Abstract
Karaciğer yenilemek için büyük bir kapasiteye sahiptir. Hepatocyte- veya safra odaklı karaciğer rejenerasyonu: Hepatositler, karaciğer parankim hücreleri, iki yoldan biriyle yeniden olabilir. Safra odaklı rejenerasyonunda, rejenere hepatositler safra epitel hücreleri (BECS) elde edilir, buna karşın, hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyon olarak, rejenere hepatositler, önceden var olan hepatositler elde edilir. Hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyonu için, önemli ölçüde karaciğer rejenerasyonu güncel anlayışa katkıda bulunan mükemmel kemirgen modelleri vardır. Ancak, bu tür kemirgen modeli safra odaklı karaciğer rejenerasyonu için var. Biz son zamanlarda BECS yoğun şiddetli hepatosit kaybı üzerine hepatositlere doğuran hangi bir zebrabalıkları karaciğer yaralanması modelinde bildirdi. Bu modelde, hepatositler, özellikle bir farmakogenetik ile hassa bir şekilde çıkartılır. Burada hepatositlerini aşındırılması için ve BEC odaklı karaciğer rejenerasyon süreci analiz etme yöntemlerini detaylı olarak sunuyoruz.Bu hepatosit özgü ablasyon modeli daha safra odaklı karaciğer rejenerasyon altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmalar keşfetmek için kullanılabilir. Dahası, bu yöntemler, arttırmak ya da karaciğer rejenerasyonu bastırmak küçük molekülleri tanımlamak için kimyasal ekranlar uygulanabilir.
Introduction
Karaciğer oldukça rejeneratif organdır. Karaciğer rejenerasyon sırasında, hepatositler yenileyici, karaciğer parenşimal hücrelerinin, önceden mevcut olan hepatositler (hepatosit güdümlü karaciğer rejenerasyonu) ya da becs (safra güdümlü karaciğer rejenerasyonu) 1,2 elde edilir. Karaciğer hasarı genellikle önceden varolan hepatositlerin çoğalmasını ortaya çıkarır; hepatosit çoğalması tehlikeye ancak, BECS 2-4, hepatositlerin katkıda bulunabilir. Karaciğer rejenerasyon bu iki mod klinik olarak anlamlı olan. (Nedeniyle karaciğer tümörü veya canlı donörlerde örneğin,), insan karaciğer bir kısmının cerrahi olarak çıkarılmasından sonra, geri kalan karaciğerde hepatositler kayıp karaciğer kütlesinin kurtarmak için çoğalır. BECS veya karaciğer progenitör hücrelerin (LPCs) yenileyici hepatositlere 5,6 katkıda görünecek şekilde tersine, ciddi karaciğer hastalığı olan hastalarda, hepatosit proliferasyonu büyük ölçüde tehlikeye düşer. kemirgen 2/3 kısmi hepatektomi modeli, hangihepatositler kayıp karaciğer kitle kurtarmak için çoğalırlar, önemli ölçüde hepatosit odaklı karaciğer rejenerasyonu 7,8 güncel anlayışına katkıda bulunmuştur. Ancak, yenileyici hepatositlerde ağırlıklı BECS türetilmiş olan hiçbir geçerli kemirgen modeli yoktur. Bazı kemirgen karaciğer toksini modelleri safra odaklı karaciğer rejenerasyon 2-4 belirlenmesine yol açmıştır, ancak fareler son soyu takip çalışmalar, bu modellerde 9,10 hepatositleri rejenere etmek BECS asgari bir katkı göstermektedir. Parsiyel hepatektomide 11-13 ve Acetaminophen-induced karaciğer hasarı 14,15 dahil olmak üzere, kemirgen karaciğer zedelenmesi modelleri, bazı zebra balığı uygulanır ve karaciğer rejenerasyonunda oynayan yeni genler veya yolların tespit edilmesine neden olmuştur. Ancak, hepatosit odaklı, ama BEC odaklı değil, karaciğer rejenerasyonu bu Zebra balığı karaciğer hasarı modellerinde oluşur. Bu nedenle, yeni bir karaciğer zedelenme modeli, burada BECS yoğun REGENERAT katkıdahepatositleri ing BEC odaklı karaciğer rejenerasyon daha iyi anlaşılması için gereklidir.
hepatosit ablasyon modelinin genel amaçları (1) BECS yoğun yenileyici hepatositlere katkıda ve (2) BEC odaklı karaciğer rejenerasyonu altında yatan moleküler ve hücresel mekanizmaları aydınlatmak olduğu bir karaciğer hasarı modeli oluşturmak için vardır Burada anlatılan. Biz yaralanmanın şiddeti karaciğer rejenerasyonu modunu belirler hipotezi; Böylece, biz safra odaklı karaciğer rejenerasyonu ağır hepatosit hasarı üzerine başlatmak olacağını öngördü. Bu hipotezi test etmek için, bir transgen doğru, üreten bir zebra balığı karaciğer hasarı modeli geliştirdik, Tg (fabp10a: CFP-NTR) s931, son derece hepatosit özgü fabp10a altında mavi floresan proteinin (CFP) ile birleştirilmiş bakteriyel nitroredüktaz (NTR) eksprese promoteri. NTR bir sitotoksik ilaç haline toksik olmayan ön ilacı, metronidazol (Mtz) dönüştürür olduğundan, sadece amaçlanan ablates NTR-Bu durumda, hücreler 16-18 ifade hepatositler. Mtz tedavi süresini işleyerek, hepatosit ablasyon miktarı kontrol edilebilir. Bu modeli kullanarak, son zamanlarda ciddi hepatosit kaybı üzerine, BECS yoğun daha diğer iki bağımsız çalışmalarla 20,21 tarafından doğrulandı yenileyici hepatositlere 19, yol bildirdi. Bu nedenle, yukarıda belirtilen kemirgen ve Zebra balığı karaciğer hasarı modellere kıyasla, bizim hepatosit ablasyon modeli BEC odaklı karaciğer rejenerasyonu incelemek için daha avantajlıdır.
Bu protokol zebrabalıkları hepatosit ablasyon modeli kullanılarak karaciğer rejenerasyonu deneyler prosedürünü tanımlamaktadır. Bu model safra güdümlü karaciğer rejenerasyonu yatan mekanizmaları belirlemek için kimyasal ekranlar bastırmak veya karaciğer rejenerasyonu artırabilir küçük molekülleri tanımlamak için uygun olacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Zebra balığı, standart prosedüre göre kaldırdı ve yetiştirilen; Deneyler Pittsburgh Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
Embriyolar / larva hazırlanması 1.
- Zamanlanmış çiftleşmelerin kurmak yetişkin erkek ve bayan Tg (fabp10a: CFP-NTR) yürütmek için s931 hemizigot veya homozigot balıklar O / N ve aralarında bir bölücü yerleştirin. Çiftleşme istendiğinde bu bölücü ertesi sabah çıkarın. Ince plastik örgü süzgeç kullanarak suyun süzme ile embriyolar toplayın.
- Baş aşağı süzgeci çevirin ve bir sıkmak şişe dağıtılan yumurta su ince bir dere ile örgü yüzeyi durulayın. Yumurta 25 ml su ile birlikte 100 mm petri kabı içine 100 embriyolar aktarın. Petri başına en fazla 100 embriyolar tutun ve 28 ° C'de onları yükseltmek.
- Pigmentasyon inhibe etmek için, 10 saat sonrası fertilizasyon (hpf) öncesinde petri kutularının içine feniltiyoüre (PTU) ekleyin ve e yükseltmek80 hpf kadar mbryos / larva. PTU nihai konsantrasyonu 0.2 mM'dir. DİKKAT: PTU zehirlidir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın.
- Petri tabaklara, 0.016% bir nihai konsantrasyonda, 3-amino-benzoik asit etil ester (Tricaine) eklenerek larvaları anestezisi. Sonra bir Epifloresans mikroskop, sıralama CFP-pozitif larvaları kullanılarak. Benzer bir karaciğer boyutu ile larvaları kullanın ve daha küçük veya daha büyük karaciğer olanlar atın.
NOT: hemizigot ve homozigoz larvaları arasındaki hepatosit ablasyon ölçüde bir fark yoktur, çünkü herhangi bir CFP pozitif larvaları, bağımsız olarak yoğunluğu, kullanılabilir. DİKKAT: tricaine toksiktir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın. - Tricaine içeren yumurta suyu çıkarın ve 0.2 mM PTU ile desteklenmiş yumurta su ekleyin. 28 ° C embriyolar / larva tutun.
