Abstract
Die aquatische Erreger Streptococcus iniae, ist seit mehr als 100 Millionen Dollar in jährlichen Verluste für die Aquakultur zuständig und in der Lage ist, die systemische Erkrankung in beiden Fische und Menschen. Ein besseres Verständnis der S. iniae Pathogenese der Erkrankung erfordert eine entsprechende Modellsystem. Die genetische Lenkbarkeit und die optische Transparenz der frühen Entwicklungsstadien von Zebrabärbling ermöglichen die Erzeugung und nicht-invasive Abbildung von transgenen Linien mit fluoreszenzmarkierten Immunzellen. Das adaptive Immunsystem nicht voll funktionsfähig, bis mehrere Wochen nach der Befruchtung, aber Zebrafisch-Larven haben eine konservierte Wirbel angeborenen Immunsystems mit beiden Neutrophilen und Makrophagen. Somit ist die Erzeugung eines Larveninfektionsmodell ermöglicht die Untersuchung des spezifischen Beitrags der angeborenen Immunität bei der Kontrolle S. iniae Infektion.
Die Website der Mikroinjektion wird geprüft, ob eine Infektionsystemische oder zunächst lokalisiert. Hier präsentieren wir unsere Protokolle für Ohrbläschen Injektion von Zebrafisch im Alter von 2-3 Tagen nach der Befruchtung sowie unsere Methoden zur Fluoreszenz konfokale Abbildung der Infektion. Eine lokalisierte Infektion Website ermöglicht die Beobachtung der ersten Mikroben-Invasion, Rekrutierung von Wirtszellen und die Verbreitung der Infektion. Unsere Ergebnisse unter Verwendung des Zebrafisch-Larven-Modell von S. iniae Infektion zeigen, daß Zebrafisch kann verwendet werden, um die unterschiedlichen Beiträge von Aufnahme Neutrophilen und Makrophagen in lokalisierten bakteriellen Infektionen zu untersuchen. Darüber hinaus wird beschrieben, wie Photomarkierung von Immunzellen können einzelne Wirtszelle Schicksal im Verlauf der Infektion zu verfolgen.
Introduction
Streptococcus iniae ist ein großer Wasserkrankheitserreger, der in der Lage ist, die systemische Krankheiten bei den Fischen und Menschen 1 ist. Während S. iniae ist für große Verluste in der Aquakultur-Industrie zuständig ist, ist es auch ein Potenzial Zoonoseerreger, der Lage verursacht Erkrankung bei immun menschlichen Wirten mit klinischen Erkrankungen ähnlich denen von anderen Streptokokken menschlichen Erregern verwendet wird. Aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit menschlicher Krankheitserreger, ist es wichtig, S. studieren iniae Pathogenese der Erkrankung in Zusammenhang mit einem natürlichen Wirt. Ein erwachsenen Zebrafisch-Modell von S. iniae Infektion ergab, robust Infiltration von Leukozyten an das Host-lokalisierten Ort der Infektion sowie eine schnelle Zeit bis zum Tod Gastgeber, eine Zeit zu kurz, um das adaptive Immunsystem 7 einzubeziehen. Um zu gewinnen eine eingehende in der angeborenen Immunantwort auf S. betrachten iniae Infektion in vivo ist es erforderlich, ein Modell zu zugänglicher n verwendenon-invasive Echtzeit-Bildgebung.
Die Larven Zebrafisch hat eine Reihe von Vorteilen, die es immer attraktiver Wirbeltiermodell zur Untersuchung Wirt-Pathogen-Interaktionen zu machen. Zebrafische sind relativ preiswert und einfach zu bedienen und zu halten im Vergleich zu Säugermodellen. Adaptive Immunität ist nicht funktionell reifen, bis 4-6 Wochen nach der Befruchtung, aber Larven haben eine hoch konservierte Wirbel angeborenen Immunsystems mit Ergänzung, Toll-like Rezeptoren, Zytokine und Neutrophilen und Makrophagen, die mit antimikrobiellen Funktionen, einschließlich Phagozytose und Respiratory Burst 2-6, 8-11. Darüber hinaus ist die genetische Lenkbarkeit und der optischen Transparenz der embryonalen und larvalen Stadien der Entwicklung ermöglichen die Erzeugung von stabilen transgenen Linien mit fluoreszenzmarkierten Immunzellen macht es möglich, Wirt-Pathogen-Wechselwirkungen in Echtzeit in vivo zu untersuchen. Die Erzeugung dieser transgenen Linien mit einem Photokonvertierbare Protein wie Dendra2 ermöglicht die Verfolgung einzelner Wirtszelle Herkunft und Schicksal im Laufe der Infektion 12.
