Abstract
الكبد لديه قدرة كبيرة على التجدد. خلايا الكبد، والخلايا متني من الكبد، ويمكن تجديد في واحدة من طريقتين: hepatocyte- أو يحركها المرارة تجديد الكبد. في يحركها الكبدية تجديد الكبد، وتستمد خلايا الكبد تجديد خلايا الكبد من قبل الإيجاد، في حين أنه في يحركها المرارة تجديد، تستمد خلايا الكبد تجديد من الخلايا الظهارية الصفراوية (BECS). ليحركها الكبدية تجديد الكبد، وهناك نماذج القوارض الممتازة التي ساهمت إلى حد كبير في الفهم الحالي لتجديد الكبد. ومع ذلك، لا يوجد نموذج القوارض مثل هذا ليحركها المرارة تجديد الكبد. بلغنا مؤخرا على نموذج اصابة الكبد الزرد التي BECS إعطاء نطاق واسع أدى إلى خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الحادة. في هذا النموذج، وذاب خلايا الكبد بشكل خاص من قبل وسائل pharmacogenetic. هنا نقدم بالتفصيل الطرق لاجتثاث خلايا الكبد وتحليل عملية تجديد الكبد BEC يحركها.هذا النموذج الاجتثاث الكبدية محددة يمكن أن تستخدم أيضا لاكتشاف الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة وراء يحركها المرارة تجديد الكبد. وعلاوة على ذلك، وهذه الأساليب يمكن تطبيقها على شاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي تزيد أو قمع تجديد الكبد.
Introduction
الكبد هو عضو التجديدي للغاية. خلال تجديد الكبد، وتجديد خلايا الكبد، والخلايا متني من الكبد، وتستمد من خلايا الكبد موجود مسبقا (يحركها الكبدية تجديد الكبد) أو BECS (يحركها المرارة تجديد الكبد) 1،2. اصابة الكبد عادة ما يتسبب في انتشار خلايا الكبد موجودة من قبل؛ ومع ذلك، عندما تتعرض للخطر الانتشار الكبدية، BECS يمكن أن تسهم في خلايا الكبد 2-4. هذين الوضعين لتجديد الكبد هامة سريريا. على الاستئصال الجراحي لجزء من الكبد البشري (على سبيل المثال، بسبب أورام الكبد أو المتبرعين الأحياء)، خلايا الكبد في الكبد المتبقية تتكاثر لاسترداد كتلة الكبد المفقودة. على النقيض من ذلك، في المرضى الذين يعانون من أمراض في الكبد، وخطر انتشار خلايا الكبد إلى حد كبير، بحيث تظهر BECS أو الخلايا الاولية الكبد (LPCs) للمساهمة في تجديد خلايا الكبد 5،6. نموذج استئصال الكبد الجزئي القوارض 2/3، والذيخلايا الكبد تتكاثر لاسترداد كتلة الكبد المفقودة، ساهمت إلى حد كبير في الفهم الحالي يحركها الكبدية الكبد تجديد 7،8. ومع ذلك، لا يوجد نموذج والقوارض صالح في والتي هي مستمدة أساسا خلايا الكبد تجديد من BECS. على الرغم من أن العديد من النماذج سموم الكبد القوارض أدى إلى تحديد يحركها المرارة الكبد تجديد 2-4، النسب تتبع الدراسات التي أجريت مؤخرا على الفئران تشير إلى مساهمة الحد الأدنى من BECS لتجديد خلايا الكبد في هذه النماذج 9،10. بعض النماذج اصابة الكبد القوارض، بما في ذلك استئصال الكبد الجزئي 11-13 والتي يسببها الأسيتامينوفين تلف الكبد 14،15، تم تطبيقها على الزرد وأدت إلى تحديد جينات جديدة أو مسارات المتورطين في تجديد الكبد. ومع ذلك، مدفوعة الكبدية، ولكن ليس BEC يحركها، يحدث تجديد الكبد في هذه النماذج اصابة الكبد الزرد. ولذلك، فإن نموذج إصابة الكبد الرواية التي BECS تساهم نطاق واسع لregeneratخلايا الكبد جي هو مطلوب من أجل فهم أفضل للBEC يحركها تجديد الكبد.
