Abstract
जिगर को पुनर्जीवित करने के लिए एक महान क्षमता है। Hepatocyte- या पित्त चालित जिगर उत्थान: hepatocytes, जिगर की कोशिकाओं parenchymal, दो तरीकों में से एक में पुनर्जीवित कर सकते हैं। पित्त संचालित उत्थान में, regenerating hepatocytes पित्त उपकला कोशिकाओं (BECs) से प्राप्त कर रहे हैं, जबकि hepatocyte चालित जिगर उत्थान में, regenerating hepatocytes, preexisting hepatocytes से निकाली गई है। Hepatocyte चालित जिगर के उत्थान के लिए भी महत्वपूर्ण है, जिगर उत्थान के वर्तमान को समझने के लिए योगदान दिया है कि उत्कृष्ट कृंतक मॉडल हैं। हालांकि, ऐसी कोई कृंतक मॉडल पित्त चालित जिगर के उत्थान के लिए मौजूद है। हमने हाल ही में BECs बड़े पैमाने पर गंभीर hepatocyte नुकसान पर hepatocytes को जन्म दे, जिसमें एक zebrafish जिगर चोट मॉडल को सूचना दी। इस मॉडल में, hepatocytes विशेष रूप से एक फार्माकोजेनेटिक साधन के द्वारा ablated कर रहे हैं। यहाँ हम hepatocytes काटकर अलग करने के लिए और बीईसी चालित जिगर पुनर्जनन प्रक्रिया का विश्लेषण करने के लिए विस्तार से तरीकों को प्रस्तुत करते हैं।इस hepatocyte-विशिष्ट पृथक मॉडल आगे पित्त चालित जिगर उत्थान के अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, इन तरीकों को बढ़ाने या जिगर पुनर्जनन को दबाने कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए रासायनिक स्क्रीन करने के लिए लागू किया जा सकता है।
Introduction
जिगर एक बेहद पुनर्योजी अंग है। जिगर उत्थान के दौरान, hepatocytes regenerating, जिगर की कोशिकाओं parenchymal, पूर्व मौजूदा hepatocytes (hepatocyte चालित जिगर उत्थान) या BECs (पित्त चालित जिगर उत्थान) 1,2 से निकाली गई है। जिगर चोट आम तौर पर पहले से मौजूद hepatocytes के प्रसार elicits; hepatocyte प्रसार समझौता किया है हालांकि, जब BECs 2-4 hepatocytes के लिए योगदान कर सकते हैं। जिगर उत्थान के इन दो मोड चिकित्सकीय महत्वपूर्ण हैं। (क्योंकि जिगर ट्यूमर या जी जिगर दाताओं के जैसे,) मानव जिगर के एक हिस्से के सर्जिकल हटाने पर, शेष जिगर में hepatocytes खो जिगर बड़े पैमाने पर ठीक करने के लिए पैदा करना। BECs या जिगर पूर्वज कोशिकाओं (LPCs) regenerating hepatocytes 5,6 करने के लिए योगदान करने के लिए दिखाई देते हैं, इसलिए है कि इसके विपरीत, गंभीर जिगर की बीमारियों के साथ रोगियों में, hepatocyte प्रसार बहुत समझौता किया है। कृंतक 2/3 आंशिक hepatectomy मॉडल, जिसमेंhepatocytes खो जिगर बड़े पैमाने पर ठीक करने के लिए पैदा करना, काफी hepatocyte चालित जिगर उत्थान 7,8 की वर्तमान समझ के लिए योगदान दिया है। हालांकि, regenerating hepatocytes मुख्य रूप से BECs से निकाली गई है, जिसमें कोई वैध कृंतक मॉडल है। कई कृंतक जिगर विष मॉडल पित्त चालित जिगर उत्थान 2-4 की पहचान करने के लिए नेतृत्व हालांकि, चूहों में हाल ही वंश अनुरेखण पढ़ाई इन मॉडलों 9,10 में hepatocytes regenerating के लिए BECs की एक न्यूनतम अंशदान संकेत मिलता है। आंशिक hepatectomy 11-13 और एसिटामिनोफेन प्रेरित जिगर की क्षति 14,15 सहित कृंतक जिगर चोट मॉडलों में से कुछ, zebrafish करने के लिए आवेदन किया है और जिगर उत्थान में फंसा उपन्यास जीन या रास्ते की पहचान करने के लिए नेतृत्व किया गया है। हालांकि, hepatocyte संचालित है, लेकिन बीईसी संचालित नहीं, जिगर उत्थान इन zebrafish जिगर चोट मॉडल में होता है। इसलिए, एक उपन्यास जिगर चोट मॉडल जिसमें BECs बड़े पैमाने पर regenerat के लिए योगदानhepatocytes आईएनजी बीईसी चालित जिगर उत्थान का एक बेहतर समझ के लिए आवश्यक है।