Bei der Entwicklung eines Zebrafisch-Larven-Infektionsmodell, wird der gewählte Standort der Mikroinjektion Feststellung der Infektion zunächst lokal oder systemisch. Der systemische Blutinfektionen in die Schwanzvene oder Duct von Cuvier werden am häufigsten verwendet, um mikrobielle Krankheitserreger im Zebrafisch zu untersuchen und sind nützlich für das Studium Interaktionen zwischen Wirt und mikrobiellen Zellen, Zytokin-Antworten, und die Unterschiede in der Virulenz zwischen Erregerstämme. Für langsamere Wachstum von Mikroorganismen kann eine frühe Einspritzung in den Dottersack von Embryos im 16-1,000 Zellstadium für die Mikroinjektion eines langsam wachsenden Mikroorganismus gefunden, zwischen werden verwendet werden, um eine systemische Infektion 13,14 zu erzeugen, mit der optimalen Entwicklungsstadium die 16 bis 128 Zellstadium 15. Allerdings Dottersack Injektionen von vielen Mikroben in späteren Phasen der Entwicklung sind in der Regel tödlich Host zu t zu seiner aufgrund Gastgeber an den nährstoffreichen Umgebung für Mikroben und der Mangel an infiltrierenden Leukozyten 16-18.
Eine lokalisierte Infektion führt in der Regel gerichtete Wanderung von Leukozyten in Richtung der Infektionsstelle, die leicht mit nicht-invasive Abbildungs quantifiziert werden kann. Diese Art der Infektion kann für die Präparation der Mechanismen, die Leukozyten-Migration sowie Untersuchung verschiedener Zugvögel und phagozytischen Funktionen verschiedener Leukozytenpopulationen vermitteln können. Lokalisierte Infektionen sind auch nützlich bei der Prüfung Unterschiede in der Virulenz zwischen Bakterienstämme sowie Studium Mikrobe Invasionsmechanismen seit physischen Host Barrieren müssen für eine lokalisierte Infektion gekreuzt systemischen zu werden werden. Zebrafische sind typischerweise bei Temperaturen von 25-31 ° C 19 angehoben wird, sie können aber auch bei Temperaturen von bis zu 34-35 ° C für die Untersuchung der Invasivität von bestimmten Pathogenen beim Menschen strengen Temperaturanforderungen aufrechterhalten werdenVirulenz 20, 21.
Viele verschiedene Standorte wurden verwendet, um eine anfänglich lokalisierten bakteriellen Infektionen, einschließlich der Hinterhirn Ventrikel 22, dorsalen Schwanzmuskel 18, Perikardhöhle 23 und Ohrbläschen (Ohr) 5, 16, 24 zu erzeugen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass die Injektion von Bakterien in den Ruten Muskel Gewebeschädigung und Entzündung unabhängig von den Bakterien, die bei der Untersuchung Leukozytenreaktion 13 Ergebnisse verzerren können verursachen gefunden. Obwohl weniger Schaden mit Injektion in die Hinterhirn verbunden, und obwohl es zunächst frei von Leukozyten in jungen Embryonen ist das Hinterhirn Ventrikel stetig gewinnt mehr Immunzellen im Laufe der Zeit als Mikroglia Wohnsitz zu nehmen. Das Hinterhirn Ventrikel ist auch ein schwieriger Ort zum Bild. Der Ohrbläschen ist ein geschlossener Hohlraum, ohne direkten Zugang zu dem Gefäßsystem 25, 26. Es ist in der Regel frei von leukocytes, aber Leukozyten an das Ohrbläschen als Antwort auf Entzündungsreize wie Infektion rekrutiert werden. Es ist auch ein bevorzugter Ort der Mikroinjektion von Bakterien in Zebrabärbling Alter von 2-3 Tagen nach der Befruchtung (dpf) wegen der Einfachheit der Bildverarbeitung und die Visualisierung der Injektion. Daher haben wir uns für das Ohrbläschen wie unsere Website von lokalisierten bakteriellen Infektion.
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Protocol
Adulten und embryonalen Zebrafisch wurde in Übereinstimmung mit der University of Wisconsin-Madison Forschung Tier Resources Center erhalten.
1. Vorbereitung Mikroinjektionsnadeln
- Bereiten dünnwandige Glaskapillare Injektionsnadeln (1,0 OD / ID 0,75) mit einer Mikropipette Abzieher Gerät mit den folgenden Einstellungen: Luftdruck 200, Wärme 502, ziehen 90, Geschwindigkeit 80, 70 Mal, Sendezeit zu Beginn des Zieh 5, Sendezeit am Ende des Pull 5.
- Mit einer feinen Pinzette, brechen Sie die Spitze der Nadel gezogen wird, so dass die Spitzenöffnung hat einen Durchmesser von etwa 10 um.
2. Vorbereitung Larven Injection Dishes
- Spülen ein Gel Kamm mit Spurbreite von etwa 4-5 mm in sterilem Wasser und trocknen lassen.
- Bereiten Sie eine 1,5 bis 2% hochschmelz Agaroselösung in E3 Medium 19 und Mikrowelle, bis die Lösung klar ist. Nach dem Abkühlen, gießen Sie etwas von der Agarose in eine Petrischale (100 x 15 mm) und Wirbel,Hinzufügen gerade genug Agarose vollständig zu bedecken den Boden der Schale.
- Sobald die Agaroseschicht erstarrt, legen Sie das ausgespült und getrocknet Gelkamm auf, so dass die nicht-gekämmten Ende nur Ruhe auf der Oberseite der Petrischale und gekämmt Ende der Agarose zu berühren. Sicherzustellen, dass der Kamm so horizontal wie möglich, wodurch ein Winkel von 30 ° mit Bezug auf die Boden Agaroseschicht.
- Gießen einer zusätzlichen kleinen Menge von Agarose an der Grenzfläche zwischen dem Kamm und unteren Agarose-Schicht, so dass der frische Agarose Schicht die Vertiefungen des Kammes. Lassen Sie sie vollständig, bevor Sie den Kamm zu kühlen. Mit einer Pipettenspitze, entfernen Sie alle überstehenden Teile der Agarose aus den Vertiefungen.
- Gießen Sie E3 Medium auf der Spritzgussform und bei 4 ° C.
- Vor jeder Anwendung ersetzen durch frisches Medium und warm Injektionsrampen bei 28,5 ° C für mindestens eine Stunde vor der Injektion.
- Unmittelbar vor der Injektion, ersetzen Sie die E3 an der Einspritzrampe mitE3-Medium, das 200 ug / ml Ethyl-3-aminobenzoat (Tricaine).
3. Vorbereitung S. iniae Inokulum
- Vorzubereiten und autoklaviert Todd Hewitt Broth-Medium mit 0,2% Hefeextrakt und 2% Proteose Pepton (THY + P) ergänzt: 30 g / l Todd Hewitt, 2 g / L Hefeextrakt, 20 g / l Proteose Pepton. Für Agar-Platten, fügen Sie 14 g / l Agar.
- Bereiten Bakterienkulturen in der Nacht vor Infektionen durch Pipettieren von 100 ul-Aliquot gefrorenen bakteriellen Lager in 10 ml THY + P-Brühe in einem verschlossenen 15 ml-Tube. Inkubieren über Nacht ohne Schütteln bei 37 ° C. Nach 14 bis 16 h auf Wachstum, verwenden Sie den Nacht-Kultur entweder Gefrierschrank Aktien oder bereiten für den Einsatz in Injektionen.
- Stellen Gefrierschrank Aktien, indem 1 ml der Übernacht-Kultur in 500 ul 80% Glycerin in einer 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen. Zum Einfrieren und Auftauen zu vermeiden, stellen Sie 100 ul einer bedien Aliquots von dieser Mischung und bei -80 ° C.
- Für S. iniae in infecti verwendetons, verdünnten Übernachtkultur 1: 100 für ein Gesamtvolumen von 10 ml Kultur, indem 0,1 ml der Übernacht-Kultur auf 9,9 ml THY + P Brühe. Wachsen bei 37 ° C ohne Schütteln für ungefähr 4-5 Stunden. Überwachen der optischen Dichte (OD) bei 600 nm unter Verwendung eines Spektrophotometers Nanodrop und Ernte der Bakterien im mittleren logarithmischen Phase bei einer OD600nm 0,250 bis 0,500 erreicht. Einer OD600 nm von 0,250 entspricht etwa 10 8 koloniebildenden Einheiten (CFU) / ml.
- Pelle 1 ml der Bakterienkultur in einem 1,7 ml Zentrifugenröhrchen bei 1500 g für 5 min. Resuspendieren in 1 ml frischem PBS und wiederholen. Messung der OD600 nm von den Bakterien in PBS, Pellets und Resuspendieren in PBS auf die gewünschte Konzentration.