2. Mtz Tedavisi
- In 1 Mtz tozu 0.171 g çözülmesiyle taze 10 mM Mtz çözeltisi hazırlayın00 ml yumurta su% 0.2 DMSO ve 0.2 mM PTU ile desteklenmiş. Tamamen MTZ çözünmesi için 20-30 dakika süreyle hızlı bir şekilde karıştırılarak oda sıcaklığında çözelti karıştırılır. MTZ hazırlarken MTZ çözünür yardımcı olmak ve larva haline Mtz nüfuz artırmak için, DMSO ekleyin. DİKKAT: Uzun süreli maruz kalma veya MTZ artan konsantrasyon zehirlidir. Uygun kullanım talimatlarına uygun olarak kullanın.
- İki farklı 100 mm petri veya çok plaka içine larva istenen sayıda transfer ederek kontrolü ve deneysel gruba larvaları ayırın. Deney grubunda, 10 mM Mtz çözeltisi içinde larvaları tutmak; Kontrol grubu için,% 0.2 DMSO içeren yumurta su saklayın.
- Plakaları veya MTZ foto etkisiz hale getirilmesinin önlenmesi için alüminyum folyo ile Mtz çözeltisi ihtiva eden petri çanakları Kapak, ve 28 ° C'de inkübe edilir. Mtz tedavi süresi larva aşamasında ve transjenik hattı bağlıdır.
- Benzer şiddetli hepatosit ablasyonu gözlemlemek için
Safra odaklı Karaciğer Yenilenme 3. Analiz
- Ablasyon süresinin sonunda, plakalardan Mtz uzaklaştırın. Yumurta 25 ml su ekleyerek Mtz ile tedavi edilen larvalar yıkayın. Yumurta su atılmadan önce larva yıkamak için plaka 2-3 kez girdap. Üç kez tekrarlayın ve sonra bir kez daha yumurta suya larva batırmayın. Larva hareketsiz hale getirmek için,% 0.008 bir nihai konsantrasyonda, Tricaine daha düşük bir konsantrasyonda ekleyin Mtz-, muamele edilmiş larvalarda, kalp ödem ve larva ölümü önlemek için.
- Karaciğer analizi için, OBP filtreli bir Epifloresans mikroskop altında Mtz tedavi edilen larvaların karaciğer boyutunu incelemek. Göreceli karaciğer boyutuna göre hepatosit ablasyon düzeylerini değerlendirmek: Büyük (non-ablasyon;% 0-10 larva), orta (kısmen ablasyon; 02/10% 0), ve tam ablasyon (çok küçük;% 80-90).
- Olmayan ablasyon veya kısmen ablazeydi karaciğerler ile larva çıkarın. Sadece şiddetli hepatosit ablasyon göstergesidir küçük bir karaciğer ile larva tutmak. Rejenerasyon 0 saat zaman noktasında (R0h) karaciğer analizi için, Mtz arınma ve OBP sıralama sonra larva hasat. Aksi takdirde, hasat için hazır olana kadar 0.2 mM PTU ile desteklenmiş yumurta su sıralanır larva tutun.
- 1.5 ml mikrosantrifüj tüp içine hasat larvaları aktarın ve PEM tamponunda% 3 formaldehit tespit çözeltisi ile yumurta suyu değiştirin. Çevirici göre O / N 4 ° C'de inkübe edin tüpü.
- PBSDT 1 ml sabitleme çözeltisi yerine ve 5 dakika rotator larvaları içeren tüp döndürün.
- Elle mikroskop altında yumurta sarısı ve göğüs yüzgeçleri kaldırmak, bir 100 mm petri PBSDT içeren ve forseps kullanarak içine sabit larva aktarın. 1.5 ml tüp içine 20 disseke larva tp kadar aktarın. <li> bloke çözeltinin 1 ml'si ile PBSDT çözeltisi yerine ve 2 saat boyunca oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerinde tüp sallayın.
- Primer antikorları içeren çözüm engelleme 100 ul ile çözüm engelleme değiştirin. Yavaş yavaş bir döndürücü göre O / N 4 ° C'de tüpü sallayın.
- 10 dakika, her seferinde 5 kez birincil antikor çözeltisi çıkarın ve PBSDT ile yıkayın. Daha sonra ikincil antikorlar ihtiva eden ve 2 st için oda sıcaklığında, bir döndürücü üzerine kaya bloke etme çözeltisi 100 ul ilave edin.
- Bir karıştırıcı üzerine sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika, her seferinde PBSDT ile 5 kez yıkayın.