hepatocyte पृथक मॉडल के समग्र लक्ष्यों (1) BECs बड़े पैमाने पर regenerating hepatocytes में योगदान है, और (2) बीईसी चालित जिगर उत्थान अंतर्निहित आणविक और सेलुलर तंत्र को स्पष्ट जिसमें एक जिगर चोट मॉडल उत्पन्न करने के लिए कर रहे हैं यहाँ का वर्णन किया। हम चोट की गंभीरता जिगर उत्थान की विधा को निर्धारित करता है कि धारणा है; इस प्रकार, हम पित्त चालित जिगर उत्थान गंभीर hepatocyte चोट पर आरंभ होता है कि भविष्यवाणी की। इस परिकल्पना का परीक्षण करने के लिए, हम एक ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करके एक zebrafish जिगर चोट मॉडल विकसित की है, टीजी (fabp10a: सीएफपी-एनटीआर) s931, कि अत्यधिक hepatocyte-विशिष्ट fabp10a तहत सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी) के साथ जुड़े हुए बैक्टीरियल Nitroreductase (एनटीआर) को व्यक्त करता है प्रमोटर। एनटीआर एक साइटोटोक्सिक दवा में गैर विषैले प्रोड्रग, metronidazole (खेला), धर्मान्तरित के बाद से, यह केवल इरादा ablates NTR-इस मामले में, कोशिकाओं 16-18 व्यक्त hepatocytes। खेला इलाज की अवधि से छेड़छाड़, hepatocyte पृथक की हद तक नियंत्रित किया जा सकता है। इस मॉडल का उपयोग करना, हम हाल ही में गंभीर hepatocyte हानि होने पर, BECs बड़े पैमाने पर आगे दो अन्य स्वतंत्र अध्ययन 20,21 द्वारा पुष्टि की गई है, जो regenerating hepatocytes 19 को जन्म दे कि सूचना दी। इसलिए, इस aforementioned कृंतक और zebrafish जिगर चोट मॉडल की तुलना में, हमारे hepatocyte पृथक मॉडल बीईसी चालित जिगर उत्थान के अध्ययन के लिए अधिक फायदेमंद है।
इस प्रोटोकॉल के लिए zebrafish hepatocyte पृथक मॉडल का उपयोग कर जिगर उत्थान प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए प्रक्रिया का वर्णन करता है। इस मॉडल पित्त चालित जिगर उत्थान अंतर्निहित तंत्र का निर्धारण करने के लिए और रासायनिक स्क्रीन को दबाने या जिगर उत्थान बढ़ाने कर सकते हैं कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए उपयुक्त हो जाएगा।
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Protocol
Zebrafish मानक प्रक्रिया के अनुसार उठाया और नस्ल थे; प्रयोगों पिट्सबर्ग संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के विश्वविद्यालय द्वारा अनुमोदित किया गया।
भ्रूण / लार्वा के 1. तैयारी
- समय पर matings की स्थापना की वयस्क पुरुष और महिला टीजी (fabp10a: सीएफपी-एनटीआर) संचालन करने के लिए s931 hemizygous या समयुग्मक मछलियों हे / एन और उन दोनों के बीच एक विभक्त जगह है। संभोग वांछित है जब इस विभक्त निम्नलिखित सुबह निकालें। ठीक एक प्लास्टिक की जाली झरनी का उपयोग कर पानी के दबाव से भ्रूण लीजिए।
- उल्टा झरनी मुड़ें और एक निचोड़ बोतल से तिरस्कृत अंडे पानी का जुर्माना धारा के साथ जाल सतह कुल्ला। अंडे पानी के 25 एमएल के साथ एक 100 मिमी पेट्री डिश में 100 भ्रूण स्थानांतरण। पेट्री डिश प्रति कोई 100 से अधिक भ्रूण रखें और 28 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें बढ़ा।