- Um bei der Visualisierung der Mikroinjektion zu unterstützen, fügen Phenolrot auf die Bakteriensuspensionen vor der Injektion bis zu einer Endkonzentration von 0,1%.
- Für Experimente, die die Injektion von durch Hitze abgetöteten Bakterien, erwärmen die Bakterien in PBS bei 95 ° C für 30 min.Bestätigen, dass der Wärmetöteprozess durch Plattieren ein Injektionsvolumen (etwa 1 nl) auf festen THY + P Agarplatten und Inkubation über Nacht bei 37 ° C die Anzahl von lebensfähigen Bakterien auf nicht nachweisbare Niveaus verringert.
4. Kennzeichnung S. inia e mit Celltracker Red Fluoreszenzfarbstoff
- Zum Beschriften lebenden Bakterienzellen, bereiten eine Stammlösung von einem Celltracker Fluoreszenzfarbstoff oder gleichwertig. Da der verwendete Farbstoff wird in 20 x 50 ug Aliquots aus Pulver und muss in DMSO resuspendiert werden, fügen 7,3 ul DMSO zu dem Rohr, um eine 10 mM Stammkonzentration zu erhalten.
- Testen einer Reihe von Farbstoffkonzentrationen (zB 0,5-25 uM) auf die Bakterien, die niedrigste optimale Konzentration, die die Zellen färbt bestimmen. Sich schnell teilende Zellen und mehr Experimenten kann eine höhere Konzentration an Farbstoff erfordert.
- Pellet 1,0 ml Bakterienkultur in einer 1,7-ml-Tube durch Zentrifugation wie oben beschrieben (Abschnitt 3) beschrieben. Das Pellet in 1ml frischem PBS und die erforderliche Menge an Farbstoff in die Bakterienkultur.
- Inkubieren ohne Schütteln bei 37 ° C für 30 min. Anzentrifugieren die Bakterien und Resuspension in 1 ml vorgewärmtes THY + P-Brühe und Inkubieren ohne Schütteln für weitere 30 min bei 37 ° C.
- Spin down die Bakterien und zweimal in PBS zu waschen, bevor die Messung der OD 600 nm und Verdünnung der Bakterien für die Mikroinjektion, wie oben (Abschnitt 3) beschrieben. Wir spritzen typischerweise etwa 100 KBE in 1 nl Injektionsvolumen für unsere Studien über die Rekrutierung von Leukozyten und Phagozytose.
5. Herstellung von Zebrafisch-Larven für Infektionen
- Einrichten Brutpaare in der Nacht vor und sammeln Embryonen von Rosen et al. 27 Inkubieren Embryonen in E3 Medium bei 28,5 ° C, bis Sie sie zu infizieren beschrieben.
- Für Zebrafisch, der abgebildet werden soll, verhindern, dass die Entwicklung von Pigment (Melanisierung) durch Zugabe von N-Phenylthioharnstoff (PTU), um dieE3 Medium bei 24 Stunden nach der Befruchtung (HPF) für eine Endkonzentration von 0,2 nM.
- Bei Infektionen mit Embryonen von Hand mit einer feinen Pinzette im Alter von 2 dpf, dechorionate Embryonen. Alternativ dechorionate Embryonen durch Entfernen E3 und Ersetzen mit Pronase (2 mg / ml) für etwa 5 Minuten oder bis vorsichtiges Pipettieren bricht Embryonen aus dem Chorion. Die meisten Larven sollten natürlich von 3 dpf geschlüpft sind.
- Anesthetize Zebrabärbling mehrere Minuten vor der Infektion, indem dechorionated Larven E3 Medium, enthaltend 200 ug / ml Tricaine.
6. Ohrbläschen Injektion von S. iniae in drei Tage alten Larven
- Schalten Sie den Mikroinjektor und stellen Sie den Zeitbereich auf "Millisekunde". Öffnen Sie das Ventil an der Kohlendioxidtank, Gas in der Leitung zu lassen. Der Druck der Mikroinjektor sollte ungefähr 20 PSI lesen. Stellen Sie den Druck in der Mikroinjektor Einheit durch Rechtsdrehung der schwarzen Rändelschraube für increrleichtert Druck oder im Gegenuhrzeigersinn für vermindertem Druck.
- Vortex die vorbereitet S. iniae Kultur in Phenolrot und PBS und mit einem Microloader Spitze 2-3 ul der Kultur in eine Kapillare gezogen Injektionsnadel zu laden.
