 mice. Histology and histopathology. 29, 1135-1152 (2014).
  32. Martinez-Romero, C., et al. The epigenetic regulators Bmi1 and Ring1B are differentially regulated in pancreatitis and pancreatic ductal adenocarcinoma. The Journal of pathology. 219, 205-213 (2009).
  33. Prevot, P. P., et al. Role of the ductal transcription factors HNF6 and Sox9 in pancreatic acinar-to-ductal metaplasia. Gut. 61, 1723-1732 (2012).
Endokrin ve Ekzokrin yeniden programlanması ve Silahların Yayılmasını Önleme Modeli Olarak Pankreas kanalının bağlanmasını yoluyla Fare Pankreas Cerrahi Sakatlık
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).More

De Groef, S., Leuckx, G., Van Gassen, N., Staels, W., Cai, Y., Yuchi, Y., Coppens, V., De Leu, N., Heremans, Y., Baeyens, L., Van de Casteele, M., Heimberg, H. Surgical Injury to the Mouse Pancreas through Ligation of the Pancreatic Duct as a Model for Endocrine and Exocrine Reprogramming and Proliferation. J. Vis. Exp. (102), e52765, doi:10.3791/52765 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter