Abstract
Il fegato ha una grande capacità di rigenerarsi. Gli epatociti, le cellule parenchimali del fegato, può rigenerare in uno di due modi: rigenerazione epatica hepatocyte- o biliare-driven. In rigenerazione del fegato epatociti-driven, epatociti rigeneranti sono derivati da epatociti preesistenti, mentre, nella rigenerazione biliare-driven, epatociti rigeneranti sono derivati da cellule epiteliali biliari (BECS). Per la rigenerazione del fegato epatociti-driven, ci sono ottimi modelli di roditori che hanno significativamente contribuito alla attuale comprensione della rigenerazione epatica. Tuttavia, non esiste tale modello roditore per la rigenerazione epatica biliare-driven. Recentemente abbiamo riportato su un modello di danno epatico zebrafish in cui BEC ampiamente danno luogo a epatociti sul grave perdita degli epatociti. In questo modello, gli epatociti sono specificamente asportate da un mezzo di farmacogenetica. Qui vi presentiamo in dettaglio i metodi per l'ablazione epatociti e di analizzare il processo di rigenerazione epatica BEC-driven.Questo modello di ablazione specifici epatociti può essere ulteriormente utilizzato per scoprire i meccanismi molecolari e cellulari alla base della rigenerazione epatica biliare-driven. Inoltre, questi metodi possono essere applicati agli schermi chimici per identificare piccole molecole che aumentano o sopprimono rigenerazione epatica.
Introduction
Il fegato è un organo altamente rigenerativa. Durante la rigenerazione del fegato, rigenerante epatociti, le cellule parenchimali del fegato, sono derivati da epatociti preesistenti (rigenerazione del fegato epatociti-driven) o BEC (rigenerazione epatica biliare-driven) 1,2. Danno epatico solito provoca la proliferazione di epatociti preesistenti; tuttavia, quando la proliferazione degli epatociti è compromessa, BEC può contribuire agli epatociti 2-4. Queste due modalità di rigenerazione epatica sono clinicamente significativi. Dopo la rimozione chirurgica di una porzione di fegato umano (ad esempio, a causa di tumori epatici o donatori di fegato vivi), epatociti nel fegato residuo proliferano per recuperare la massa epatica persa. Al contrario, nei pazienti con malattie epatiche gravi, epatociti proliferazione è notevolmente compromessa, in modo che BECs o cellule progenitrici epatiche (LPC) sembrano contribuire a epatociti rigeneranti 5,6. Il modello di epatectomia roditore 2/3 parziale, in cuiepatociti proliferano a recuperare la massa epatica perso, ha contribuito in modo significativo l'attuale comprensione di epatociti-driven rigenerazione epatica 7,8. Tuttavia, non esiste un modello roditore valido che epatociti rigeneranti sono derivati principalmente da BEC. Sebbene diversi modelli di tossina roditori fegato hanno portato all'identificazione di biliare-driven rigenerazione epatica 2-4, recenti studi lineage tracing in topi indicano un contributo minimo di BEC per rigenerare epatociti in questi modelli 9,10. Alcuni dei modelli di pregiudizio roditori fegato, tra cui epatectomia parziale 11-13 e paracetamolo indotto danni al fegato 14,15, sono state applicate a zebrafish e ha portato alla identificazione di nuovi geni o percorsi implicati nella rigenerazione epatica. Tuttavia, epatociti-driven, ma non BEC-driven, la rigenerazione del fegato si verifica in questi modelli danno epatico zebrafish. Pertanto, un modello di danno epatico romanzo in cui BEC contribuiscono ampiamente a regeneratepatociti zione è necessario per una migliore comprensione della rigenerazione epatica BEC-driven.
Gli obiettivi generali del modello di ablazione epatociti qui descritte sono (1) per generare un modello di danno epatico nel quale BEC contribuiscono ampiamente a epatociti rigeneranti, e (2) chiarire i meccanismi molecolari e cellulari alla base di rigenerazione epatica BEC-driven. Abbiamo ipotizzato che la gravità del danno determina la modalità di rigenerazione epatica; quindi, abbiamo previsto che la rigenerazione epatica biliare-driven avrebbe avviato su gravi lesioni degli epatociti. Per verificare questa ipotesi, abbiamo sviluppato un modello danno epatico zebrafish generando una linea transgenica, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, che altamente esprime nitroreduttasi batterica (NTR) fusa con proteina fluorescente ciano (PCP) sotto il fabp10a specifiche epatociti promoter. Poiché NTR converte il profarmaco non tossico, metronidazolo (Mtz), in un farmaco citotossico, che l'ablazione solo destinato NTR-cellule che esprimono 16-18, in questo caso, gli epatociti. Manipolando la durata del trattamento Mtz, il grado di epatociti ablazione può essere controllato. Utilizzando questo modello, abbiamo recentemente riportato che su di una grave perdita epatociti, BEC ampiamente danno luogo a rigeneranti epatociti 19, che è stato ulteriormente confermato da altri due studi indipendenti 20,21. Pertanto, rispetto al suddetto roditori e modelli danno epatico zebrafish, il nostro modello ablazione epatociti è più vantaggiosa per studiare la rigenerazione epatica BEC-driven.
