Abstract
Die Leber hat eine große Kapazität zu regenerieren. Hepatocyte- oder Gallengetriebenen Leberregeneration: Hepatozyten, die parenchymale Zellen der Leber, in eine von zwei Arten zu regenerieren. In Hepatocyten getriebenen Leberregeneration, regenerieren Hepatozyten aus vorbestehenden Hepatozyten abgeleitet ist, während, in der Gallengetriebenen Regeneration werden Regenerieren von Hepatozyten und Gallen Epithelzellen (BECs) abgeleitet. Für Hepatozyten getriebenen Leberregeneration, gibt es sehr gute Nagermodellen, die wesentlich zum aktuellen Verständnis der Leberregeneration beigetragen haben. Es besteht jedoch keine solche Nagetiermodell für Gallengetriebenen Leberregeneration. Wir haben vor kurzem auf einem Zebrafischleberschäden Modell, in dem BECs weitgehend Anlass zu Hepatozyten bei schweren Hepatozyten-Verlust geben wiesen. In diesem Modell werden die Leberzellen spezifisch durch eine pharmakogenetische Mittel abgetragen. Hier im Detail präsentieren wir die Methoden, um Hepatozyten abzutragen und den BEC-driven Leberregenerationsprozess zu analysieren.Diese Hepatozyten-spezifische Ablation Modell kann weiter verwendet werden, um die zugrunde liegenden molekularen und zellulären Mechanismen der Gallengetriebenen Leberregeneration entdecken werden. Darüber hinaus können diese Verfahren, um chemische Bildschirmen angewendet werden, um kleine Moleküle, erweitern oder die Regeneration der Leber zu unterdrücken identifizieren.
Introduction
Die Leber ist ein hoch regenerative Organ. Während der Leberregeneration, Regeneration von Leberzellen, die parenchymale Zellen der Leber, sind aus vorbestehenden Leberzellen (Hepatozyten getriebenen Leberregeneration) oder BECs (Gallengetriebenen Leberregeneration) 1,2 abgeleitet. Leberschäden hervorruft, in der Regel die Verbreitung von bereits bestehenden Leberzellen; Wenn jedoch Hepatozytenproliferation kompromittiert ist, kann dazu beitragen, BECs Hepatozyten 2-4. Diese beiden Modi der Leberregeneration klinisch signifikant. Nach der operativen Entfernung eines Teils der menschlichen Leber (zB aufgrund von Lebertumoren oder lebenden Leberspender), Hepatozyten im Leberrest vermehren, um die verlorene Lebermasse wiederherzustellen. Dagegen bei Patienten mit schweren Lebererkrankungen, Hepatozytenproliferation stark beeinträchtigt wird, so daß BECs oder Leberstammzellen (LPCs) scheinen zur Regenerierung Hepatozyten 5,6 beizutragen. Das Nagetier 2/3 Teilhepatektomie Modell, in demHepatozyten vermehren, um die Lebermasse verloren zu erholen, hat wesentlich zum derzeitigen Verständnis der Hepatozyten-driven Leberregeneration 7,8 beigetragen. Jedoch gibt es keine gültige Nagetiermodell, in dem Regenerieren Hepatozyten werden hauptsächlich aus BECs abgeleitet. Obwohl mehrere Nagetier Lebertoxin Modellen führte zur Identifizierung von Gallengetriebenen Leberregeneration 2-4, letzten Linienverfolgungsstudien an Mäusen zeigen einen minimalen Beitrag von BECs regenerierendes Leberzellen in diesen Modellen 9,10. Einige der Nagetiermodellen Leberverletzung, einschließlich partieller Hepatektomie 11-13 und Acetaminophen induzierten Leberschaden 14,15 haben Zebrafisch angewandt und führten zur Identifizierung neuer Gene oder Wege bei der Leberregeneration in Verbindung gebracht. Allerdings Hepatozyten-getrieben, aber nicht BEC-getrieben, tritt die Leberregeneration in diesen Zebrafischleberschäden Modelle. Daher ist eine neuartige Leberschäden Modell, in dem BECs weitgehend an Regenerat beitragening Hepatozyten ist für ein besseres Verständnis der BEC getriebenen Leberregeneration benötigt.
