Abstract
肝脏有很大的再生能力。 hepatocyte-或胆道驱动肝细胞再生：肝细胞，肝实质细胞，可以以两种方式之一再生。在肝细胞驱动的肝脏再生，再生肝细胞是从先前存在的肝细胞衍生的，而在胆汁驱动再生，再生肝细胞是从胆管上皮细胞（BEC中）而得。对于肝细胞驱动的肝脏再生，有优秀的啮齿动物模型已经显著有助于肝脏再生的目前了解。但是，没有这样的啮齿动物模型存在胆道驱动肝再生。我们最近报告了斑马鱼肝损伤模型中的BEC广泛引起肝细胞严重时肝细胞的损失。在此模型中，肝细胞是专门由药理学手段消融。在这里，我们将详细介绍的方法来烧蚀肝细胞并分析BEC驱动肝再生过程。此肝细胞特异性消融模型可以进一步用于发现的胆驱动肝脏再生潜在的分子和细胞机制。此外，这些方法可应用于化学筛选，以确定小分子增强或抑制肝再生。
Introduction
肝脏是一个高度再生的器官。在肝再生，再生肝细胞，肝实质细胞，衍生自预先存在的肝细胞（肝细胞驱动的肝脏再生）或的BEC（胆驱动肝再生）1,2。肝损伤引起，通常预先存在肝细胞的增殖;然而，当肝细胞增殖受到损害，建筑物能源效益守则可以促进肝细胞2-4。肝脏再生的这两种模式是临床显著。在手术切除（因为肝肿瘤或活肝供体例如 ）人类肝脏的一部分的，在剩余的肝的肝细胞增殖来恢复丢失的肝脏重量。与此相反，在患有严重肝病，肝细胞增殖受到很大损害，使得的BEC或肝脏祖细胞（LPCS）似乎有助于再生肝细胞5,6。啮齿动物的2/3部分肝切除模型，其中肝细胞增殖，以恢复丢失的肝脏肿块，已经显著促进了肝细胞驱动的肝脏再生7,8当前的理解。然而，存在其中再生肝细胞主要来源于BEC中没有有效的啮齿动物模型。尽管一些啮齿类动物肝脏毒素模型导致胆道驱动肝细胞再生2-4的鉴定，在小鼠近期谱系追踪研究表明建筑物能源效益守则，以在这些模型中9,10再生肝细胞最小的贡献。一些啮齿类肝损伤模型，其中包括部分肝切除11-13和对乙酰氨基酚引起的肝损害14,15，已经被应用到斑马鱼和导致牵连在肝再生新基因或通路的鉴定。然而，肝细胞驱动的，而不是BEC驱动，肝再生发生在这些斑马鱼肝损伤模型。因此，一种新的肝损伤模型中建筑物能源效益守则广泛有助于regenerat荷兰国际集团肝细胞都需要更好地了解BEC驱动的肝脏再生。
肝细胞消融模型的总体目标描述此处被（1），以产生一个肝损伤模型，其中的BEC广泛向再生肝细胞，和（2）阐明底层BEC驱动肝脏再生的分子和细胞机制。我们假设，损伤的严重程度决定了肝再生的模式;因此，我们预测，胆驱动肝细胞再生会引发严重时肝细胞损伤。为了检验这一假设，我们开发了斑马鱼肝损伤模型通过产生一个转基因品系，Tg为（fabp10a：CFP-NTR）S931，即高表达细菌硝基还原酶（NTR）融合青色荧光蛋白（CFP）的肝细胞特异性fabp10a下子。因为NTR转换无毒前药，甲硝唑（甲硝唑），成细胞毒性药物，它烧蚀只有预期NTR-表达细胞16-18，在这种情况下，肝细胞。通过操纵甲硝唑治疗的持续时间，肝细胞烧蚀的程度可被控制。利用该模型，我们最近报道说，在严重的肝细胞损失，BEC中广泛地再生肝细胞19，其进一步通过另外两个独立的研究20,21证实产生。因此，与上述的啮齿动物和斑马鱼肝损伤模型，我们的肝切除模型是用于研究BEC驱动肝再生更有利。
本协议描述了使用斑马鱼肝切除模型进行肝再生的实验过程。这个模型将是适当用于确定底层胆道驱动肝脏再生的机制和化学筛选，以确定小分子，可以抑制或增强肝再生。
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Protocol
斑马鱼根据标准程序提出并饲养;实验经匹兹堡机构动物护理和使用委员会的大学。
1.准备胚胎/幼虫
- 要定时进行交配，建立成年男性和女性的Tg（fabp10a：CFP-NTR）S931半合子或纯合子鱼O / N，把它们之间的分隔。交配时需要删除此分压器的第二天早晨。用细塑料滤网紧张的水收集胚胎。
- 打开过滤器倒置和冲洗网面蛋水的细流从洗瓶分配。转移100胚胎成100毫米培养皿用25毫升水蛋的。保持不超过100元的胚胎培养皿中，并提高它们在28℃。
- 为了抑制色素沉着，添加苯基硫脲嘧啶（PTU）进入前10小时受精后（HPF）的培养皿，并提高Ëmbryos /幼虫，直到80高倍视野。 PTU的最终浓度为0.2毫摩尔。注意：PTU是有毒的。使用按照适当的处理方针。