- Bir mikroskop lamı üzerine yanal olarak larvaları Doğu ve montaj ortamı bir damla ekleyin. Dikkatlice bir cam kapak ile onları karşılamak ve bir çivi parlatıcı ile cam kapak mühür. Şimdi, konfokal mikroskopi için hazır hale gelir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
3.5 dpf 5 dramatik azalma karaciğer boyutu (Şekil 1B) 36 saat (A36h, A ablasyon anlamına gelmektedir) için Mtz tedavisi. CFP-NTR ve fabp10a: Mtz arınma sonra, karaciğer rejenerasyonu (R), güçlü fabp10a başlangıcı olarak kabul DsRed ifadesi 30 saat (Şekil 1B) içinde göründü. intrahepatik safra ağı BECS 22 zarda mevcut olan ALCAM ifadesi ile değerlendirildiği gibi, başlangıçta çöktü, ancak 54 saat sonra-arınma (R54h) (Şekil 1C) yeniden kurulmuştur. Bu veriler, karaciğer rejenerasyonu ve kurtarma hızla bizim karaciğer hasarı modelinde meydana geldiğini göstermektedir.
Şekil 2, rejenere hepatositlerde becs elde edildiğini göstermektedir. Tg (Tp1: H2B mCherry) s939 hattı 12 RBP-Jĸ bağlama bölgesi 23 ihtiva eden bir elemanın kontrolü altında nükleer kırmızı flöresanlı proteinin ifade eder. Bu çentik RESPOnsive elemanı karaciğer 24 BECS münhasıran gen sentezlenmesini tahrik etmek için görünür; Bununla birlikte, Çentik sinyal yakın LPCs 25 ile ilgilidir, çünkü LPCs gen ekspresyonunu sağlayan mümkündür. Bu nedenle, bu transjenik soy BEC kolay saptanmasına izin verir ve muhtemelen LPC, çekirdekler. Dahası, H2B mCherry füzyon proteini izinleri kısa vadeli soy izleme genişletilmiş kararlılığı. R0h de rejenere karaciğerde H2B mCherry + hücreleri çoğu kontrol karaciğer, BECS hepatositlerde ifade edilir Hnf4α (Şekil 2A), ama ifade edilmiştir. Hepatositler, fabp10a ile değerlendirilen: H2B mCherry ekspresyonu (Şekil 2B, oklar): CFP-NTR ekspresyonu, R48h hala TP1 korudu. Bu veriler daha kalıcı soy 19 izleme ile teyit edilmiştir ağır hepatosit kaybı üzerine hepatositlerin için BEC dönüşüm gösterir.
Şekil 1. Zebra balığı karaciğer hasarı modeli. (A) Şema Mtz tedavi ve karaciğer rejenerasyonu dönemlerini gösteren. (B) 36 saat Mtz tedavisi büyük ölçüde karaciğer boyutu ve fabp10a azaltılmış: OBP ve fabp10a: R0h at DsRed floresan; Ancak, güçlü CFP ve DsRed floresan R30h de göründü. Oklar karaciğerde (li) işaret etmektedir. BECS etiketli anti-Alcam antikorlar ile boyanmış, tüm karaciğer (C) Konfokal projeksiyon incelemeler. intrahepatik safra ağ R0h de çöktü ama hızla R54h yeniden kurulmuştur. Noktalı bölgeler karaciğer özetlemektedir. Ölçek çubukları:. 100 (B), 20 (C) um bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
_upload / 52785 / 52785fig2.jpg "/>
Şekil 2. BECS şiddetli hepatosit kaybı üzerine hepatositlere doğuran Hnf4α (yeşil) ve TP1 gösteren karaciğer (A) Konfokal projeksiyon manzarası:. R0h de H2B mCherry (kırmızı) ifadesini. (B) fabp10a gösteren Konfokal tek optik kesit görüntüleri: (gri) CFP-NTR ve Tp1: Karaciğerde H2B mCherry (kırmızı) ifadesi. MCherry ifadesi, anti-mCherry immün tarafından ortaya çıkarıldı. CFP + hepatositlerde (oklar) çekirdeklerinde zayıf MCherry ifadesini unutmayın. Güçlü MCherry + hücreleri becs bulunmaktadır. Ölçek çubukları:. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Şiddetli, ama hafif değil, hepatosit ablasyon safra odaklı karaciğer rejenerasyonu ortaya çıkarır. CFP-NTR transgen: Bu nedenle, Mtz tedavi ve annma süresini takiben, bu fabp10a gelen iç CFP floresan tespit edilebilir Mtz-, muamele edilmiş larvalarda, karaciğer boyutu incelenmesi önemlidir. Olmayan ablasyon (% 0-5) ya da kısmen (% 10-20) karaciğerler kesilip gösterecektir Mtz ile tedavi edilen larvalar küçük bir yüzdesi için, bu sıralamak ve sadece çok küçük bir karaciğer ile larvaları analiz için gerekli olan Şiddetli hepatosit ablasyon göstergesidir.