Die übergeordneten Ziele des Hepatozyten-Ablation Modell hier beschrieben sind (1), um eine Schädigung der Leber Modell, in dem BECs weitgehend zu regenerierenden Leberzellen beitragen, und (2) Aufklärung der molekularen und zellulären Mechanismen BEC-driven Leberregeneration zugrunde zu generieren. Wir vermuten, dass die Schwere der Verletzung bestimmt den Modus der Leberregeneration; So sagten wir voraus, dass Gallengetriebenen Leberregeneration würde von schweren Verletzungen Hepatozyten zu initiieren. Um diese Hypothese zu testen, ein Zebrafischleberschäden Modell entwickelten wir durch die Erzeugung eines transgenen Linie, Tg (fabp10a: CFP-NTR) S931, dass hoch drückt bakterielle Nitroreduktase (NTR) mit cyan fluoreszierende Protein (GFP) fusioniert unter der Hepatozyten-spezifischen fabp10a Promotor. Da NTR wandelt das nicht-toxische Prodrug, Metronidazol (MTZ), in ein zytotoxisches Arzneimittel, abträgt es nur die beabsichtigte NTR-exprimierenden Zellen 16-18, in diesem Fall werden die Hepatozyten. Durch Manipulation der Dauer der MTZ Behandlung kann das Ausmaß der Ablation Hepatozyten gesteuert werden. Mit diesem Modell haben wir vor kurzem berichtet, dass bei schweren Hepatozyten Verlust, BECs weitgehend Anlass zu regenerierenden Leberzellen 19, die durch zwei weitere unabhängige Studien 20,21 bestätigt wurde. Daher kann im Vergleich zu dem vorgenannten Nagetier und Zebrafisch Leberverletzung Modellen ist unsere Hepatozyten Ablation Modell zum Studium BEC getriebenen Leberregeneration vorteilhafter.
Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren für die Durchführung der Leberregeneration Experimente unter Verwendung der Zebrafisch-Hepatozyten-Ablation-Modell. Dieses Modell wird für die Ermittlung der Mechanismen Gallengetriebenen Leberregeneration zugrunde liegenden und für die chemische Bildschirme, um kleine Moleküle, die zu unterdrücken oder zu erweitern Leberregeneration identifizieren können geeignet sein.
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Protocol
Zebrafisch wurden angehoben und nach Standardverfahren gezüchtet; Experimente wurden von der Universität Pittsburgh Institutional Animal Care und Verwenden Committee genehmigt.
1. Herstellung von Embryos / Larven
- Um zeitgesteuerte Paarungen, einzurichten erwachsenen männlichen und weiblichen Tg (fabp10a: CFP-NTR) durchführen S931 hemizygot oder homozygot Fische O / N und legen Sie eine Trennlinie zwischen ihnen. Entfernen Teiler am nächsten Morgen, als Gegen gewünscht wird. Sammeln Embryonen durch belasten das Wasser mit einem feinen Kunststoffnetz Sieb.
- Drehen Sie den Filter auf den Kopf und spülen Sie die Netzoberfläche mit einem feinen Strom von Ei Wasser aus einem Squeeze-Flasche abgefüllt. Übertragen Sie 100 Embryonen in eine 100 mm Petrischale mit 25 ml Wasser Ei. Halten Sie nicht mehr als 100 Embryonen pro Petrischale und heben Sie sie auf 28 ° C.
- Pigmentierung hemmen, fügen Phenylthioharnstoff (PTU) in die Petrischalen vor 10 Stunden nach der Befruchtung (HPF), und heben Sie embryos / Larven bis 80 HPF. Die Endkonzentration der PTU beträgt 0,2 mm. ACHTUNG: PTU ist giftig. Verwenden Sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang.
