Summary

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em> Streptococcus iniae</em> Infectie

Published: April 21, 2015
doi:

Summary

Here, we present a protocol for the generation and imaging of a localized bacterial infection in the zebrafish otic vesicle.

Abstract

De aquatische ziekteverwekker, Streptococcus iniae, is verantwoordelijk voor meer dan 100 miljoen dollar in jaarlijkse verliezen voor de aquacultuursector en kan veroorzaken systemische ziekte bij zowel vis en de mens. Een beter begrip van S. iniae pathogenese van de ziekte vereist een geschikt modelsysteem. De genetische volgzaamheid en de optische transparantie van de vroege ontwikkelingsstadia van zebravis oog op het genereren en niet-invasieve beeldvorming van transgene lijnen met fluorescent gelabeld immuuncellen. Het adaptieve immuunsysteem is niet volledig functioneel tot verscheidene weken na bevruchting, maar zebravis larven een geconserveerd gewervelde aangeboren immuunsysteem zowel neutrofielen en macrofagen. Aldus, het genereren van een larvale infectiemodel maakt het onderzoek mogelijk van de specifieke bijdrage van aangeboren immuniteit in de controle S. iniae infectie.

De site van de micro-injectie zal bepalen of er een infectie issystemische of aanvankelijk gelokaliseerd. Hier presenteren we onze protocollen voor otic blaasje injectie van zebravis leeftijd van 2-3 dagen na de bevruchting, evenals onze technieken voor tl confocale beeldvorming van infectie. Een gelokaliseerde infectie site laat observatie van de eerste microbe invasie, de aanwerving van gastheercellen en de verspreiding van de infectie. Onze bevindingen met behulp van de zebravis larvale model van S. iniae infectie aan dat zebravis kan worden gebruikt om de verschillende bijdragen van ontvangst neutrofielen en macrofagen in gelokaliseerde bacteriële infecties onderzocht. Verder beschrijven we hoe fotomarkering van immuuncellen kunnen worden gebruikt om individuele gastheercel lot volgen tijdens het verloop van de infectie.

Introduction

Streptococcus iniae is een belangrijke aquatische ziekteverwekker die kan veroorzaken systemische ziekte bij zowel vissen als mens 1. Terwijl S. iniae is verantwoordelijk voor grote verliezen in de aquacultuur is ook een potentiële zoönotische pathogenen, kunnen veroorzaken ziekte bij immunogecompromitteerde menselijke gastheren met klinische pathologieën vergelijkbaar met die veroorzaakt door andere streptokokken menselijke pathogenen. Gezien de overeenkomsten met humane pathogenen, is het belangrijk S. bestuderen iniae pathogenese van de ziekte in het kader van een natuurlijke gastheer. Een volwassen zebravis model van S. iniae infectie bleek robuuste infiltratie van gastheer leukocyten naar de gelokaliseerde plaats van de infectie, evenals een snelle tijd tot de dood te hosten, een tijd te kort om het adaptieve immuunsysteem 7 betrekken. Om te winnen een diepgaande kijk in de aangeboren immuunrespons tegen S. iniae infectie in vivo, moet een model dat meer vatbaar n gebruikenon-invasieve live beeldvorming.

De larvale zebravis heeft een aantal voordelen dat het een steeds aantrekkelijker gewervelde model voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties te maken. Zebravis zijn relatief goedkoop en gemakkelijk in gebruik en onderhoud in vergelijking met zoogdieren modellen. Adaptieve immuniteit is niet functioneel volwassen tot 4-6 weken na de bevruchting, maar larven hebben een sterk geconserveerd gewervelde aangeboren immuunsysteem met complement, Toll-like receptoren, cytokinen en neutrofielen en macrofagen met antimicrobiële mogelijkheden, waaronder fagocytose en respiratoire burst 2-6, 8-11. Bovendien, de genetische traceerbaarheid en optische transparantie van de embryonale en larvale stadia van ontwikkeling mogelijk maken de vorming van stabiele transgene lijnen met fluorescent gelabelde immuuncellen waardoor gastheer-pathogeen interacties in real time in vivo onderzocht. De generatie van deze transgene lijnen met een photoconvertible eiwit zoals Dendra2 maakt het volgen van afzonderlijke gastheercel oorsprong en het lot in de loop van de infectie 12.

Bij de ontwikkeling van een zebravis larvale infectie model, zal de gekozen locatie van micro-injectie te bepalen of er een infectie is in eerste instantie gelokaliseerde of systemische. Systemische bloed infecties in de caudale ader of Duct van Cuvier worden meestal gebruikt om microbiële ziekteverwekkers in de zebravis te bestuderen en zijn nuttig voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en microbiële cellen, cytokine reacties, en verschillen in virulentie tussen ziekteverwekker stammen. Voor langzamer groeiende micro-organismen kunnen vroeg injectie in de dooierzak van een embryo in de 16-1,000 cellig stadium worden gebruikt om een systemische infectie 13,14 verwekken, optimale ontwikkelingsstadium voor micro-injectie van een langzaam groeiende micro-organisme blijkt tussen de 16-128 cellig stadium 15. Echter, dooierzak injecties van veel microben in latere stadia van de gastheer ontwikkeling neiging dodelijke aan t te zijnhij gastheer te wijten aan de voedselrijke omgeving voor de microbe en gebrek aan infiltreren leukocyten 16-18.