Questo protocollo descrive la procedura per eseguire esperimenti di rigenerazione del fegato utilizzando il modello di epatociti di ablazione zebrafish. Questo modello sarà opportuno per determinare i meccanismi alla base di rigenerazione epatica biliare-driven e per schermi chimici per identificare piccole molecole in grado di reprimere o aumentare la rigenerazione del fegato.
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Protocol
Zebrafish sono state sollevate e allevati secondo procedura standard; Esperimenti sono stati approvati dalla University of Pittsburgh Istituzionale Animal Care and Use Committee.
1. Preparazione di embrioni / larve
- Per condurre accoppiamenti a tempo, impostare adulti maschi e femmine Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931 pesci hemizygous o omozigoti O / N e inserire un divisore tra di loro. Rimuovere questo divisore il mattino seguente quando si desidera accoppiamento. Raccogliere gli embrioni da sforzare l'acqua con un colino a maglia fine di plastica.
- Girare il filtro a testa in giù e risciacquare la superficie a rete con un bel flusso di acqua uovo erogata da un flacone. Trasferire 100 embrioni in una capsula di Petri 100 mm con 25 ml di acqua uovo. Mantenere non più di 100 embrioni per capsula di Petri e aumentare a 28 ° C.
- Per inibire la pigmentazione, aggiungere feniltiourea (PTU) nelle capsule di Petri prima di 10 ore dopo la fecondazione (HPF), ed aumentare embryos / larve fino a 80 HPF. La concentrazione finale di PTU è 0,2 mM. ATTENZIONE: PTU è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione.
- Anestetizzare le larve aggiungendo 3-amino etil estere benzoico (Tricaine), ad una concentrazione finale di 0,016%, nelle piastre di Petri. Quindi, utilizzando un microscopio a epifluorescenza, larve sorta CFP-positivi. Utilizzare larve con una dimensione del fegato simile e scartare quelli con un fegato più piccolo o più grande.
NOTA: qualsiasi larve CFP-positivi, indipendentemente dall'intensità, può essere utilizzato perché non c'è differenza nel grado di epatociti ablazione tra le larve emizigote e omozigote. ATTENZIONE: tricaine è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione. - Rimuovere l'acqua uovo contenente Tricaine e aggiungere acqua uovo integrato con 0,2 PTU mm. Tenere il embrioni / larve a 28 ° C.
2. Mtz Trattamento
- Preparare fresco soluzione Mtz 10 mM sciogliendo 0,171 g di polvere in 1 MtzAcqua uovo 00 ml integrato con 0,2% PTU mM DMSO e 0,2. Per sciogliere completamente la Mtz, mescolare la soluzione a temperatura ambiente, con una rapida agitazione per 20-30 minuti. Per aiutare solubilizzare Mtz e per migliorare Mtz permeazione in larve, aggiungere DMSO durante la preparazione Mtz. ATTENZIONE: l'esposizione prolungata o un aumento della concentrazione di Mtz è tossico. Utilizzare in conformità con le linee guida appropriate di gestione.
- Separare le larve in gruppi di controllo e sperimentali per il trasferimento di numero desiderato di larve in due diversi 100 mm piatto di Petri o un piatto multi-bene. Per il gruppo sperimentale, mantenere le larve in 10 soluzione Mtz mM; per il gruppo di controllo, tenerli in acqua uovo contenente 0,2% DMSO.
- Coprire le piastre o capsule di Petri contenenti la soluzione Mtz con un foglio di alluminio per evitare che la foto-inattivazione di Mtz, e incubare a 28 ° C. La durata del trattamento Mtz dipende dallo stadio larvale e la linea transgenica.
- Per osservare simile grave ablazione epatociti nella
3. Analisi delle vie biliari-driven rigenerazione del fegato
- Alla fine del periodo di ablazione, rimuovere la soluzione Mtz dalle piastre. Lavare le larve Mtz trattati aggiungendo 25 ml di acqua uovo. Agitare la piastra 2-3 volte per lavare le larve prima di gettare l'acqua uovo. Ripetete per tre volte e poi immergere le larve di nuovo in acqua uovo. Per evitare edema cardiaca e morte larvale nelle larve Mtz trattati, aggiungere una minore concentrazione di Tricaine, ad una concentrazione finale di 0,008%, per immobilizzare le larve.
