Abstract
간은 재생 할 수있는 좋은 능력을 가지고있다. hepatocyte- 또는 담즙 중심의 간 재생 : 간세포, 간 실질 세포는 두 가지 방법 중 하나를 다시 생성 할 수 있습니다. 담즙 중심의 재생에, 재생 간세포가 담도 상피 세포 (BECS)에서 파생 된 반면 간세포 중심의 간 재생에 재생 간세포는, 기존의 간세포에서 파생됩니다. 간세포 중심의 간 재생에 크게 간 재생의 현재 이해에 기여한 우수한 설치류 모델이 있습니다. 그러나, 이러한 설치류 모델은 담즙 중심의 간 재생에 존재하지 않습니다. 우리는 최근에 BECS 광범위 심한 간세포 손실시 간세포을 야기하는 제브라 피쉬 간 손상 모델에보고했다. 이 모델에서, 간세포는 특히 약물 유전 학적 방법으로 절제되어있다. 여기에서 우리는 간세포를 브레이션과 BEC 중심의 간 재생 과정을 분석하는 상세 방법을 제시한다.이것은 간세포 특이 절제 모델은 또한 담즙 중심 간 재생의 기본 분자 세포 메커니즘을 발견하는데 사용될 수있다. 더욱이, 이러한 방법은 보강 또는 간 재생을 억제 작은 분자를 식별하는 화학 스크린에 적용될 수있다.
Introduction
간은 고도로 회생 기관이다. 간 재생 중에 간세포를 재생, 간 실질 세포, 간세포 선재 (간세포 중심 간 재생) 또는 BECS (담도 중심 간 재생) -1,2-로부터 유도된다. 간 손상은 일반적으로 기존의 간세포의 증식을 유도한다; 간세포 증식가 손상된 경우에는, BECS 2-4 간세포에 기여할 수있다. 간 재생이 두 모드는 임상 적으로 중요하다. (인해 간 종양 또는 라이브 간 도너의 예), 인간 간 부분의 수술 제거하여 남은 간세포가 간에서 간 질량 손실을 복구하기 위해 증식. BECS 간 또는 전구 세포 (된 LPC)는 간세포의 재생에 기여하는 5,6- 나타나도록 반대로, 중증 간 질환 환자에서, 간세포 증식이 크게 손상된다. 설치류 2/3 부분 절제술 모델있는간세포가 잃어버린 간 질량을 복구 할 증식, 크게 간세포 중심의 간 재생 7,8의 현재 이해에 기여하고있다. 그러나, 재생 간세포가 주로 BECS에서 파생되는 유효한 설치류 모델이 없습니다. 여러 설치류 간 독소 모델 담즙 중심의 간 재생 2-4의 식별을 주도하지만, 생쥐에서 최근 혈통 추적 연구는 이러한 모델 9,10에서 간세포 재생에 BECS 최소한의 기여를 나타냅니다. 부분 간절 11-13 및 아세트 아미노펜 유도 간 손상을 포함 14,15 쥐 간 손상 모델의 일부는 제브라 피쉬인가 간 재생에 관여하는 유전자 또는 신규 경로의 식별을 주도하고있다. 그러나 간세포가 주도하지만, BEC-구동되지, 간 재생이 제브라 피쉬의 간 손상 모델에서 발생합니다. 따라서, 신규의 간 손상 모델되는 BECS 광범위 regenerat 기여간세포를 보내고하는 BEC 중심의 간 재생의 더 나은 이해를 위해 필요하다.