ووصفت الأهداف العامة للنموذج الاجتثاث الكبدية هنا (1) لإنشاء نموذج اصابة الكبد التي BECS المساهمة على نطاق واسع في خلايا الكبد تجديد، و (2) توضيح الآليات الجزيئية والخلوية الكامنة BEC يحركها تجديد الكبد. افترضنا أن شدة الإصابة تحدد طريقة تجديد الكبد. وبالتالي، توقعنا أن يحركها المرارة تجديد الكبد ستشرع على الإصابة الكبدية الحادة. لاختبار هذه الفرضية، قمنا بتطوير نموذج إصابة الكبد الزرد عن طريق توليد خط المعدلة وراثيا، تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) s931، التي تعبر عن درجة عالية من Nitroreductase بكتيريا (NTR) تنصهر مع بروتين فلوري سماوي (CFP) تحت fabp10a الكبدية محددة المروج. منذ NTR يحول دواء مساعد غير سامة، ميترونيدازول (Mtz ل)، إلى المخدرات السامة للخلايا، فإنه ablates فقط يقصد NTR-معربا عن الخلايا 16-18، في هذه الحالة، وخلايا الكبد. عن طريق التلاعب في مدة العلاج MTZ، مدى الكبدية الاجتثاث يمكن السيطرة عليها. باستخدام هذا النموذج، ونحن ذكرت مؤخرا ان على فقدان الكبدية الحادة، BECS إعطاء نطاق واسع أدى إلى تجديد خلايا الكبد 19، وهو ما أكده أيضا من قبل اثنين من دراسات أخرى مستقلة 20،21. وبالتالي، مقارنة مع القوارض المذكور ونماذج إصابة الكبد الزرد، لدينا الكبدية نموذج الاجتثاث هو أكثر فائدة لدراسة BEC يحركها تجديد الكبد.
يصف هذا البروتوكول إجراءات إجراء التجارب تجديد الكبد باستخدام الزرد نموذج الكبدية الاجتثاث. وهذا النموذج سوف يكون مناسبا لتحديد الآليات الكامنة وراء يحركها المرارة تجديد الكبد وللشاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن تقمع أو زيادة تجديد الكبد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وأثيرت الزرد ولدت وفقا للإجراءات القياسية. تمت الموافقة على التجارب التي أجرتها جامعة بيتسبرغ المؤسسي رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام.
1. إعداد الأجنة / يرقات
- لإجراء التزاوج في الوقت المناسب، وإعداد الذكور البالغين والإناث تيراغرام (fabp10a: CFP-NTR) s931 الأسماك فرداني الزيجوت أو متماثل O / N ووضع مقسم بينهما. إزالة هذا المفرق صباح اليوم التالي عند الرغبة التزاوج. جمع الأجنة عن طريق توتير المياه باستخدام غرامة شبكة بلاستيكية مصفاة.
- تحويل مصفاة رأسا على عقب وشطف السطح شبكة مع تيار غرامة من الماء البيض الاستغناء عن زجاجة الضغط. نقل 100 الأجنة إلى 100 مم طبق بتري مع 25 مل من الماء البيض. الحفاظ على ما لا يزيد عن 100 الأجنة في طبق بتري ورفع لهم في 28 ° C.
- لمنع تصبغ، إضافة الفنيل (PTU) في أطباق بتري قبل 10 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، ورفع هmbryos / اليرقات حتى 80 HPF. التركيز النهائي من PTU هو 0.2 ملم. تنبيه: PTU غير سامة. استخدام وفقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة.
- تخدير اليرقات وذلك بإضافة 3-الأمينية البنزويك اثيل استر حمض (تريكين)، في تركيز النهائي من 0.016٪، في أطباق بتري. ثم، باستخدام مجهر epifluorescence ويرقات النوع CFP الإيجابية. استخدام اليرقات مع حجم مماثل الكبد وتجاهل تلك التي لديها الكبد أصغر أو أكبر.
ملاحظة: أي يرقات-CFP الإيجابية، بغض النظر عن كثافة، ويمكن استخدامها لأنه لا يوجد اختلاف في مدى الكبدية الاجتثاث بين يرقات فرداني الزيجوت ومتماثل. تنبيه: تريكين غير سامة. استخدام وفقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة. - إزالة الماء البيض التي تحتوي على تريكين وإضافة الماء البيض تستكمل مع 0.2 ملي PTU. الحفاظ على الأجنة / اليرقات في 28 ° C.