- Montieren des beladenen Nadel auf einem Mikromanipulator auf einer magnetischen Ständer und schieben es unter einem Stereomikroskop verbunden, so dass sich die Nadel zu einem um ca. 45-65 ° Winkel mit Bezug auf die Basis des Mikroskops.
- Drücken des Fußpedals des Mikroinjektor, um einen Abfall der Impfkultur auf die Spitze der Nadel zu verzichten. Der Durchmesser des Tropfens mit der Balken in der Augenlinse des Mikroskops.
- Alternativ liegt, den Durchmesser des Tropfens durch Einspritzen eines Volumens in einem Tropfen Mineralöl auf einem Glasobjektträger mit einer Skala bar. Der Durchmesser der Tropfen sollte etwa 0,10 mm, was etwa 1 nl Volumen sein.
- Stellen Sie die Tropfengröße durch Einstellen der Dauer-Einstellung aufdie Mikroinjektor oder Clipping-off mehr der Nadelspitze mit feinen Pinzette. Beachten Sie, dass die Einspritzzeit sollte zwischen 20 - 35 msec zu vermeiden, dass zu viel Gewebeschäden.
- Mit einem Kunststofftransferpipette Transfer 12 narkotisiert Larven in jede Kavität der Spritzform.
- Verwenden Sie einen Glasstab, Haarschleife, oder Kunststoff-Spitze vorsichtig positionieren Sie den Larven, so dass die Köpfe in Richtung der Rückseite des Mikroskops und die Dottersäcke wies sind gegen die linke Seite des Brunnens. Zeigen Sie mit dem linken Ohr der Larve bis zur Decke.
- Blick durch die Augenlinse des Stereomikroskops, verwenden Sie die Knöpfe auf der Mikromanipulator, Line-Up die geladene Nadel mit dem Ohrbläschen, so dass beide im gleichen Sichtfeld. Pierce die äußere Epithelschicht der Ohrbläschen mit der Nadelspitze, so dass die Nadelspitze ist gerade innerhalb der Vesikel.
- Drücken Sie auf das Fußpedal 1 nl der gewünschten Dosis von S. zu injizieren iniae. Achten Sie darauf, eine zu verwendenniedrig genug Druck, um nicht den Hohlraum bersten. Wenn die Injektion erfolgreich, wird der Ohrbläschen, aber nicht des umgebenden Gewebes sollte mit Phenolrot Inokulum (Abbildung 1 Ai) zu füllen. Jede Fehl injiziert Fisch aus der Einspritzplatte unverzüglich entfernen.
- Die Nadel vorsichtig zurückziehen aus der Larve und bewegen Sie die Einspritzplatte mit der Hand, damit die nächste Larve ist nicht in Sicht. Tun Sie dies unter 5fache Vergrößerung.
Anmerkung: Das Zurückziehen der Nadel kann bei der Abscheidung von einigen Bakterien außerhalb des Ohrbläschen, die das Überleben und die Rekrutierung von Leukozyten Ergebnisse verzerren führen. Um dies zu vermeiden, empfiehlt es sich, mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierten Bakterien injizieren und optisch abzutasten injiziert Larven unter einem Fluoreszenzmikroskop, um jede Larven wo dies aufgetreten entfernen. Ein korrekt injiziert Larve in (Abbildung 1 Bi) gezeigt. - Um sicherzustellen, dass das Injektionsvolumen / Impfgut gleich bleibt über den Verlauf des Experiments injiziert einen Tropfen der Bakterien sUSSETZUNG in ein 1,7 ml-Zentrifugenröhrchen, das 100 ul sterilem PBS nach jedem 48. Embryo. Platte, die 100 & mgr; an THY + P-Agar-Platten bei 37 ° C über Nacht, um die CFU in der Einspritzmenge zu bestimmen.
- Wenn die gesamte Gruppe von 12 Larven am Spritzrampe injiziert wurde, sorgfältig mit einem Kunststoff-Transferpipette, damit die Larven aus den Vertiefungen zu entfernen und sie in eine neue Petrischale (35 x 10 mm 2). Entfernen Sie die Tricaine Lösung und ersetzen mit ca. 2 ml frischem E3 Medium, damit die Larven sich zu erholen.
- Pipettieren injiziert Larven in einzelne Wells einer 96-Well-Platte und Inkubation bei 28,5 ° C. Monitor-Larven im Laufe der Zeit für das Überleben in dieser Platten oder später zu entfernen für die Bildgebung oder Keimzahlen.