간세포 절제 모델의 전체적인 목적은 (1) BECS 광범위 재생 간세포에 기여하고, (2) BEC 중심 간 재생을 기본 분자 세포 메커니즘을 규명 된 간 손상 모델을 생성하기 위해 여기에 설명. 우리는 부상의 정도가 간 재생의 모드를 결정한다는 가정; 따라서, 우리는 담즙 중심의 간 재생이 심한 간세포 손상에 시작할 것이라고 예측했다. 이 가설을 테스트하기 위해, 우리는 유전자 변형 라인을 생성하여 제브라 피쉬의 간 손상 모델을 개발, Tg는 (fabp10a : CFP-NTR) S931, 즉 높은 간세포 특이 fabp10a에서 시안 형광 단백질 (CFP)와 융합 박테리아 Nitroreductase (NTR)를 표현 발기인. NTR은 세포 독성 약물에 비 독성 전구 약물, 메트로니다졸 (MTZ)를 변환하기 때문에, 단지 의도 절제한다 NTR-이 경우에는, 세포를 16-18을 발현, 간세포. MTZ 치료의 지속 시간을 조작함으로써, 간세포 박리의 정도를 제어 할 수있다. 이 모델을 사용하여, 우리는 최근 심한 간세포 손실시 BECS 광범위 또 다른 두 개의 독립적 인 연구에 의해 확인 하였다 (20, 21)의 재생 간세포 (19)을 야기한다는보고. 따라서, 상기 설치류 및 지브라 피쉬 간 손상 모델에 비해, 우리 간세포 절제 모델 BEC 중심 간 재생을 연구하는데 더욱 유리하다.
이 프로토콜은 제브라 간세포 절제 모델을 사용하여 간 재생 실험을 수행하기위한 절차를 설명한다. 이 모델은 담즙의 중심 간 재생을 기본 메커니즘을 결정하기위한 화학 화면을 억제 또는 간 재생을 보강 할 수 있습니다 작은 분자를 식별하기에 적합합니다.
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Protocol
Zebrafish의 표준 절차에 따라 제기 자란; 실험은 피츠버그 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
배아 / 애벌레 1. 준비
- 시간 제한 교배, 설정 성인 남성과 여성의 Tg (fabp10a : CFP-NTR) 수행 S931 hemizygous 또는 동형 접합체 물고기 O / N과 그들 사이에 디바이더를 배치합니다. 상대가 요구 될 때이 분할에게 다음 아침을 제거합니다. 미세 플라스틱 메쉬 스트레이너를 사용하여 물을 긴장에 의해 배아를 수집합니다.
- 거꾸로 스트레이너를 켜고 스퀴즈 병에서 분배 계란 물 좋은 스트림과 메쉬 표면을 씻어. 계란 물 25 ㎖로 100mm 배양 접시에 100 배아를 전송합니다. 페트리 접시 당 최대 100 배아를 유지하지 않고 28 ℃에서을 올립니다.
- 색소 침착을 억제하기 위해, 10 시간 포스트 수정 (HPF) 이전에 배양 접시에 페닐 티오 (PTU)를 추가, 전자를 제기80 HPF까지 mbryos / 애벌레. PTU의 최종 농도는 0.2 mm이다. 주의 : PTU 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다.
- 배양 접시에, 0.016 %의 최종 농도에서 3- 아미노 벤조산 에틸 에스터 (Tricaine)을 첨가하여 애벌레를 마취. 그런 다음, 표면 형광 현미경 종류 CFP 양성 유충을 사용. 비슷한 간 크기의 애벌레를 사용하여 작거나 큰 간을 가진 사람을 버린다.
주 : hemizygous 동형 접합체 유충 사이 간세포 박리의 정도에 차이가 없기 때문에 어떤 CFP 양성 유충 관계없이 강도를 사용할 수있다. 주의 : tricaine 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다. - Tricaine을 포함하는 계란 물을 제거하고 0.2 mM의 PTU 보충 계란 물을 추가합니다. 28 ° C에서 배아 / 애벌레를 유지합니다.
2. MTZ 치료
- 1 MTZ 분말 0.171 g을 용해하여 신선한 10 mM의 MTZ 솔루션을 준비00 ml의 달걀 물은 0.2 % DMSO 0.2 mM의 PTU 보충. 완전히 MTZ를 해산하기 위해 20 ~ 30 분 동안 신속하게 교반하면서 실온에서 솔루션을 섞는다. MTZ를 준비 할 때 MTZ을 용해하기 위해 및 유충에 MTZ 투과을 향상시키기 위해, DMSO를 추가합니다. 주의 : 장기간 노출 또는 MTZ의 증가 농도는 독성이다. 적절한 처리 지침에 따라 사용합니다.