2. Mtz لعلاج
- إعداد الطازجة حل 10 ملم Mtz لعن طريق إذابة 0.171 غرام من مسحوق Mtz لفي 100 مل من الماء البيض تستكمل مع 0.2٪ DMSO و 0.2 ملي PTU. حل تماما MTZ، مزيج الحل في RT مع التحريك السريع لمدة 20-30 دقيقة. للمساعدة على إذابة Mtz لوتعزيز Mtz لنفاذ إلى يرقات، إضافة DMSO عند إعداد Mtz ل. تحذير: التعرض لفترات طويلة أو زيادة تركيز Mtz لمادة سامة. استخدام وفقا للمبادئ التوجيهية التعامل المناسبة.
- فصل اليرقات في السيطرة والتجريبية المجموعات عن طريق نقل العدد المرغوب فيه من اليرقات إلى قسمين مختلفين 100 طبق بتري ملم أو لوحة متعددة أيضا. لصالح المجموعة التجريبية، والحفاظ على اليرقات في 10 ملي Mtz لحل. لمجموعة المراقبة، والاحتفاظ بها في المياه التي تحتوي على البيض 0.2٪ DMSO.
- تغطية لوحات أو أطباق بتري تحتوي على حل Mtz لبورق الألمنيوم لمنع الصور تثبيط MTZ، واحتضان عند 28 ° C. تعتمد مدة العلاج على Mtz لمرحلة اليرقات وخط المعدلة وراثيا.
- لمراقبة مماثلة الاجتثاث الكبدية الشديد في
3. تحليل صفراوية يحركها تجديد الكبد
- في نهاية الفترة الاجتثاث، وإزالة الحل Mtz لمن لوحات. غسل اليرقات Mtz لمعاملة بإضافة 25 مل من الماء البيض. دوامة لوحة 2-3 مرات لغسل اليرقات قبل رميه الماء البيض. كرر ثلاث مرات ثم تزج اليرقات مرة أخرى في الماء البيض. لتجنب ذمة القلب والموت اليرقات في اليرقات Mtz لالمعاملة، إضافة إلى تركيز أقل من تريكين، بتركيز نهائي من 0.008٪، لشل حركة اليرقات.
- لتحليل الكبد، فحص حجم الكبد من اليرقات Mtz لمعاملة تحت المجهر epifluorescence مع مرشح CFP. تقييم مستويات الاجتثاث الكبدية على أساس حجم النسبي للكبد: كبيرة (غير ذاب؛ 0-10٪ اليرقات) ومتوسطة (ذاب جزئيا؛ 02/100٪)، وصغيرة جدا (ذاب تماما؛ 80-90٪).
- إزالة اليرقات مع كبد غير ذاب ذاب أو جزئيا. تبقي فقط اليرقات مع كبد صغير، مما يدل على الاجتثاث الكبدية الشديد. لتحليل الكبد في تجديد 0 نقطة زمنية ساعة (R0h)، حصاد اليرقات بعد Mtz لتبييض وCFP الفرز. خلاف ذلك، والحفاظ على يرقات مرتبة في الماء البيض تستكمل مع 0.2 ملي PTU لتصبح جاهزة للحصاد.
- نقل اليرقات التي تحصد في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ويحل محل المياه البيض مع الحل التثبيت من 3٪ الفورمالديهايد في المخزن PEM. احتضان الأنبوب على محور دوار O / N عند 4 درجات مئوية.
- استبدال الحل تثبيت مع 1 مل من PBSDT وتدوير الأنبوب الذي يحتوي على اليرقات على محور دوار لمدة 5 دقائق.
- نقل اليرقات ثابتة في طبق بتري 100 ملم تحتوي على PBSDT وباستخدام ملقط، يدويا إزالة صفار البيض والصدرية زعانف تحت المجهر تشريح. نقل ما يصل TP 20 اليرقات تشريح في أنبوب 1.5 مل. <لى> استبدال حل PBSDT مع 1 مل من محلول منع والصخور الأنبوب على محور دوار في RT لمدة 2 ساعة.
- استبدال عرقلة الحل مع 100 ميكرولتر من عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة الأولية. صخرة ببطء أنبوب على محور دوار O / N عند 4 درجات مئوية.
- إزالة حل الأجسام المضادة الأولية ويغسل مع PBSDT 5 مرات لمدة 10 دقيقة في كل مرة. ثم إضافة 100 UL من عرقلة الحل تحتوي على الأجسام المضادة الثانوية والصخور على محور دوار في RT ل2HR.
- يغسل 5 مرات مع PBSDT لمدة 10 دقيقة في كل مرة في RT التي كتبها هزاز على محور دوار.