- Betäuben die Larven durch Zugabe von 3-Aminobenzoesäure-ethylester (Tricaine) bei einer Endkonzentration von 0,016%, in die Petrischalen. Dann, mit einem Epifluoreszenz-Mikroskop, sortieren GFP-positive Larven. Verwenden Larven mit einer ähnlichen Lebergröße und entsorgen Sie die mit einer kleineren oder größeren Leber.
Anmerkung: Jeder GFP-positive Larven, egal Intensität kann verwendet werden, da es keinen Unterschied in dem Ausmaß der Ablation Hepatozyten zwischen der hemizygot homozygoten Larven. ACHTUNG: Tricaine ist giftig. Verwenden Sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang. - Entfernen Sie das Wasser, das Ei Tricaine und fügen Sie Ei Wasser mit 0,2 mM PTU ergänzt. Halten Sie die Embryonen / Larven bei 28 ° C.
2. Mtz Treatment
- Bereiten Sie frischen 10 mM Mtz durch Auflösen von 0,171 g Mtz Pulver in 100 ml Ei Wasser ergänzt mit 0,2% DMSO und 0,2 mM PTU. Um die Mtz vollständig zu lösen, mischen Sie die Lösung bei RT unter schnellem Rühren für 20-30 Minuten. Um Ihnen zu helfen zu solubilisieren Mtz und Mtz Permeation in die Larven zu verbessern, fügen DMSO bei der Vorbereitung Mtz. ACHTUNG: längerer Exposition oder erhöhte Konzentration von Mtz ist giftig. Verwenden Sie in Übereinstimmung mit den entsprechenden Richtlinien zum Umgang.
- Trenne die Larven in Kontroll- und Versuchsgruppen durch Übertragen gewünschte Anzahl der Larven in zwei 100 mm-Petrischale oder Multi-Well-Platte. Für die Versuchsgruppe, halten Sie die Larven in 10 mM Mtz Lösung; in der Kontrollgruppe, halten sie in Ei-Wasser, das 0,2% DMSO.
- Umfassen die Platten oder Petrischalen MTZ Lösung mit einer Aluminiumfolie, um den Photo Inaktivierung Mtz verhindern, und Inkubieren bei 28 ° C. Die Dauer der Behandlung hängt von Mtz Larvenstadium und der transgenen Linie.
- Ähnliche schwere Hepatozyten-Ablation in das beobachten
3. Analyse der Gallengetriebenen Leberregeneration
- Am Ende der Ablation Zeitraum, entfernen Sie die Mtz Lösung von den Platten. Durch Zugabe von 25 ml Wasser Ei waschen Sie die MTZ-behandelten Larven. Schwenken Sie die Platte 2-3 mal, um die Larven vor der Entsorgung das Ei Wasser zu waschen. Wiederholen Sie drei Mal und dann tauchen die Larven wieder in Ei Wasser. Zu Herzen Ödeme und zum Tod der Larve in der MTZ-behandelten Larven zu vermeiden, fügen Sie eine niedrigere Konzentration von Tricaine, in einer endgültigen Konzentration von 0,008%, um die Larven zu immobilisieren.
- Für Leberanalyse, Prüfung der Lebergröße der MTZ-behandelten Larven unter einem Epifluoreszenz-Mikroskop mit der GFP-Filter. Beurteilen Hepatozyten Ablation Ebenen auf der Grundlage des relativen Lebergröße: groß (nicht abgetragenen; 0-10% Larven), mittel (teilweise abgetragen, 10-20%) und sehr klein (vollständig abgetragen; 80-90%).
- Entfernen Sie die Larven mit nicht abgetragene oder teilweise abgetragen Lebern. Nur halten Larven mit einer winzigen Leber, die indikativ für schwere Hepatozyten Ablation. Für Leber-Analyse bei der Regeneration 0 hr Zeitpunkt (R0h), ernten die Larven nach Mtz Auswaschen und CFP Sortierung. Ansonsten halten die sortiert Larven im Ei Wasser mit 0,2 mM PTU ergänzt, bis bereit für die Ernte.
- Transfer geerntet Larven in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und Ersetzen ei Wasser mit der Fixierungslösung von 3% Formaldehyd in PEM-Puffer. Das Röhrchen auf einem Rotator O / N bei 4 ° C.