- 두 개의 서로 다른 100mm 페트리 접시 또는 멀티 웰 플레이트에 유충의 원하는 번호를 전송하여 제어 및 실험 그룹으로 유충을 분리합니다. 실험군의 경우, 10 mM의 MTZ 용액 유충을 유지; 대조군을 위해, 0.2 % DMSO를 함유하는 달걀 물에 보관.
- 플레이트 또는 MTZ의 광 불 활성화를 막기 위해 알루미늄 호일로 MTZ 용액을 함유하는 페트리 접시를 커버하고, 28 ° C에서 배양한다. MTZ 치료 기간은 애벌레 단계 및 형질 전환 라인에 의존한다.
- 비슷한 심한 간세포 절제를 관찰하려면
담즙 중심의 간 재생 3. 분석
- 절제 기간의 끝에서, 판에서 MTZ 용액을 제거한다. 계란 물 25 ㎖를 추가하여 MTZ 처리 유충을 씻으십시오. 계란 물을 폐기하기 전에 유충을 씻어 판을 2 ~ 3 회 소용돌이 친다. 세 번 반복 한 후 다시 한 번 달걀 물에 애벌레를 체험. 유충 고정화, 0.008 %의 최종 농도에서 Tricaine의 낮은 농도를 추가 MTZ 처리 된 유충 심장 부종 및 유생 사망을 방지한다.
- 간 기능 분석을 위해, CFP 필터 표면 형광 현미경 MTZ 처리 된 유충의 간 크기를 조사한다. 간 상대적인 크기에 기초하여 간세포 박리 수준을 평가 : 대 (비 절제 0-10 %의 유충), 중간 (부분적으로 절제하는 단계; 10-20 %), 및 완전히 절제 (매우 작은; 80~90%).
- 비 절제된 또는 부분적으로 절제 간와 유충을 제거합니다. 만 심각한 간세포 절제 나타내는 작은 간으로 유충을 유지합니다. 재생 0 시간 시점 (R0H)에서 간 분석을 위해, MTZ의 세척 및 CFP 정렬 후 유충을 수확. 그렇지 않으면, 수확에 대한 준비가 될 때까지 0.2 mM의 PTU 보충 달걀 물에 정렬 된 유충을 유지합니다.
- 1.5 ml의 microcentrifuge 관에 수확 유충을 전송하고 PEM 버퍼에 3 %의 포름 알데히드의 고정 솔루션 계란 물을 교체합니다. 회 전자의 O / N에서 4 ° C의에 튜브를 품어.
- PBSDT 1 ㎖로 고정 솔루션을 교체하고 5 분 동안 회전에 애벌레가 들어있는 튜브를 회전.
- 수동으로 해부 현미경 노른자와 가슴 지느러미를 제거, 100mm 페트리 접시 PBSDT를 포함하고 집게를 사용으로 고정 된 유충을 전송합니다. 1.5 ML 튜브에 20 해부 유충 TP까지 전송합니다. <리> 차단 솔루션 1 ml의 PBSDT 솔루션을 교체하고 2 시간 동안 실온에서 회 전자에 튜브를 바위.
- 일차 항체를 함유 용액을 차단 100 ㎕로 차단 솔루션 교체합니다. 천천히 회전의 O / N에서 4 ° C의에 튜브를 바위.
- 10 분마다 5 회 차 항체 용액을 제거하고 PBSDT 씻어. 그런 다음 차 항체를 포함하고 2 시간 동안 실온에서 회 전자에 바위 차단 솔루션의 100 UL를 추가합니다.
- 회 전자에 흔들어 실온에서 10 분마다에 대한 PBSDT 5 회 반복한다.