- रंजकता को बाधित करने के लिए, 10 घंटा बाद निषेचन (HPF) के लिए पहले पेट्री डिश में phenylthiourea (पी टी यू) जोड़ने के लिए, और ई उठाना80 HPF तक mbryos / लार्वा। पी टी यू के अंतिम एकाग्रता 0.2 मिमी है। चेतावनी: पी टी यू विषैला होता है। उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार प्रयोग करें।
- पेट्री डिश में, 0.016% की एक अंतिम एकाग्रता में, 3-अमीनो benzoic एसिड एथिल एस्टर (Tricaine) जोड़कर लार्वा anesthetize। फिर, एक epifluorescence माइक्रोस्कोप, की तरह सीएफपी पॉजिटिव लार्वा का उपयोग कर। एक ऐसी ही जिगर के आकार के साथ लार्वा का प्रयोग करें और एक छोटे या बड़े जिगर के साथ उन लोगों त्यागें।
नोट: hemizygous और समयुग्मक लार्वा के बीच hepatocyte पृथक की हद में कोई अंतर नहीं है, क्योंकि किसी भी सीएफपी पॉजिटिव लार्वा, भले ही तीव्रता का इस्तेमाल किया जा सकता है। चेतावनी: tricaine विषैला होता है। उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार प्रयोग करें। - Tricaine युक्त अंडे पानी निकालें और 0.2 मिमी पी टी यू के साथ पूरक अंडा पानी जोड़ें। 28 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण / लार्वा रखें।
2. खेला उपचार
- 1 में खेला पाउडर की .171 छ भंग करके नए सिरे से 10 मिमी खेला समाधान तैयार00 मिलीलीटर अंडे पानी 0.2% DMSO और 0.2 मिमी पी टी यू के साथ पूरक। पूरी तरह से खेला भंग करने के लिए, 20-30 मिनट के लिए तेजी से सरगर्मी के साथ आरटी पर समाधान मिश्रण। खेला तैयारी जब खेला solubilize मदद करने के लिए और लार्वा में खेला पारगमन को बढ़ाने के लिए, DMSO के जोड़ें। चेतावनी: लंबे समय तक निवेश या खेला की वृद्धि की एकाग्रता विषैला होता है। उचित हैंडलिंग दिशा निर्देशों के अनुसार प्रयोग करें।
- दो अलग-अलग 100 मिमी पेट्री डिश या बहु अच्छी तरह से थाली में लार्वा की वांछित संख्या स्थानांतरित द्वारा नियंत्रण और प्रयोगात्मक समूहों में लार्वा अलग करें। प्रयोगात्मक समूह के लिए, 10 मिमी खेला समाधान में लार्वा रखना; नियंत्रण समूह के लिए, 0.2% DMSO युक्त अंडा उन्हें पानी में रहते हैं।
- प्लेटों या खेला की तस्वीर-निष्क्रियता को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ खेला समाधान युक्त पेट्री डिश कवर, और 28 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। खेला इलाज की अवधि के लार्वा चरण और ट्रांसजेनिक लाइन पर निर्भर करता है।
- में इसी तरह के गंभीर hepatocyte पृथक निरीक्षण
पित्त संचालित लिवर उत्थान की 3. विश्लेषण
- पृथक अवधि के अंत में, प्लेटों से खेला समाधान निकालें। अंडे पानी के 25 मिलीलीटर जोड़कर खेला इलाज लार्वा धो लें। अंडे पानी discarding से पहले लार्वा को धोने के लिए थाली में 2-3 बार भंवर। तीन बार दोहराएँ और फिर एक बार और अधिक अंडे पानी में लार्वा विसर्जित कर दिया। लार्वा को स्थिर करने के लिए, 0.008% की एक अंतिम एकाग्रता में, Tricaine के एक कम एकाग्रता जोड़ने के लिए, खेला इलाज लार्वा में दिल शोफ और लार्वा मौत से बचने के लिए।
- जिगर विश्लेषण के लिए, सीएफपी फिल्टर के साथ एक epifluorescence खुर्दबीन के नीचे खेला इलाज लार्वा के जिगर आकार की जांच। रिश्तेदार जिगर आकार के आधार पर hepatocyte पृथक स्तर का आकलन: बड़े (गैर ablated, 0-10% लार्वा), मध्यम (आंशिक रूप से ablated, 10-20%), और पूरी तरह से ablated (बहुत छोटा, 80-90%)।