Bizim protokol, 5 dpf (36 saat tedavi periyodu) 3,5'ten MTZ ile zebra balığı larvaları tedavi olmasına rağmen, alternatif bir aşamaları ve Mtz tedavi süresi, aynı zamanda mümkündür. Örneğin, larva 5 ile bahsedilen 36 saat tedavi süresi benzer 6 dpf (24 saatlik bir tedavi süresi) da gösterdiği ciddi hepatosit ablasyonu için işlemden geçirildi. İki ek grupları bağımsız olarak oluşturulanBenzer fabp10a: NTR transgenik hatları ve ayrıca hepatosite özel ablasyon aşağıdaki safra odaklı karaciğer rejenerasyonu sürecine bildirildi. Bir grup, 21 dpf 6-7 MTZ ile larvalar tedavi Oysa, başka bir benzer sonuçlara ulaşan 20, 3.5 ila 4.5 dpf öyle yaptım. Her fabp10a Süresi: NTR transgen doğru NTR ifade farklı bir düzeyde sergileyebilir, Mtz tedavi süresi ve doz kullanılan transjenik çizginin her biri için ayrı ayrı belirlenmelidir. Aynı zamanda, üç nokta mutasyonu giriş enzimatik aktivitesi 26 bir artışa yol açar ki NTR geninin geliştirilmiş bir versiyonu ile bir transgenik çizgi oluşturmak için yararlı olabilir. Bu mutant NTR vahşi tip NTR 26 daha hızlı bir ablasyon durumunda neden olur. Vahşi tip NTR kinetik istenen aşamada tam hücre ablasyon olasılığını sınırlamak olabilir, bu durum özellikle avantajlıdır.
Larva yüzlerce berieş zamanlı olarak, hepatosit ablasyon geçirebilen bu zebra balığı karaciğer zedelenme modeli bastırmak ya da safra odaklı karaciğer rejenerasyonu arttırabilir küçük molekülleri tanımlamak için kimyasal ekranlar uygulanabilir. Örneğin, bu modeli kullanarak, Georgia Tech Shin grubu kimyasal ekran gerçekleştirilen ve çok sayıda Wnt agonistleri ve karaciğer rejenerasyonu 20 kolaylaştırdı Notch antagonistleri bulundu. Biz de küçük ölçekli kimyasal ekran gerçekleştirilen ve (hazırlık, SK, TYC, JS ve DS), karaciğer rejenerasyonu bastırmak birkaç bileşikler belirledi.
Insanlar BECS hastalıklı karaciğer 5,6 rejenere hepatositlere katkıda bulunabilir önerdi marker analiz eder. Dr Wanless 'grubu, son zamanlarda geriledi siroz parankimi büyük bir yüzdesi siroz regresyon BEC odaklı karaciğer rejenerasyonu önemini ima insanlarda 27 LPCs / BECS elde edilecek göründüğünü bildirdi. Gerçeği göz önüne alındığında, esas olarak BECSBurada anlatılan Zebra balığı karaciğer hasarı modelinde rejenere hepatositler katkıda bu model BEC odaklı karaciğer rejenerasyonu altında yatan hücresel ve moleküler mekanizmaları belirlemek için paha biçilmez bir araç olacaktır. Bu tür mekanizmaların anlaşılması ciddi karaciğer hastalığı olan hastalarda doğuştan karaciğer rejenerasyonu artırmak için nasıl önemli bilgiler sağlayacaktır. Ayrıca, kimyasal ekranlar ile kombinasyon halinde, bu zebra balığı modeli, insan hastalarda doğuştan gelen karaciğer rejenerasyonu kolaylaştırabilir bir potansiyel ilaç belirlenmesinde yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarını olduğunu beyan ederim.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
- Riehle, K. J., Dan, Y. Y., Campbell, J. S., Fausto, N.
- Fausto, N., Campbell, J. S. The role of hepatocytes and oval cells in liver regeneration and repopulation. Mechanisms of Development. 120, 117-130 (2003).