- 현미경 슬라이드에 옆으로 유충의 방향과 설치 미디어의 한 방울을 추가합니다. 조심스럽게 커버 유리로 커버 및 손톱 광택제와 커버 글래스를 밀봉. 지금, 그것은 공 초점 현미경에 대한 준비가되어 있습니다.
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Representative Results
3.5 DPF 5에 극적으로 감소 간 크기 (그림 1B)에서 36 시간 (A36h,이 절제를 의미)에 대한 MTZ 처리. CFP-NTR 및 fabp10a : MTZ의 세척 한 후, 간 재생 (R), 강한 fabp10a의 시작으로 간주을 DsRed 발현 30 시간 (그림 1B)에서 다시 나타났다. 간내 담즙 네트워크 BECS (22)의 막에 존재 ALCAM의 발현에 의해 평가로, 초기 붕괴 그러나 54 시간의 후 세척 (R54h) (그림 1C)에 다시 설립되었다. 이러한 데이터는 간 재생과 회복이 빠른 속도로 우리의 간 손상 모델에서 발생하는 것을 나타냅니다.
그림 2는 재생 간세포가 BECS에서 파생 된 것을 알 수있다. Tg는 (TP1 : H2B-mCherry) s939 라인은 RBP-12 Jĸ 결합 부위 (23)를 포함하는 요소의 제어하에 핵 적색 형광 단백질을 발현. 이 노치 RESPOnsive 소자 간 24 BECS 독점적으로 유전자 발현을 구동하도록 나타난다; 그러나, 노치 신호 밀접 된 LPC (25)에 관련되어 있기 때문에 된 LPC에서 유전자 발현을 구동하는 것이 가능하다. 그러므로,이 트랜스 제닉 라인 BEC 쉽게 검출 가능하고, 아마도 LPC, 핵. 또한, H2B-mCherry 융합 단백질 허가 단기 혈통 추적의 안정성 확장. R0H에서 재생 간에서 H2B - mCherry + 세포 대부분은 제어 간에서, BECS에서 간세포로 표현된다 Hnf4α (그림 2A), 아니지만를 표명했다. 간세포, fabp10a에 의해 평가로 : H2B - mCherry 표현 (그림 2B, 화살표) : CFP-NTR 식 R48h 여전히 TP1을 유지했다. 이러한 데이터는 더 영구적 인 리니지 19 추적하여 확인 하였다 심한 간세포 손실시 간세포에 BEC 변환을 나타냅니다.
도 1 제브라 간 손상 모델. (A) 방식 MTZ 치료 및 간 재생의 기간을 도시. (B) 36 시간 MTZ 처리는 크게 간 크기 fabp10a 감소 : CFP 및 fabp10a : R0H에서 형광을 DsRed; 그러나, 강한 CFP 및을 DsRed 형광은 R30h에 등장. 화살표는 간 (리)을 가리 킵니다. BECS을 표지 항 ALCAM 항체와 면역 염색 전체 간 (C) 공 초점 투사 전망. 간내 담도 네트워크는 R0H에서 붕괴하지만 빠르게 R54h에 다시 설립되었다. 점선 영역은 간을 설명합니다. 스케일 바 :. (100), (B), 20 (C) μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2. BECS 심한 간세포 손실시 간세포를 야기 할 Hnf4α (녹색)과 TP1 보여주는 간 (A) 공 초점 투사 조회수 :. R0H에서 H2B - mCherry (적색) 식을. (B) fabp10a을 보여주는 하나의 공 초점 광학 섹션 이미지 : (회색) CFP-NTR과 TP1 : 간에서 H2B - mCherry (적색) 식입니다. mCherry 발현 방지 mCherry의 면역 염색에 의해 밝혀졌다. CFP + 간세포 (화살표)의 핵에 약한 mCherry 식을합니다. 강력한 mCherry + 세포는 BECS 있습니다. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
심각한하지만 온화한하지, 간세포 절제는 담즙의 중심 간 재생을 유도한다. CFP-NTR 트랜스 : 따라서 MTZ 처리 및 세척을 다음, 그것은 fabp10a에서 극한 CFP 형광에 의해 평가 될 수 MTZ 처리 된 유충의 간 크기를 조사하는 것이 중요하다. 절제된 비 (0~5%) 또는 부분 (10 내지 20 %의) 간 절제를 표시 MTZ 처리 애벌레의 적은 비율 때문에, 소트 및 매우 작은 간으로 유충을 분석하는 것이 필수적이다 심한 간세포 절제를 나타낸다.