- गैर ablated या आंशिक रूप से ablated यकृत के साथ लार्वा निकालें। केवल गंभीर hepatocyte पृथक का संकेत है जो एक छोटे से जिगर, साथ लार्वा रहते हैं। उत्थान 0 घंटा समय बिंदु (R0h) में जिगर विश्लेषण के लिए, खेला वार्शआउट और सीएफपी छंटाई के बाद लार्वा फसल। अन्यथा, फसल कटाई के लिए तैयार है जब तक 0.2 मिमी पी टी यू के साथ पूरक अंडे पानी में हल लार्वा रहते हैं।
- एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में काटा लार्वा स्थानांतरण और पीईएम बफर में 3% formaldehyde के निर्धारण के समाधान के साथ अंडा पानी की जगह। एक रोटेटर हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब सेते हैं।
- PBSDT के 1 मिलीलीटर के साथ निर्धारण समाधान बदलें और 5 मिनट के लिए रोटेटर पर लार्वा युक्त ट्यूब बारी बारी से।
- स्वयं एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत की जर्दी और छाती पर का कवच पंख निकालने के लिए, एक 100 मिमी पेट्री डिश PBSDT युक्त और संदंश का उपयोग करने में तय लार्वा स्थानांतरण। एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में 20 विच्छेदित लार्वा TP अप स्थानांतरण। <ली> अवरुद्ध समाधान के 1 मिलीलीटर के साथ PBSDT समाधान बदलें और 2 घंटे के लिए आरटी पर एक रोटेटर पर ट्यूब रॉक।
- प्राथमिक एंटीबॉडी युक्त अवरुद्ध समाधान के 100 μl के साथ अवरुद्ध समाधान बदलें। धीरे-धीरे एक रोटेटर हे / एन में 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब रॉक।
- 10 मिनट के लिए हर बार 5 बार प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान निकालें और PBSDT से धो लें। फिर माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त और 2hr के लिए आरटी पर एक रोटेटर पर इसे रॉक अवरुद्ध समाधान के 100 उल जोड़ें।
- एक रोटेटर पर कमाल से आरटी पर 10 मिनट के लिए हर बार PBSDT के साथ 5 बार धोएं।
- एक खुर्दबीन स्लाइड पर पार्श्विक लार्वा ओरिएंट और बढ़ते मीडिया की एक बूंद जोड़ें। ध्यान से एक गिलास को कवर के साथ उन्हें कवर और एक कील पालिशगर के साथ कवर गिलास मुहर। अब, यह confocal माइक्रोस्कोपी के लिए तैयार है।
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Representative Results
3.5 DPF 5 को नाटकीय रूप से कम जिगर आकार (चित्रा 1 बी) से 36 घंटा (A36h, एक पृथक के लिए खड़ा है) के लिए खेला उपचार। सीएफपी-एनटीआर और fabp10a: खेला वार्शआउट के बाद, जिगर उत्थान (आर), मजबूत fabp10a की शुरुआत के रूप में माना dsRed अभिव्यक्ति 30 घंटा (चित्रा 1 बी) के भीतर निकल आया। intrahepatic पित्त नेटवर्क BECs 22 की झिल्ली में मौजूद है कि ALCAM की अभिव्यक्ति द्वारा मूल्यांकन के रूप में, शुरू में ढह गई लेकिन 54 घंटा के बाद वार्शआउट (R54h) (चित्रा 1C) पर फिर से स्थापित किया गया था। इन आंकड़ों जिगर उत्थान और वसूली तेजी से हमारे जिगर चोट मॉडल में होते हैं कि संकेत मिलता है।