- Ersetzen Sie die Fixierungslösung mit 1 ml PBSDT und drehen Sie die Röhre mit den Larven auf dem Rotator für 5 min.
- Übertragen Sie die Fest Larven in eine 100 mm Petrischale mit PBSDT und mit einer Pinzette, Eigelb und Brustflossen unter einem Binokular manuell entfernen. Übertragung von bis tp 20 seziert Larven in ein 1,5-ml-Tube. <li> Ersetzen PBSDT Lösung mit 1 ml Blockierungslösung und Rock das Rohr auf einem Rotator bei RT für 2 h.
- Ersetzen Blockierungslösung mit 100 ul Blockierungslösung mit primären Antikörpern. Langsam schaukeln Sie das Rohr auf einem Rotator O / N bei 4 ° C.
- Entfernen Sie den primären Antikörperlösung und wäscht mit PBSDT 5 mal für 10 Minuten jedes Mal. Dann fügen Sie 100 ul Blockierungslösung, die Sekundärantikörper und schütteln Sie sie auf einem Rotator bei RT 2 h.
- 5 mal mit PBSDT für je 10 min waschen bei RT durch Schaukeln auf einem Rotator.
- Richten Sie die Larven seitlich auf einen Objektträger und einen Tropfen Eindeckmittel. Sorgfältig decken Sie sie mit einem Deckglas und Dichtung das Deckglas mit einem Nagellack. Jetzt ist es bereit für die konfokale Mikroskopie.
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Representative Results
MTZ Behandlung für 36 h (A36h, A steht für Ablation) von 3,5 bis 5 dpf drastisch reduziert Lebergröße (1B). CFP-NTR und fabp10a:: Nach dem Auswaschen Mtz, als Beginn der Leberregeneration (R), starke fabp10a als dsRed Ausdruck erschien innerhalb von 30 h (1B). Die intrahepatische Gallen Netzwerk als durch Expression ALCAM die in der Membran von BECs 22 vorliegt beurteilt zunächst zusammenfällt, aber bei 54 Stunden nach der Auswaschung (R54h) (1C) wiedereingeführt. Diese Daten zeigen, dass die Leberregeneration und Wiederherstellung schnell in unserem Leberschäden Modell auftreten.
2 zeigt, dass Regenerieren Hepatozyten von BECs abgeleitet. Die Tg (Tp1: H2B-mCherry) S939 Linie drückt eine Kern rot fluoreszierendes Protein unter der Kontrolle eines Elements mit 12 RBP-Jĸ Bindungsstellen 23. Das Notch responsive Element erscheint, um die Genexpression in BECs ausschließlich in der Leber 24 fahren; es ist jedoch möglich, dass es fährt Genexpression in LPCs weil Notch ist eng mit den LPCs 25 zusammen. Daher ermöglicht diese transgene Linie für die einfache Erkennung von BEC, und wahrscheinlich LPC, Kernen. Darüber hinaus die erweiterte Stabilität der H2B-mCherry Fusionsprotein ermöglicht kurzfristige Linie Tracing. Esten H2B-mCherry + Zellen in der regenerierenden Leber bei R0h ausgedrückt Hnf4α (2A), die in Hepatozyten exprimiert wird, aber nicht in BECs in der Steuer Leber. Hepatozyten, wie fabp10a beurteilt: CFP-NTR-Expression, bei R48h behielt Tp1: H2B-mCherry Ausdruck (2B, Pfeile). Diese Daten zeigen, BEC Umwandlung in Hepatozyten bei schweren Hepatozyten-Verlust, der durch permanenten Lineage Tracing 19 bestätigt wurde.