- Per l'analisi del fegato, esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattati sotto un microscopio a epifluorescenza con il filtro della PCP. Valutare i livelli di ablazione epatociti in base alle dimensioni del fegato relative: grande (non ablazione; 0-10% larve), medio (parzialmente ablated; 10-20%), e molto piccola (completamente ablated; 80-90%).
- Rimuovere le larve con fegati non ablazione o parzialmente ablazione. Tenere larve solo con un minuscolo fegato, che è indicativo di grave ablazione epatociti. Per l'analisi del fegato presso la rigenerazione 0 punto tempo hr (R0h), raccogliere le larve dopo Mtz washout e CFP ordinamento. In caso contrario, mantenere le larve ordinati in acqua uovo integrato con 0,2 PTU mm, fino pronto per la raccolta.
- Trasferire larve raccolte in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e sostituire l'acqua uovo con la soluzione di fissaggio del 3% formaldeide in tampone PEM. Incubare la provetta su un rotatore O / N a 4 ° C.
- Sostituire la soluzione di fissaggio con 1 ml di PBSDT e ruotare il tubo contenente le larve sul rotatore per 5 min.
- Trasferire le larve fissato in una capsula di Petri 100 millimetri contenente PBSDT e usando pinze, rimuovere manualmente tuorlo e pinne pettorali sotto un microscopio da dissezione. Trasferire fino tp 20 larve sezionato in una provetta da 1,5 ml. <li> Sostituisci soluzione PBSDT con 1 ml di soluzione di blocco e Rock il tubo su un rotatore a temperatura ambiente per 2 ore.
- Sostituire soluzione bloccante con 100 ml di soluzione bloccante contenente anticorpi primari. Lentamente rock il tubo su un rotatore O / N a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione di anticorpo primario e lavare con PBSDT 5 volte per 10 minuti ogni volta. Quindi aggiungere 100 ul di soluzione bloccante contenente anticorpi secondari e rock su un rotatore a temperatura ambiente per 2 ore.
- Lavare 5 volte con PBSDT per 10 minuti ogni volta a RT da dondolo su un rotatore.
- Orientare le larve lateralmente su un vetrino e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio. Coprirli con cura con un vetro di copertura e sigillare il vetro di copertura con un lucidatore del chiodo. Ora, è pronto per la microscopia confocale.
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Representative Results
Trattamento Mtz per 36 ore (A36h, A sta per l'ablazione) 3,5-5 dpf ridotto drasticamente le dimensioni del fegato (Figura 1B). Dopo Mtz washout, considerato come l'inizio della rigenerazione epatica (R), forte fabp10a: CFP-NTR e fabp10a: espressione DsRed riapparso in 30 ore (Figura 1B). La rete biliare intraepatica, valutata mediante espressione di Alcam che è presente nella membrana di BECs 22, inizialmente crollata ma fu ripristinata al 54 hr post-washout (R54h) (Figura 1C). Questi dati indicano che la rigenerazione epatica e recupero rapidamente verificano nel nostro modello di danno epatico.
La Figura 2 mostra che epatociti rigeneranti sono derivati da BECs. Il Tg (Tp1: H2B-mCherry) linea S939 esprime una proteina fluorescente rosso nucleare sotto il controllo di un elemento contenente 12 RBP-Jĸ siti di legame di 23. Questo respo Notchelemento nsive sembra guidare l'espressione genica esclusivamente BECs nel fegato 24; tuttavia, è possibile che si spinge l'espressione genica in LPCs perché segnale di Notch è strettamente legato alle LPCs 25. Pertanto, questa linea transgenica consente una facile individuazione di BEC, e probabilmente LPC, nuclei. Inoltre, la stabilità estesa del H2B-mCherry permessi proteina di fusione a breve termine lineage tracing. La maggior parte delle cellule H2B-mCherry + nel fegato rigenerante a R0h espresso Hnf4α (Figura 2A), che si esprime in epatociti, ma non in BEC, nel fegato di controllo. Gli epatociti, come valutato dal fabp10a: Espressione CFP-NTR, a R48h conservavano ancora Tp1: espressione H2B-mCherry (Figura 2B, frecce). Questi dati indicano BEC conversione in epatociti su grave perdita epatociti, che è stato ulteriormente confermato dal lignaggio permanente tracciando 19.