- 通过加入3-氨基苯甲酸乙酯（三卡因），在0.016％的最终浓度，进培养皿麻醉幼虫。然后，用落射荧光显微镜，排序CFP阳性幼虫。使用幼虫具有相似肝脏大小并丢弃那些具有更小或更大的肝脏。
注意：任何CFP阳性幼体，无论强度，可以使用，因为在肝切除的半合子和纯合子幼虫之间的程度没有差别。注意：三卡因是有毒的。使用按照适当的处理方针。 - 删除包含三卡因鸡蛋水中加辅以0.2毫米PTU鸡蛋水。保持胚胎/幼虫在28℃。
2.治疗甲硝唑
- 在1溶解0.171克甲硝唑粉准备新鲜的10毫米甲硝唑液00毫升蛋水补充有0.2％DMSO和0.2mM的PTU。以完全溶解甲硝唑，混合溶液在室温下快速搅拌下进行20-30分钟。为了帮助溶解甲硝唑和提升甲硝唑渗透到幼虫，准备甲硝唑时添加DMSO。注意：长期接触或甲硝唑的浓度增加是有毒的。使用按照适当的处理方针。
- 通过转移幼虫所需数目为两个不同百毫米培养皿或多孔板幼虫到对照组和实验组中分离出来。对于实验组，保持在10mM甲硝唑溶液幼虫;为对照组，它们保存在含0.2％DMSO的蛋水。
- 覆盖板或含有用铝箔甲硝唑溶液，以防止光灭活甲硝唑的培养皿，并培养在28℃。甲硝唑治疗的持续时间依赖于幼虫期和转基因系。
- 观察类似的严重肝切除
胆道驱动肝再生3.分析
- 在消融期间结束，取出从板的甲硝唑溶液。加入25毫升蛋水冲洗的甲硝唑治疗的幼虫。旋流板的2-3倍幼虫废弃卵子前水冲洗。重复三次，然后将其浸入幼虫再次在蛋水。避免心脏水肿和幼虫死亡中甲硝唑处理的幼虫中，添加三卡因的浓度较低，在0.008％的最终浓度，以固定的幼虫。
- 对于肝脏的分析，考察甲硝唑治疗幼虫的肝脏大小的落射荧光显微镜与CFP过滤器下。评估基于相对肝脏大小肝细胞消融级别：大（非烧蚀; 0-10％的幼虫），中（部分地烧蚀; 10-20％），以及非常小的（完全烧蚀; 80-90％）。
- 删除非消融或部分肝脏切除的幼虫。仅保持幼虫一个微小肝脏，其表示严重肝切除。在再生0小时的时间点（R0H）肝脏分析，收获甲硝唑冲洗和CFP排序后的幼虫。否则，保持水蛋排序幼虫辅以0.2毫米PTU直至准备收获。
- 转移收获幼体至1.5 ml微量离心管中，并用3％甲醛在PEM缓冲定影溶液代替鸡蛋水。孵育在旋转器上O / N在4℃下在管。
- 替换用1ml PBSDT的固定溶液和旋转载转子幼虫5分钟的管。
- 固定幼虫转移到含有PBSDT和使用镊子100毫米培养皿，在解剖显微镜下手工除去卵黄和胸鳍。传送多达TP 20解剖幼虫到1.5毫升管。 <利>替换PBSDT溶液与1ml封闭溶液，并摇动试管旋转器上在室温搅拌2小时。
- 更换封闭液用100μl阻断含有初级抗体溶液。慢慢的岩石上一肩O / N在4℃管。
- 除去第一抗体溶液，并用PBSDT 5次，每次10分钟。再加入100微升封闭液含二级抗体和岩石它在旋转器上在室温2小时的。
- 摇动旋转器上洗5次PBSDT为每次10分钟，在室温。
- 横向东方幼虫在显微镜幻灯片，加入一滴安装介质。仔细包括他们用玻璃盖，密封玻璃盖用指甲抛光。现在，它已经准备好共聚焦显微镜。
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Representative Results
甲硝唑治疗36小时（A36h，A代表消融）从3.5到5旦显着降低肝脏大小（ 图1B）。甲硝唑冲洗后，认为是肝再生（R），强fabp10a的开头：CFP-NTR和fabp10a：30小时（ 图1B）内的红色荧光蛋白的表达又出现了。肝内胆管网络的评估，ALCAM的表达中存在的BEC中22的膜，最初折叠而重新设立在54小时后的冲洗（R54h）（ 图1C）。这些数据表明，肝再生和恢复快速发生在我们的肝损伤模型。
图2显示了再生肝细胞是从BEC中导出。 的Tg（TP1：H2B-mCherry）S939线表示含有12 RBP-Jĸ结合位点23上的元件的控制下的核红色荧光蛋白。这个缺口responsive要素似乎完全驱动基因表达的BEC在肝脏中24;然而，这是可能的，它的驱动器在LPCS基因表达，因为Notch信号密切相关的LPCS 25。因此，这种转基因系可以很容易地检测BEC的，而且很可能LPC，原子核。此外，H2B-mCherry融合蛋白允许短期谱系追踪的扩展稳定性。最H2B-mCherry +细胞在再生肝在R0H表达HNF4α（ 图2A），这是表示在肝细胞中，但不是在BEC中，在控制肝脏。肝细胞，作为评估fabp10a：CFP-NTR的表达，在R48h仍然保留TP1：H2B-mCherry表达（ 图2B，箭头）。这些数据表明BEC转换到时严重的肝细胞损失的肝细胞，其进一步通过永久谱系追踪19证实。