चित्रा 2 regenerating hepatocytes BECs से निकाली गई है कि पता चलता है। टीजी (TP1: H2B-mCherry) s939 लाइन 12 RBP-Jĸ बाध्यकारी साइटों 23 से युक्त एक तत्व के नियंत्रण के तहत एक परमाणु लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करता है। इस पायदान responsive तत्व जिगर 24 में BECs में विशेष रूप से जीन अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए प्रकट होता है; हालांकि, यह पायदान संकेतन बारीकी LPCs 25 से संबंधित है, क्योंकि यह LPCs में जीन की अभिव्यक्ति है कि ड्राइव संभव है। इसलिए, इस ट्रांसजेनिक रेखा बीईसी के लिए आसान पता लगाने के लिए अनुमति देता है, और शायद LPC, नाभिक। इसके अलावा, H2B-mCherry संलयन प्रोटीन परमिट अल्पकालिक वंश अनुरेखण की विस्तारित स्थिरता। R0h पर regenerating जिगर में H2B-mCherry + कोशिकाओं सबसे अधिक नियंत्रण लीवर में, BECs में hepatocytes में व्यक्त किया जाता है जो Hnf4α (2A चित्रा), लेकिन नहीं व्यक्त की है। Hepatocytes, fabp10a द्वारा मूल्यांकन के रूप में: H2B-mCherry अभिव्यक्ति (चित्रा 2 बी, तीर): सीएफपी-एनटीआर अभिव्यक्ति, R48h पर अभी भी TP1 बनाए रखा। इन आंकड़ों के आगे स्थायी वंश 19 अनुरेखण द्वारा पुष्टि की गई है, जो गंभीर hepatocyte नुकसान पर hepatocytes, को बीईसी रूपांतरण संकेत मिलता है।
चित्रा 1. एक zebrafish जिगर चोट मॉडल। (ए) योजना खेला उपचार और जिगर उत्थान की अवधि को दर्शाता हुआ। (बी) 36 घंटा खेला उपचार बहुत जिगर आकार और fabp10a कम: सीएफपी और fabp10a: R0h पर dsRed प्रतिदीप्ति; हालांकि, मजबूत सीएफपी और dsRed प्रतिदीप्ति R30h पर निकल आया। तीर जिगर (ली) को इंगित करें। BECs लेबल किया कि विरोधी ALCAM एंटीबॉडी के साथ immunostained पूरे जिगर (सी) Confocal प्रक्षेपण विचार। intrahepatic पित्त नेटवर्क R0h पर ढह गई लेकिन तेजी से R54h पर फिर से स्थापित किया गया था। बिंदीदार क्षेत्रों जिगर रूपरेखा। स्केल सलाखों:। 100 (बी), 20 (सी) माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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चित्रा 2. BECs गंभीर hepatocyte नुकसान पर hepatocytes को जन्म दे Hnf4α (हरा) और TP1 दिखा जिगर (ए) Confocal प्रक्षेपण दृश्य:। R0h पर H2B-mCherry (लाल) अभिव्यक्ति। (बी) fabp10a दिखा Confocal एकल ऑप्टिकल अनुभाग छवियों: (ग्रे) सीएफपी-एनटीआर और TP1: जिगर में H2B-mCherry (लाल) अभिव्यक्ति। mCherry अभिव्यक्ति विरोधी mCherry immunostaining के द्वारा पता चला था। सीएफपी + hepatocytes (तीर) के नाभिक में कमजोर mCherry अभिव्यक्ति पर ध्यान दें। सशक्त mCherry + कोशिकाओं BECs हैं। स्केल सलाखों:। 20 माइक्रोन इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
गंभीर, लेकिन हल्के नहीं, hepatocyte पृथक पित्त चालित जिगर उत्थान elicits। सीएफपी-एनटीआर transgene: इसलिए, खेला उपचार और वार्शआउट के बाद, यह fabp10a से आंतरिक CFP प्रतिदीप्ति द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है, जो खेला इलाज लार्वा का जिगर आकार की जांच करने के लिए महत्वपूर्ण है। गैर ablated (0-5%) या आंशिक रूप से (10-20%) यकृत ablated प्रदर्शित करेगा खेला इलाज लार्वा का एक छोटा सा प्रतिशत के बाद, इसे सुलझा और केवल एक बहुत छोटा जिगर, साथ लार्वा का विश्लेषण करने के लिए आवश्यक है जो गंभीर hepatocyte पृथक का सूचक है।