7. Sudan Schwarz Färbung der Neutrophilen
Anmerkung: Die folgenden Schritte können bei Raumtemperatur in eine kleine Petrischale (35 x 10 mm 2) auf einem Orbitalschüttler sofern ot geschehenchts, sonst angegeben. Für jeden Schritt ist die Menge des verwendeten Reagenz etwa 2 ml pro Schale mit gerade genug Flüssigkeit, um die Larven vollständig bedecken.
- Zur Fixation von infizierten Larven, mit einem Glas Pasteurpipette E3 Medium zu entfernen und ersetzen Sie sie durch eine eiskalte 4% Paraformaldehyd in PBS-Lösung. Sofort den Fisch bei 4 ° C bis einschläfern. Fix Nacht bei 4 ° C.
- 3 Mal Waschen in PBS für jeweils 5 min.
- Fleck mit Sudanschwarz (0,18% Lager 1: 5 verdünnt in 70% Ethanol, 0,1% Phenol) für 30 min bis 5 h. Verwenden Sie ein Stereomikroskop zu überprüfen, ob neutrophile Granula haben Sie den Fleck übernommen.
- Durchführen einer Reihe von 5 min Waschen mit einmaligem Waschen in 70% Ethanol, gefolgt von einmaligem Waschen eines 1: 1-Verhältnis von 70% Ethanol und PBS, gefolgt von einem letzten Waschschritt in PBS.
- Rehydrieren in PBS plus 0,1% Tween (PBT).
- Pigment aus der Larven zu löschen, waschen in 1% Kaliumhydroxid / 1% Wasserstoffperoxid für etwa 6-10 min. Überwachen Sie die Probe Closely und nach ca. 5 min, überprüfen Sie die Larven unter einem Stereomikroskop, um zu sehen, wie viel von dem Pigment wurde gelöscht. Wenn die Lösung auf zu lange, werden die Dottersäcke anschwellen und platzen.
- 3-mal für jeweils 5 min in PBS waschen.
- Bewahren Sie die Proben entweder in PBS oder PBT bei 4 ° C für bis zu 1 Woche bis bereit zu Bild und zählen.
- Um das Bild zu Sudan Schwarz-gefärbten Larven, überweisen Sie den Fisch in PBT und dann in 80% Glycerin und setzen auf eine einzelne Kavität Depression Rutsche. Position unter einem Stereomikroskop mit einer Pipettenspitze fest Larven. Bild mit einem Farbdigitalkamera auf einem Stereomikroskop (Abbildung 1 Aii-iv).
8. Auszählung von lebensfähigen Bakterien von infizierten Larven
- Euthanize Larven zu den gewünschten Zeiten nach der Infektion in einem eiskalten 200-300 mg / l Lösung von Tricaine in E3 Medium.
- Pipettieren eingeschläfert Larven in 1,7 ml Zentrifugenröhrchen. Entfernen Sie die Tricaine Lösung und ersetzen mit 100 ul 0,2%Triton X-100 in PBS (PBSTx).
- Homogenisieren Larven, indem nach oben und unten 10-mal durch eine 27 G Nadel.
- Verdünnungsreihe Homogenate in sterilem PBS. Wenn zum Beispiel das infektiöse Dosis ist 100 CFU, Pipette 100 ul des Homogenisats in 900 ul sterilem PBS. Mit einer neuen Pipettenspitze, dann 100 ul der verdünnten Homogenat in 900 ul sterilem PBS.
- Platte 100 ul der Verdünnungen auf Columbia CNA Agar zur selektiven Isolierung von gram-positiven Bakterien, und bei 37 ° C für 48 Stunden. Dieses Medium größer Auswahl bereitzustellen als die THY + P-Agarplatten, die das Wachstum von sowohl Gram-negative und gram-positive Bakterien unterstützen.
- Auf Platten mit weniger als 500 Einzelkolonien, zählen die Anzahl der Kolonien und multiplizieren Sie mit dem Verdünnungsfaktor, um die Anzahl der CFU bestimmen.
9. Befestigung der Larven für Imaging
- Fix Larven in einem eiskalten 4% Paraformaldehyd in PBS-Lösung als dein Kapitel 7 beschrieben.
- Bei Raumtemperatur, wäscht 3-mal für jeweils 5 min in PBS vor der Bilderzeugung.
10. Herstellung von Larven für Live-Imaging
- Vorbereiten einer 1,5% niedrig schmelzende Agarose-Lösung in E3 durch Erhitzen in der Mikrowelle, bis die Lösung klar ist.
- Zeigen Agarose-Lösung in einem 55 ° C Wasserbad abkühlen lassen, aber nicht hart.