- توجيه اليرقات أفقيا على شريحة المجهر وإضافة قطرة من وسائل الإعلام في تصاعد مستمر. غطاء لهم بعناية مع غطاء زجاجي وختم غطاء زجاجي مع ملمع الأظافر. الآن، وانها مستعدة للفحص المجهري متحد البؤر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
العلاج MTZ لمدة 36 ساعة (A36h، A تقف على الاجتثاث) 3،5-5 إدارة الشرطة الاتحادية خفضت بشكل كبير حجم الكبد (الشكل 1B). بعد Mtz لتبييض، التي تعتبر بداية تجديد الكبد (R)، fabp10a قوية: CFP-NTR وfabp10a: الظهور dsRed التعبير غضون 30 ساعة (الشكل 1B). شبكة الصفراوية داخل الكبد، وفقا لتقييم التعبير عن Alcam التي هي موجودة في غشاء BECS 22، انهارت في البداية ولكن تم إعادة تأسيس في 54 ساعة بعد فشل (R54h) (الشكل 1C). وتشير هذه البيانات إلى أن تجديد الكبد والانتعاش تحدث بسرعة في نموذجنا اصابة الكبد.
ويبين الشكل 2 أن خلايا الكبد تجديد مستمدة من BECS. تيراغرام (TP1: H2B-mCherry) خط s939 يعبر عن بروتين أحمر فلوري النووي تحت سيطرة عنصر تحتوي على مواقع 12 RBP-Jĸ ملزمة 23. هذا RESPO الشقيظهر عنصر nsive لدفع التعبير الجيني حصرا في BECS في الكبد (24)؛ ومع ذلك، فمن الممكن أنه يدفع التعبير الجيني في LPCs لأن الشق يشير يرتبط ارتباطا وثيقا LPCs 25. لذلك، هذا خط المعدلة وراثيا يسمح لسهولة اكتشاف من BEC، وربما LPC، نوى. وعلاوة على ذلك، واستقرار الموسع للH2B-mCherry تصاريح انصهار بروتين تتبع النسب على المدى القصير. وأعرب معظم الخلايا H2B-mCherry + في الكبد تجديد في R0h Hnf4α (الشكل 2A)، وهو ما يعبر عنه في خلايا الكبد، ولكن ليس في BECS، في الكبد السيطرة. خلايا الكبد، وفقا لتقييم fabp10a: CFP-NTR التعبير، في R48h لا يزال يحتفظ TP1: H2B-mCherry التعبير (الشكل 2B، والسهام). وتشير هذه البيانات BEC التحول إلى خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الشديدة، وهو ما أكده أيضا عن طريق تتبع نسب دائم 19.
الشكل 1. نموذج اصابة الكبد الزرد. (A) مخطط يوضح فترات العلاج Mtz لوتجديد الكبد. (B) 36 ساعة العلاج Mtz لتقلص إلى حد كبير حجم الكبد وfabp10a: CFP وfabp10a: dsRed مضان في R0h. ومع ذلك، الظهور CFP قوية وdsRed مضان في R30h. تشير الأسهم إلى الكبد (لي). آراء (C) متحد البؤر الإسقاط من الكبد كله immunostained مع الأجسام المضادة المقاومة للAlcam التي وصفت BECS. وقد انهار شبكة الصفراوية داخل الكبد في R0h لكن بسرعة إعادة تأسيس في R54h. المناطق المنقطة الخطوط العريضة الكبد. الحانات النطاق: 100 (B)، 20 (C) ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
_upload / 52785 / 52785fig2.jpg "/>
الشكل 2. BECS تثير خلايا الكبد عند فقدان الكبدية الحادة (A) مشاهدة إسقاط متحد البؤر الكبد تظهر Hnf4α (الخضراء) وTP1: H2B-mCherry (أحمر) التعبير في R0h. (B) متحد البؤر واحدة البصرية الصور القسم تظهر fabp10a: CFP-NTR (الرمادي) وTP1: H2B-mCherry (أحمر) التعبير في الكبد. تم الكشف عن mCherry التعبير من خلال مكافحة mCherry المناعية. لاحظ ضعف التعبير mCherry في نوى CFP + خلايا الكبد (السهام). mCherry قوي + الخلايا هي BECS. الحانات النطاق: 20 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
شديدة، ولكن ليس خفيفة، الكبدية الاجتثاث يثير يحركها المرارة تجديد الكبد. لذلك، بعد العلاج Mtz لوفشل، فمن المهم أن تدرس حجم الكبد من اليرقات Mtz لمعاملتهم، والتي يمكن تقييمها من قبل لا يتجزأ CFP مضان من fabp10a: CFP-NTR التحوير. لأن نسبة صغيرة من اليرقات Mtz لمعاملة سيعرض غير ذاب (0-5٪) أو ذاب جزئيا (10-20٪) الأكباد، فمن الضروري لفرز وتحليل فقط اليرقات مع كبد صغير جدا، والتي يدل على الاجتثاث الكبدية الشديد.