हमारे प्रोटोकॉल में, हम 5 DPF (एक 36 घंटा उपचार की अवधि) के लिए 3.5 से खेला साथ zebrafish लार्वा का इलाज किया है, वैकल्पिक चरणों और खेला इलाज की अवधि भी संभव है। उदाहरण के लिए, लार्वा 5 से aforementioned के 36 घंटा उपचार की अवधि के लिए इसी तरह 6 DPF (एक 24 घंटा उपचार की अवधि) भी प्रदर्शित गंभीर hepatocyte पृथक करने के लिए इलाज किया। दो अतिरिक्त समूहों स्वतंत्र रूप से उत्पन्नइसी तरह fabp10a: एनटीआर ट्रांसजेनिक लाइनों और भी hepatocyte-विशिष्ट पृथक निम्नलिखित पित्त चालित जिगर उत्थान की प्रक्रिया को सूचना दी। एक समूह 21 DPF 6-7 खेला साथ लार्वा इलाज किया जबकि, एक और इसी तरह के निष्कर्ष 20 तक पहुंच गया, 3.5 से 4.5 DPF करने के लिए ऐसा किया था। प्रत्येक fabp10a के बाद से: एनटीआर ट्रांसजेनिक लाइन एनटीआर अभिव्यक्ति का एक अलग स्तर प्रदर्शित कर सकते हैं, खेला इलाज की अवधि और मात्रा का इस्तेमाल किया ट्रांसजेनिक लाइन से प्रत्येक के लिए अलग से निर्धारित किया जाना चाहिए। यह भी तीन बिंदु उत्परिवर्तन की शुरूआत अपने enzymatic गतिविधि 26 में वृद्धि हो जाती है, जिसमें एनटीआर जीन, के एक बढ़ाया संस्करण के साथ एक ट्रांसजेनिक लाइन उत्पन्न करने के लिए उपयोगी साबित हो सकता है। इस उत्परिवर्ती एनटीआर जंगली प्रकार एनटीआर 26 की तुलना में एक तेजी से पृथक घटना में परिणाम होगा। जंगली प्रकार एनटीआर कैनेटीक्स एक वांछित स्तर पर पूरा सेल पृथक करने की संभावना को सीमित कर सकता है जब यह विशेष रूप से लाभप्रद है।
लार्वा के सैकड़ों के बादएक साथ hepatocyte पृथक गुजरना कर सकते हैं, इस zebrafish जिगर चोट मॉडल को दबाने या पित्त चालित जिगर उत्थान बढ़ाने कर सकते हैं कि छोटे अणुओं की पहचान करने के लिए रासायनिक स्क्रीन करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, इस मॉडल का उपयोग कर, जॉर्जिया टेक में शिन समूह एक रासायनिक स्क्रीन प्रदर्शन किया और कई Wnt एगोनिस्ट और जिगर उत्थान 20 में मदद की है कि पायदान विरोधी पाया। हम यह भी एक छोटे पैमाने पर रासायनिक स्क्रीन प्रदर्शन किया और (तैयारी में, एस, TYC, जे एस, और डी एस) जिगर पुनर्जनन को दबा सकते हैं कि कई यौगिकों की पहचान की।
मनुष्य BECs रोगग्रस्त जिगर 5,6 में पुनर्जीवित hepatocytes करने के लिए योगदान कर सकते हैं सुझाव दिया है कि में मार्कर का विश्लेषण करती है। डॉ Wanless 'समूह ने हाल ही वहीं सिरोसिस में पैरेन्काइमा का एक बड़ा प्रतिशत सिरोसिस प्रतिगमन में बीईसी चालित जिगर उत्थान के महत्व, जिसका अर्थ है मनुष्य के 27 में LPCs / BECs से प्राप्त किया जा करने के लिए प्रकट होता है कि सूचना दी। तथ्य यह देखते हुए कि BECs मुख्य रूप सेयहाँ वर्णित zebrafish जिगर चोट मॉडल में regenerating hepatocytes में योगदान है, इस मॉडल बीईसी चालित जिगर उत्थान अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र का निर्धारण करने के लिए एक अमूल्य उपकरण होगा। इस तरह के तंत्र को समझना गंभीर जिगर की बीमारियों के साथ रोगियों में जन्मजात जिगर उत्थान बढ़ाने के लिए कैसे में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करेगा। इसके अलावा, रासायनिक स्क्रीन के साथ संयोजन में, इस zebrafish मॉडल मानव रोगियों में जन्मजात जिगर उत्थान में मदद कर सकते हैं कि एक संभावित दवा की पहचान करने में उपयोगी हो सकता है।
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Disclosures
लेखकों वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि घोषणा।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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