- Duncan, A. W., Dorrell, C., Grompe, M. Stem Cells and Liver Regeneration. Gastroenterology. 137, 466-481 (2009).
- Michalopoulos, G. K. Liver regeneration: Alternative epithelial pathways. Int J Biochem Cell B. 43, 173-179 (2011).
- Falkowski, O., et al. Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells. Journal of hepatology. 39, 357-364 (2003).
- Yoon, S. M., et al. Epithelial Cell Adhesion Molecule (EpCAM) Marks Hepatocytes Newly Derived from Stem/Progenitor Cells in Humans. Hepatology. 53, 964-973 (2011).
- Michalopoulos, G. K.
- Michalopoulos, G. K. Liver Regeneration after Partial Hepatectomy Critical Analysis of Mechanistic Dilemmas. Am J Pathol. 176, 2-13 (2010).
- Yanger, K., et al. Adult hepatocytes are generated by self-duplication rather than stem cell differentiation. Cell stem cell. 15, 340-349 (2014).
- Schaub, J. R., Malato, Y., Gormond, C., Willenbring, H. Evidence against a Stem Cell Origin of New Hepatocytes in a Common Mouse Model of Chronic Liver Injury. Cell reports. 8, 933-939 (2014).
- Dovey, M., et al. Topoisomerase II alpha is required for embryonic development and liver regeneration in zebrafish. Molecular and cellular biology. 29, 3746-3753 (2009).
- Goessling, W., et al. APC mutant zebrafish uncover a changing temporal requirement for wnt signaling in liver development. Developmental Biology. 320, 161-174 (2008).
- Sadler, K. C., Krahn, K. N., Gaur, N. A., Ukomadu, C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, uhrf1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 1570-1575 (2007).
- Cox, A. G., et al. S-nitrosothiol signaling regulates liver development and improves outcome following toxic liver injury. Cell reports. 6, 56-69 (2014).
- North, T. E., et al. PGE2-regulated wnt signaling and N-acetylcysteine are synergistically hepatoprotective in zebrafish acetaminophen injury. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 17315-17320 (2010).
- Curado, S., et al. Conditional targeted cell ablation in zebrafish: A new tool for regeneration studies. Developmental Dynamics. 236, 1025-1035 (2007).
- Pisharath, H., Rhee, J. M., Swanson, M. A., Leach, S. D., Parsons, M. J. Targeted ablation of beta cells in the embryonic zebrafish pancreas using E. coli nitroreductase. Mech Dev. 124, 218-229 (2007).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat Protoc. 3, 948-954 (2008).
- Choi, T. Y., Ninov, N., Stainier, D. Y., Shin, D. Extensive conversion of hepatic biliary epithelial cells to hepatocytes after near total loss of hepatocytes in zebrafish. Gastroenterology. 146, 776-788 (2014).
- Huang, M., et al. Antagonistic interaction between Wnt and Notch activity modulates the regenerative capacity of a zebrafish fibrotic liver model. Hepatology. , (2014).
- He, J., Lu, H., Zou, Q., Luo, L. Regeneration of liver after extreme hepatocyte loss occurs mainly via biliary transdifferentiation in zebrafish. Gastroenterology. 146, 789-800 (2014).
- Sakaguchi, T. F., Sadler, K. C., Crosnier, C., Stainier, D. Y. Endothelial signals modulate hepatocyte apicobasal polarization in zebrafish. Curr Biol. 18, 1565-1571 (2008).
- Ninov, N., Borius, M., Stainier, D. Y. R. Different levels of Notch signaling regulate quiescence, renewal and differentiation in pancreatic endocrine progenitors. Development. 139, 1557-1567 (2012).
- Lorent, K., Moore, J. C., Siekmann, A. F., Lawson, N., Pack, M. Reiterative use of the notch signal during zebrafish intrahepatic biliary development. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 239, 855-864 (2010).
- Itoh, T., Miyajima, A. Liver Regeneration by Stem/Progenitor Cells. Hepatology. 59, 1617-1626 (2014).
- Mathias, J. R., Zhang, Z., Saxena, M. T., Mumm, J. S. Enhanced cell-specific ablation in zebrafish using a triple mutant of Escherichia coli nitroreductase. Zebrafish. 11, 85-97 (2014).
- Stueck, A. E., Wanless, I. R. Regression of cirrhosis: The maturation sequence of buds arising from hepatocyte progenitor cells. Hepatology. 58, 235A (2013).