Figura 1. Un modello danno epatico zebrafish. (A) Schema che illustra i periodi di trattamento Mtz e rigenerazione del fegato. (B) 36 ore di trattamento Mtz fortemente ridotte dimensioni del fegato e fabp10a: PCP e fabp10a: DsRed fluorescenza a R0h; tuttavia, forte CFP e DsRed fluorescenza riapparvero a R30h. Le frecce indicano il fegato (li). visite (C) confocale proiezione di tutto il fegato immunostained con anticorpi anti-Alcam che etichettati BEC. La rete biliare intraepatica è crollata a R0h ma rapidamente ripristinata in R54h. Regioni tratteggiate delineano il fegato. Bar Scala:. 100 (B), 20 (C) micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2. BEC danno luogo a epatociti su grave perdita degli epatociti (A) vista confocale proiezione del fegato mostrano Hnf4α (verde) e Tp1:. H2B-mCherry (rosso) espressione in R0h. (B) confocale immagini singole-ottico sezione mostrano fabp10a: CFP-NTR (grigio) e Tp1: H2B-mCherry (rosso) espressione nel fegato. espressione mCherry è stato rivelato da anti-mCherry immunocolorazione. Si noti l'espressione deboli mCherry nei nuclei delle PCP + epatociti (frecce). Cellule Forte mCherry + sono BEC. Bar Scala:. 20 micron Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Grave, ma non mite, epatociti ablazione suscita rigenerazione epatica biliare-driven. Pertanto, dopo il trattamento Mtz e washout, è importante esaminare la dimensione del fegato delle larve Mtz trattato, che può essere valutata intrinseca CFP fluorescenza dal fabp10a: CFP-NTR transgene. Poiché una piccola percentuale di larve Mtz trattati visualizzerà non ablazione (0-5%) o parzialmente ablato (10-20%) fegati, è essenziale per risolvere e solo analizzare le larve con un piccolo fegato, che è indicativo di grave ablazione epatociti.
Anche se nel nostro protocollo, abbiamo trattato larve zebrafish con Mtz 3,5-5 dpf (un periodo di trattamento 36 ore), stadi alternativi e la durata del trattamento Mtz sono inoltre possibili. Ad esempio, le larve trattate dal 5 al 6 dpf (un periodo di trattamento di 24 ore) esposto anche gravi ablazione epatociti, simile al periodo di trattamento 36 hr suddetto. Due gruppi addizionali generati in modo indipendentefabp10a simile: linee transgeniche NTR e riportati anche sul processo di rigenerazione epatica biliare-driven seguito l'ablazione specifiche epatociti. Mentre un gruppo trattato con larve Mtz 6-7 dpf 21, un altro lo ha fatto 3,5-4,5 dpf, giungere a conclusioni analoghe 20. Poiché ogni fabp10a: NTR linea transgenica può presentare un diverso livello di espressione NTR, la durata e il dosaggio del trattamento Mtz dovrebbero essere determinati separatamente per ciascuna linea transgenica utilizzato. Può anche essere utile per generare una linea transgenica con una versione migliorata del gene NTR, in cui l'introduzione di tre mutazioni puntiformi porta ad un aumento della sua attività enzimatica 26. Questo mutante NTR si tradurrà in un evento di ablazione più veloce rispetto al wild-type NTR 26. Ciò è particolarmente vantaggioso quando wild-type NTR cinetica possono limitare la possibilità di ablazione cellula completa in una fase desiderata.
Dal momento che centinaia di larvepuò contemporaneamente subire epatociti ablazione, questo modello danno epatico zebrafish può essere applicato agli schermi chimici per identificare piccole molecole che possono sopprimere o aumentare la rigenerazione epatica biliare-driven. Ad esempio, utilizzando questo modello, il gruppo Shin a Georgia Tech eseguito un schermo chimica e trovato diversi agonisti e antagonisti Wnt Notch che hanno facilitato la rigenerazione del fegato 20. Abbiamo anche eseguito un piccolo schermo chimica scala e identificato numerosi composti che possono sopprimere la rigenerazione del fegato (SK, TYC, JS, e DS, in preparazione).
Marker analizza negli esseri umani hanno suggerito che BEC può contribuire a epatociti rigenerati nel fegato malato 5,6. Gruppo Dr. Wanless 'ha recentemente riferito che una grande percentuale di parenchima nella cirrosi regredito sembra essere derivato da LPCs / BEC negli esseri umani 27, implicando l'importanza della rigenerazione epatica BEC-driven in cirrosi regressione. Dato il fatto che BEC principalmentecontribuire alle epatociti rigeneranti del modello danno epatico zebrafish qui descritto, questo modello sarà uno strumento prezioso per determinare i meccanismi cellulari e molecolari alla base di rigenerazione epatica BEC-driven. La comprensione di tali meccanismi fornirà approfondimenti significativi in come per aumentare la rigenerazione epatica innata nei pazienti con malattie epatiche gravi. Inoltre, in combinazione con schermi chimici, questo modello zebrafish può essere utile per identificare un farmaco potenziale che può facilitare la rigenerazione epatica innata in pazienti umani.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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