- Hinzufügen Tricaine um die Agarose zu einer Endkonzentration von 0,016%.
- Mit einem Kunststofftransferpipette, legen 4-5 betäubt Larven in einem Glasbodenschale auf der Bühne eines Stereomikroskops.
- Entfernen Sie die Tricaine und Agarose-Lösung aus dem 55 ° C warmen Wasserbad und abkühlen lassen bei Raumtemperatur für 1-2 min. Während die Agarose Abkühlen entfernen so viel Flüssigkeit aus der narkotisierten Larven wie möglich.
- Gießen Sie die Agarose abgekühlt in die Schüssel, bis etwa die Hälfte der Fläche einnehmen. Schwenken Sie die Antenne, um die Agarose zu verbreiten. Beachten Sie, dass, wenn der Agarosezu heiß ist, wird es die Larven zu töten. Auch wenn zu viel Agarose wird in die Schale gegeben, die Objektivlinse des Mikroskops kann den Boden der Schale bei der Fokussierung durch die Agarose getroffen.
- Mit Hilfe einer Transferpipette, nehmen Sie den Larven, die an den Seiten der Schale schwebte haben und pipettieren Sie sie zurück in die Mitte.
- Unter dem Stereomikroskop, sanft positionieren Sie den Larven mit einer Haarschleife, eine lange Pipettenspitze oder einem Glasstab gewünscht. Für die Bildgebung des Ohrbläschen, positionieren Sie den Larven, so dass die linke Ohrbläschen flach auf dem Boden der Schale.
- Lassen Sie die Agarose kühles für ungefähr 10 Minuten, bevor Sie das Gericht. Die Larven können Positionen zu verschieben, wenn die Agarose ist nicht solide. Pipettieren Sie vorsichtig einige Tricaine und E3-Lösung an die Spitze des Agarose-Ebene, um sie feucht zu halten.
11. Die konfokale Bildgebung von Infektions
- Stellen Sie die Glasbodenschale mit Larven auf die Bühne ein inverses Mikroskop mit einer FV-1000 Laser-Scanning-confocal System.
- Legen Sie die Loch auf 200-300 & mgr; m und mit einem numerischen Apertur von 0,75 / 20-fach Objektiv, stellen z-Stacks mit 3-6 & mgr; m-Scheiben.
- Verwenden kontinuierliche Zeilenabtastung, um die Laserleistung und die Detektorverstärkung für jeden Kanal eingestellt werden.
- Mit sequentielle Zeilenabtastung für jeden Fluoreszenzkanal (zB 488 und 543 nm) und Interferenzkontrast (DIC), führen eine Zeitrafferfilm des linken Ohrbläschen alle 3 min für 2-6 h auf anfängliche Einstellung und die Phagozytose von Neutrophilen beobachten und Makrophagen. Bei längeren Zeitverläufe, einen Deckel auf die Petrischale, um Verdunstung und Austrocknung der Agarose verhindern.
- Erwerben Sie Standbilder von festen (1B) oder leben (Abbildung 2) Larven bei 20X oder 40-facher Vergrößerung.
12. Photokonversion von Dendra2-markierten Leukozyten an der Ohrbläschen
Hinweis: Dendra2 kann von grüner zu roter Fluoreszenz photokonvertiertem werdendurch Fokussieren eines 405-nm-Laser (50-70% Laserleistung ausreichend sein) auf die Region von Interesse (ROI) für 1 min. Unten ist die Schritt-für-Schritt-Protokoll für die FV-1000 konfokalen Laserrastersystem verwendet:
- Visualisieren Sie die Probe mit Hilfe eines Z-Stapel-Scan mit der 488 nm und 543 nm-Laser. Verwenden kontinuierliche Zeilenabtastung, die Laserleistung und die Detektorverstärkung ein. Stellen Sie sicher, es gibt keine versehentlich photokonvertiertem rote Fluoreszenz.
- Klicken Sie im Fenster "Image Acquisition Control" unter "Stimulus-Einstellung" wählen Sie die "Use Scanner" -Tool und wählen Sie "main". Wählen Sie die 405-nm-Laser und legen Sie sie bei 70% Leistung. Mit der Option Kreis definieren Sie den ROI im Ohrbläschen.
- Unter "Stimulus Starten einstellen" die Option "Aktivierung in Reihe" mit einer Voraktivierung 1 Rahmen und einer Aktivierungszeit von 60.000 ms. Klicken Sie im Fenster unter dem "Erwerb Einstellung" "Zeit Scan Überschrift" Wählen Sie 2 inAbständen von 0.01.00 (eine für die Vor- und eine für postPhotoKonversion).