على الرغم من أن في بروتوكول لدينا، كنا نعامل واليرقات الزرد مع Mtz ل3،5-5 إدارة الشرطة الاتحادية (فترة العلاج 36 ساعة)، مراحل البديلة ومدة العلاج Mtz لمن الممكن أيضا. على سبيل المثال، اليرقات تعامل 5-6 DPF (فترة العلاج 24 ساعة) عرضت أيضا الاجتثاث الكبدية الشديد، على غرار فترة العلاج 36 ساعة المذكورة أعلاه. مجموعتان إضافيتان ولدت بشكل مستقلfabp10a مشابهة: خطوط المعدلة وراثيا NTR وذكرت أيضا على عملية يحركها المرارة تجديد الكبد بعد استئصال الكبدية محددة. في حين أن مجموعة واحدة تعامل مع يرقات Mtz ل6-7 DPF 21، فعلت حتى آخر 3،5-4،5 إدارة الشرطة الاتحادية، التوصل إلى استنتاجات مماثلة (20). لأن كل fabp10a: خط المعدلة وراثيا NTR قد يواجه مستوى مختلف من NTR التعبير، ينبغي تحديد مدة وجرعة من العلاج Mtz لمنفصل لكل من خط المعدلة وراثيا المستخدمة. قد يكون مفيدا أيضا لتوليد خط المعدلة وراثيا مع نسخة محسنة من الجين NTR، الذي إدخال ثلاث طفرات النقطة يؤدي إلى زيادة في النشاط الأنزيمي في 26. هذا المسخ NTR سوف يؤدي إلى حالة الاجتثاث أسرع من النوع البري NTR 26. هذا هو مفيد خاصة عندما البرية من نوع حركية NTR قد تحد من إمكانية كاملة الاجتثاث خلية في المرحلة المطلوبة.
منذ مئات يرقاتيمكن الخضوع لفي وقت واحد الكبدية الاجتثاث، وهذا نموذج الكبد إصابة الزرد يمكن تطبيقها على شاشات الكيميائية لتحديد الجزيئات الصغيرة التي يمكن أن قمع أو زيادة يحركها المرارة تجديد الكبد. على سبيل المثال، وذلك باستخدام هذا النموذج، تقوم المجموعة شين في معهد جورجيا للتكنولوجيا شاشة الكيميائية وجدت عدة منبهات WNT والخصوم نوتش التي سهلت تجديد الكبد 20. أجرينا أيضا شاشة مقياس كيميائية صغيرة، وحددت عدة مركبات التي يمكن أن قمع تجديد الكبد (SK، TYC، JS، وDS، قيد الإعداد).
علامة يحلل في البشر اقترح أن BECS يمكن أن تسهم في خلايا الكبد مجدد في الكبد المريضة 5،6. ذكرت مجموعة الدكتور Wanless "مؤخرا أن نسبة كبيرة من حمة في تليف الكبد تراجعت يبدو أن تستمد من LPCs / BECS في البشر 27، مما يدل على أهمية BEC يحركها تجديد الكبد تليف الكبد في الانحدار. وبالنظر إلى أن BECS أساساالمساهمة في خلايا الكبد تجديد في الزرد نموذج اصابة الكبد هو موضح هنا، فإن هذا النموذج أن يكون أداة لا تقدر بثمن لتحديد الآليات الخلوية والجزيئية الكامنة وراء BEC يحركها تجديد الكبد. وفهم هذه الآليات تقديم رؤى هامة في كيفية زيادة تجديد الكبد الفطري في المرضى الذين يعانون من أمراض في الكبد. وعلاوة على ذلك، في تركيبة مع شاشات الكيميائية، قد يكون هذا النموذج الزرد مفيدة في تحديد المخدرات المحتملة التي يمكن أن تسهل تجديد الكبد الفطري في المرضى من البشر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N.
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K.
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