Abbildung 1. Ein Zebrafischleberschädigung-Modell. (A) Schema, welches die Zeiten der Mtz Behandlung und Regeneration der Leber. (B) 36 hr Mtz Behandlung stark reduziert Lebergröße und fabp10a: CFP und fabp10a: dsRed Fluoreszenz bei R0h; jedoch starke GFP und dsRed Fluoreszenz wieder erschienen bei R30h. Pfeile zeigen auf die Leber (li). (C) Die konfokale Projektionsansichten des gesamten Leber mit anti-Alcam Antikörper, die BECs markierten immungefärbt. Die intrahepatischen Gallen Netzwerk wurde bei R0h zusammengebrochen aber R54h schnell wieder hergestellt. Gepunkteten Regionen einen Überblick über die Leber. Maßstabsbalken:. 100 (B), 20 (C) um Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Abbildung 2. BECs Anlass zu Hepatozyten bei schweren Hepatozyten-Verlust (A) konfokale Projektionsansichten der Leber zeigt Hnf4α (grün) und Tp1:. H2B-mCherry (rot) Ausdruck an R0h. (B) Die konfokale Einzel optischen Schnittbildern, die fabp10a: CFP-NTR (grau) und Tp1: H2B-mCherry (rot) Expression in der Leber. mCherry Expression durch anti-mCherry Immunfärbung zeigte. Beachten Sie die schwachen mCherry Ausdruck in den Kernen der GFP + Hepatozyten (Pfeile). Strong mCherry + Zellen BECs. Maßstabsbalken:. 20 & mgr; m Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Ernst, aber nicht mild, entlockt Hepatozyten-Ablation Gallengetriebenen Leberregeneration. Daher wird nach Mtz Behandlung und Auswaschen, ist es wichtig, um die Leber Größe des MTZ-behandelten Larven, die durch intrinsische Fluoreszenz des GFP fabp10a bewertet werden können untersuchen: GFP-Transgen NTR. Da ein kleiner Prozentsatz der MTZ-behandelten Larven wird nicht abgetragenen (0-5%) oder (10-20%) Lebern teilweise abgetragen anzuzeigen, ist es wichtig zu klären, und nur analysieren die Larven mit einem sehr kleinen Leber, die indikativ für schwere Hepatozyten Ablation.
Obwohl in unserem Protokoll behandelten wir Zebrafisch-Larven mit Mtz 3,5-5 dpf (a 36 h Behandlungsdauer), sind auch alternative Stufen und Dauer der Mtz Behandlung möglich. Zum Beispiel Larven 5-6 dpf (a 24 h Behandlungszeitraum) zeigten ebenfalls starke Hepatozyten Ablation, ähnlich zu dem oben erwähnten 36 h Behandlungszeitraum behandelt. Zwei weitere Gruppen, die unabhängig generiertenÄhnliche fabp10a: NTR transgenen Linien und auch auf den Prozess der Gallengetriebenen der Leberregeneration nach hepatozytenspezifische Ablation gemeldet. Während die eine Gruppe behandelten Larven mit Mtz 6-7 dpf 21, hat eine andere so von 3,5 bis 4,5 dpf und erreichte ähnlichen Schlussfolgerungen 20. Da jeder fabp10a: NTR transgene Linie kann eine andere Ebene der NTR-Expression aufweisen, sollte die Dauer und Dosierung der Behandlung Mtz separat für jede der transgenen Linie verwendet, bestimmt werden. Es kann sich als nützlich erweisen, um eine transgene Linie mit einer verbesserten Version der NTR-Gen, bei dem die Einführung von drei Punktmutationen führt zu einem Anstieg in seiner enzymatischen Aktivität 26 zu erzeugen. Diese Mutante NTR wird in einem schnelleren Ablation Ereignis als der Wildtyp-NTR 26 führen. Dies ist besonders vorteilhaft, wenn Wildtyp-NTR Kinetik kann die Möglichkeit der kompletten Zelle Ablation bei einer gewünschten Stufe zu begrenzen.