Een gelokaliseerde infectie resulteert meestal in gerichte migratie van leukocyten naar de plaats van infectie die gemakkelijk kan worden gekwantificeerd met niet-invasieve beeldvorming. Dit type infectie kunnen zorgen voor dissectie van de mechanismen die leukocytenmigratie evenals onderzoek naar verschillende trekkende en phagocytic mogelijkheden van diverse leukocyten bevolkingsgroepen bemiddelen. Gelokaliseerde infecties zijn ook nuttig bij het onderzoek van de verschillen in virulentie tussen bacteriestammen evenals het bestuderen van microbe invasie mechanismen sinds fysieke host barrières moeten worden gekruist voor een gelokaliseerde infectie aan systemische geworden. Zebravis worden typisch verhoogd bij temperaturen van 25-31 ° C 19, maar zij kunnen ook bij temperaturen tot 34-35 ° C voor studies van de invasiviteit van bepaalde menselijke ziekteverwekkers strenge eisen temperatuur gehandhaafdvoor virulentie 20, 21.

Veel verschillende locaties zijn gebruikt om een aanvankelijk gelokaliseerde bacteriële infectie met inbegrip van de achterhersenen ventrikel 22, rug- staart spier 18, pericardiale holte 23 en otic blaasje (oor) 5, 16, 24 genereren. Er is echter gevonden dat injectie van bacteriën in de staart spier weefselbeschadiging en ontsteking onafhankelijk van de bacteriën, die resultaten scheef bij onderzoeken leukocyt reactie 13 veroorzaken. Hoewel minder schade wordt geassocieerd met injectie in de achterhersenen en hoewel het aanvankelijk verstoken van leukocyten in jonge embryo's, de achterhersenen ventrikel gestaag krijgt meer immuuncellen in de tijd als microglia te gaan wonen. De achterhersenen ventrikel is ook een moeilijker locatie om de afbeelding. De otic blaasje is een gesloten holte met geen directe toegang tot het vaatstelsel 25, 26. Het is gewoonlijk zonder leukocytes, maar leukocyten kan worden aangeworven om de otic blaasje in reactie op inflammatoire stimuli zoals een infectie. Het is ook een gewenste plaats van micro-injectie van bacteriën in zebravis leeftijd 2-3 dagen na de bevruchting (dpf) vanwege het gemak van beeldvorming en de visualisatie van de injectie. Daarom hebben we gekozen voor de otic blaasje als onze site van gelokaliseerde bacteriële infectie.

Protocol

Volwassen en embryonale zebravis werden onderhouden in overeenstemming met de Universiteit van Wisconsin-Madison Research Animal Resources Center. 1. Voorbereiding Microinjection Naalden Bereid dunne wand glazen capillaire injectienaalden (1,0 OD / 0.75 ID) met behulp van een micropipet trekker apparaat met de volgende instellingen: luchtdruk 200, warmte 502, trek 90, snelheid 80, tijd 70, zendtijd aan het begin van pull 5, zendtijd aan het einde van pull 5. Met behulp v…

Representative Results

Micro-injectie van S. iniae in de otic blaasje (figuur 1 en figuur 2) resulteert in een aanvankelijk gelokaliseerde gastheer respons. Wanneer correct geïnjecteerd, moet de bacteriën alleen gezien in de otic blaasje en niet in het omringende weefsel of bloed. Dit kan worden gevisualiseerd in micro-injectie met fenol rode kleurstof (Figuur 1A). Als alternatief, als het label bacteriën worden geïnjecteerd, een quick scan van geïnfecteerde larven onmiddellijk …

Discussion

De infectie hier gebruikte methode is bruikbaar voor de studie van de gastheer immuunrespons op een aanvankelijk gelokaliseerde infectie in 2-3 dpf embryo's en larven. De focus van een inflammatoire stimulus, zoals infectie, in een gesloten ruimte zoals de otic blaasje maakt de studie van neutrofielen en macrofagen chemotaxis en fagocytose. Een waarschuwing injecteren bacteriën in de otic blaasje is dat het vermogen van neutrofielen efficiënt fagocyteren bacteriën in met fluïdum gevulde holtes kan afhankelijk va…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag lab leden bedanken voor de zebravis verzorging en onderhoud. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 aan EA Harvie en NIH R01GM074827 aan Anna Huttenlocher.

Materials

1.7 ml eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml falcon tube BD Falcon 352059
27 G x 1/2 in. needle BD Biosciences 305109
96 well plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting Scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16–18 mm hole in the center of a 35-mm tissue culture dish bottom and placing a 22-mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser Scanning Confocal Microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri Dishes Fisher Scientific FB0875712 100 mm x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 mm x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

References

  1. Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
  2. Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
  3. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  4. Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
  5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
  7. Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
  8. Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
  9. Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
  10. Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
  11. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
  12. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
  14. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
  15. Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  16. Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
  17. Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
  18. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  19. Volhard, C., Dahm, R. . Zebrafish: A Practical Approach. , (2002).
  20. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  21. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
  22. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  23. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
  24. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
  25. Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  26. Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -. Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  28. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
  29. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  30. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).

Play Video

Cite This Article
Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

View Video