图1.斑马鱼肝损伤模型。（A）计划说明甲硝唑治疗和肝再生的周期。 （ 二）36小时甲硝唑治疗大大减少肝脏大小和fabp10a：CFP和fabp10a：红色荧光蛋白的荧光R0H;然而，强大的CFP和红色荧光蛋白的荧光在重新出现R30h。箭头指向的肝脏（LI）。 （C）共焦投影视图整个肝脏免疫染色与标记的BEC抗ALCAM抗体。肝内胆管网络被坍塌R0H但迅速重新建立在R54h。虚线轮廓区域的肝脏。比例尺：100（B），20（C）微米请点击此处查看该图的放大版本。
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图2. BEC中产生时严重的肝细胞损失的肝细胞的肝脏的（A） 的共焦投影视图表示HNF4α（绿）和TP1：H2B-mCherry（红色）的表达在R0H。 （b）显示fabp10a共焦单光部分的图像：CFP-NTR（灰色）和TP1：H2B - mCherry（红色）的表达在肝脏中。 mCherry表达透露反mCherry免疫。注意在CFP +肝细胞（箭头）核弱mCherry表达。强mCherry +细胞是建筑物能源效益守则。比例尺：20微米请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
严重的，但不是轻微，肝细胞消融引起胆道驱动的肝脏再生。 CFP-NTR基因：因此，以下甲硝唑治疗和清洗，以检查甲硝唑处理的幼虫，其可以通过固有的CFP荧光从fabp10a进行评估的肝脏大小是重要的。由于甲硝唑处理幼虫将显示非烧蚀（0-5％）或部分烧蚀（10-20％）的肝脏的一小部分，它是必不可少的梳理和只分析幼虫具有一个非常小的肝脏，这表明严重肝切除。
尽管在我们的协议中，我们处理的斑马鱼幼体与甲硝唑为3.5至5旦（一个36小时的治疗期），可替代的阶段和甲硝唑治疗的持续时间也是可能的。例如，幼虫处理5至6旦（24小时处理期）也表现出严重的肝切除，类似于上述36小时的治疗期。独立产生的另外两个组类似fabp10a：NTR转基因品系，也报告了胆驱动肝再生以下肝细胞特异性消融的过程。而一组处理过的幼虫与甲硝唑的6至7旦21，另一个这样做是从3.5到4.5旦，达到类似的结论20。由于每个fabp10a：NTR转基因系可以表现出不同水平的NTR表达，甲硝唑治疗的持续时间和剂量应分别为每个所使用的转基因系的测定。它也可能是有用的，以生成与NTR基因，其中的引进三个点突变导致增加在其酶活性26的增强版本的转基因线。这种突变的NTR将导致更快的烧蚀事件比野生型NTR 26。这是特别有利的，当野生型NTR动力学可以在所希望的阶段限制的完整细胞消融的可能性。
由于数百幼虫可以同时经历肝切除，此斑马鱼肝损伤模型可应用于化学筛选，以确定小分子，可以抑制或增加胆汁驱动肝再生。例如，使用此模型中，申集团在佐治亚理工学院进行的化学屏幕，发现了几个Wnt信号激动剂和拮抗剂缺口的促进肝细胞再生20。我们还进行了小规模的化学屏幕，确定了几个化合物能抑制肝再生（SK，TYC，JS，和DS，在准备）。
标记分析了人类建议的BEC可以在病肝5,6促进肝细胞的再生。万利斯博士的小组最近报道，实质在倒退肝硬化的大百分比似乎是从LPCS / BEC中衍生的人类27，这意味着在肝硬化回归BEC驱动肝脏再生的重要性。鉴于这一事实，BEC中主要有助于在这里所描述的斑马鱼肝损伤模型中再生肝细胞，这种模式将是一个宝贵的工具，以确定潜在的BEC驱动的肝脏再生的细胞和分子机制。了解这种机制将提供显著见解如何加强重症肝病先天肝脏再生。此外，与化学屏幕组合，这种斑马鱼模型可以是在识别一个潜在的药物可促进在人类患者先天肝再生是有用的。
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Disclosures
作者宣称，他们有没有竞争的财务权益。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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