Seit Hunderten von Larvengleichzeitig Hepatozyten-Ablation unterzogen werden, kann dies Zebrafischleberschädigung-Modell, um chemische Bildschirme angewendet werden, um kleine Moleküle, die zu unterdrücken oder zu erweitern Gallengesteuerte Regeneration der Leber kann zu identifizieren. Zum Beispiel mit diesem Modell, der Shin-Gruppe an der Georgia Tech führten eine chemische Bildschirm und fand mehrere Wnt-Agonisten und Antagonisten, die Notch Leberregeneration 20 erleichtert. Wir haben auch einen kleinen Maßstab durchgeführt chemische Bildschirm und identifizierte mehrere Verbindungen, die Regeneration der Leber zu unterdrücken kann (SK, TYC, JS, und DS, in Vorbereitung).
Marker-Analysen bei Menschen vorgeschlagen, dass BECs kann regeneriert Hepatozyten in der erkrankten Leber 5,6 beizutragen. Dr. Wanless Gruppe kürzlich berichtet, dass ein großer Prozentsatz der Parenchym gebildet Zirrhose scheint von LPCs / BECs bei Menschen 27 abgeleitet werden kann, was auf die Bedeutung der BEC getriebenen Leberregeneration bei Zirrhose Regression. Angesichts der Tatsache, daß hauptsächlich BECsdazu beitragen, die Regeneration von Leberzellen in der hier beschriebenen Zebrafischleberschädigung-Modell, wird dieses Modell ein unschätzbares Werkzeug für die Bestimmung der zellulären und molekularen Mechanismen BEC-driven Leberregeneration zugrunde liegt. Das Verständnis dieser Mechanismen liefert wesentliche Erkenntnisse darüber, wie, um angeborene Leberregeneration bei Patienten mit schweren Lebererkrankungen zu steigern. Ferner wird in Kombination mit chemischen Bildschirmen dies Zebrabärbling Modell kann nützlich bei der Identifizierung eines potentiellen Arzneimittel die angeborene Leberregeneration bei menschlichen Patienten erleichtern kann.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-amino benzoic acid ethyl ester (Tricaine) powder | Sigma-Aldrich | A5040 | Make 0.4% (15 mM) tricaine stock : Bring 0.4 g tricaine to 100 mL with egg water. Adjust to pH 7. |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| Metronidazole | Sigma-Aldrich | M1547 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
| Formaldehyde | Sigma-Aldrich | 252549 | |
| Calcium sulfate dihydrate | Sigma-Aldrich | C3771 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Mounting media (Vectashield) | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 100 x 15 mm petri dish | Denville Scientific Inc. | M5300 | |
| clear nail polish | Fisher Scientific | 50949071 | |
| fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
| glass slide | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| glass coverslip | Fisher Scientific | 12-540-A and 12-542-A | 18 x 18 mm |
| zn-5 (mouse anti-Alcam) | ZIRC | zn-5 | 1:10 dilution |
| goat anti-Hnf4a | Santa Cruz | sc-6556 (C-19) | 1:50 dilution |
| rat anti-RFP | Allele Biotechnology | ACT-CM-MRRFP10 | 1:300 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Donkey Anti-goat IgG (H+L) | Jackson laboratories | 705-605-147 | 1:500 dilution |
| AlexaFluor 647 AffiniPure Goat Anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen | A21240 | 1:500 dilution |
| Cy3 donkey anti-rat IgG | Jackson laboratories | 712-165-150 | 1:500 dilution |
| dissecting microscope | Leica Microsystems | S6F | |
| epifluorescence microscope | Leica Microsystems | M205FA | |
| confocal microscope | Carl Zeiss | LSM700 | |
| egg water | 0.3 g/L of sea salts ‘Instant Ocean’ and 0.5 mM CaSO4 in distilled water. |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10X PBS | 25.6 g Na2HPO4·7H2O, 80 g NaCl, 2 g KCl, 2 g KH2PO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. Autoclave for 20 min at 121°C. | ||
| 1X PBSDT | 0.2% Triton X-100 and 0.2% DMSO in 1 X PBS. | ||
| PEM buffer | 30.2 g PIPES, 761 mg EGTA, 1 mM MgSO4. Bring to 1 L with distilled water. Adjust pH 7. | ||
| Blocking solution | Mix 1 ml of heat-inactivated horse serum with 9 ml of 1X PBSDT. |
References
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