우리의 프로토콜에서, 우리는 5 DPF (36 시간 처리주기)에서 3.5으로 MTZ 제브라 유충을 처리하지만, 다른 단계 및 MTZ 처리 시간도 가능하다. 예를 들면, 애벌레는 5 내지 36 시간, 상기 처리 기간 유사한 6 DPF (24 시간 치료 기간)도 나타냈다 심한 간세포 절제로 처리 하였다. 두 개의 추가 그룹은 독립적으로 생성비슷한 fabp10a : NTR 형질 전환 라인은 간세포 특이 적 절제 다음 담즙 중심의 간 재생의 과정을 보도했다. 한 그룹은 21 DPF 6-7 MTZ와 유충을 처리하는 반면, 다른 유사한 결론 (20)에 도달, 3.5에서 4.5 DPF에 그렇게했다. 각 fabp10a 버젼 : NTR 트랜스 제닉 라인 NTR 발현의 다른 레벨을 나타낼 수 있고, MTZ 치료 기간, 투여 량은 사용되는 트랜스 제닉 라인들 각각에 대해 개별적으로 결정되어야한다. 또한 세 개의 점 돌연변이의 도입이 효소 활성 (26)의 증가를 초래하는 유전자 NTR의 향상된 버전을 가진 트랜스 제닉 라인을 생성하기 위해 유용 할 수있다. 이 돌연변이는 NTR은 야생형 NTR 26보다 빠른 제거 이벤트가 발생할 것이다. 야생형 NTR 동역학이 원하는 단계에서 전체 셀 박리의 가능성을 제한 할 때 특히 유리하다.
유충의 수백 이후동시에 간세포 어블을 겪을 수 있으며,이 제브라 간 손상 모델을 억제 또는 담즙의 중심 간 재생 보강 수있는 작은 분자를 식별하기 위해 화학 스크린에 적용될 수있다. 예를 들어,이 모델을 사용하여, 조지아 공대 신 기는 화학적 화면을 수행하고 몇몇의 Wnt 작용제 및 간 재생에 노치 (20)를 용이 길항제를 발견했다. 또한 소규모 화학 화면을 수행하고 (제조에서, SK, TYC, JS, 그리고 DS) 간 재생을 억제 할 수있는 여러 가지의 화합물을 확인 하였다.
인간 BECS이 간 질환에 5,6- 재생 간세포에 기여할 수 있음을 시사 마커 분석. 박사 Wanless '그룹은 최근 회귀 간경변에 실질의 큰 비율은 간경변의 회귀에 BEC 중심의 간 재생의 중요성을 의미, 인간 27 년 된 LPC / BECS에서 파생 된 것으로 보인다 보도했다. 사실 그 감안할 때 BECS 주로여기에 설명 제브라 간 손상 모델에서 간 세포의 재생에 기여하는이 모델은 BEC 중심 간 재생을 기본 세포 및 분자 메커니즘을 결정하는 매우 중요한 도구가 될 것이다. 이러한 메커니즘을 이해하는 것은 심각한 간 질환 환자에서 타고난 간 재생을 증가하는 방법에 대한 중요한 통찰력을 제공 할 것입니다. 또한, 화학 스크린 조합이 제브라 피쉬 모델은 인간 환자에 선천적 간 재생을 용이하게 할 수있는 잠재적 인 약물을 확인하는데 유용 할 수있다.
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Disclosures
저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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