Hinweis: Nach der Zeitserie Scan abgeschlossen ist, sollte die Dendra2 worden, um seinen roten fluoreszierenden Zustand photokonvertiertem haben. - Scannen der Probe durch eine z-Stapels unter Verwendung der 488 nm und 543 nm-Laser, um die photokonvertiertem rote Fluoreszenz sowie restliche grüne Fluoreszenz (Figur 3) zu visualisieren.
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Representative Results
Mikroinjektion von S. iniae in das Ohrbläschen (Abbildung 1 und 2) zu einer Reaktion zunächst lokalisiert Host. Wenn korrekt injiziert, sollten die Bakterien nur in der Ohrbläschen und nicht in das umliegende Gewebe oder Blut zu erkennen. Dies kann bei der Mikroinjektion mit Phenolrot-Farbstoff (1A) sichtbar gemacht werden. Alternativ, wenn markierten Bakterien injiziert werden, einen schnellen Scan des infizierten Larven sofort nach der Injektion kann bestätigen, die Bakterien nur in der Ohrbläschen und nicht das umliegende Gewebe (Abbildung 1B). Obwohl eine Dosis weniger als 10 KBE Wildtyp-S iniae Lage ist, eine tödliche Infektion innerhalb von 24-48 Stunden nach der Infektion (hpi), Injektion von 1000 CFU eines virulenten Stammes, CPSA zu etablieren, nicht in tödliche Infektion zur Folge haben, dass der Stamm und scheint nicht in der Lage im Gast 24 vermehren. Somit ist diese lokalisierten Infektionsmodell in der Lage, differentiate zwischen bakteriellen Stämmen veränderte Virulenz.
Mikroinjektionsstellen zunächst lokalisierte Infektion sind nützlich für das Studium Chemotaxis der Leukozyten. Leukozytenrekrutierung kann entweder durch Sudan Schwarz Färbung von neutrophilen Granula (1A) oder Formaldehydfixierung von fluoreszierenden transgenen Linien (1B) quantifiziert durch. Um die Einstellung und phagozytischen Funktionen von Immunzellen sichtbar zu machen, und zwar in Makrophagen haben wir transgene Linien das grün fluoreszierende Protein Dendra2 Ausdruck Tg (mpeg1: Dendra2) 24 oder Neutrophile Tg (mpx: Dendra2) 12. Wenn S. iniae in das Ohrbläschen von 3 dpf Larven injiziert werden beide Neutrophilen und Makrophagen rasch innerhalb der ersten 2 hpi (Figur 1) eingestellt. Allerdings, wenn sie richtig durchgeführt wird, die Mikroinjektion von PBS in das Ohrbläschen nicht auf die gleiche robuste Einstellung von Host Leukozyten führen (
Abbildung 2: Phagozytose von S. iniae von Phagozyten in der Ohrbläschen Transgene mpx. Dendra2 (A) oder MPEG1: Dendra2 (B) Larve mit rot-markierten S. infiziert iniae (in magenta dargestellt) und 60 min nach der Infektion mit einem Laser scann abgebildeting konfokalen Mikroskop. Maßstabsbalken, 30 um. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
Abbildung 3: Photokonversion von Makrophagen an der Ohrbläschen 5 hpi mit S. iniae. Makrophagen (in grün dargestellt) an der Ohrbläschen, der durch den Kreis (A) bezeichnet wird, wurden durch Photo (B) unter Verwendung eines 405 nm Laser auf einem konfokalen Mikroskop, und über die Zeit verfolgt. Mit 24 hpi, photokonvertiertem Makrophagen (in magenta dargestellt) haben bis zum Kofferraum / Schwanz hämatopoetischen Gewebe (C) migriert; Maßstab, 50 um. Höhere Vergrößerungen der boxed Regionen in C werden in (i) und (ii), Maßstabsbalken 30 um gezeigt; Pfeile zeigen auf photoconumgewandelt Makrophagen. Photokonvertiertem Zellen erscheinen weiß, weil der fusionierten 543 nm rote Fluoreszenz und der verbleibende 488 nm grüne Fluoreszenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.
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Discussion
Die Infektion Verfahren verwendet hier ist nützlich für die Untersuchung der Immunantwort des Wirts zu einer anfänglich lokalisierten Infektion bei 2-3 dpf Embryonen und Larven. Der Fokus eines Entzündungsreiz, wie Infektion, in einem geschlossenen Hohlraum, wie der Ohrbläschen ermöglicht die Untersuchung von Neutrophilen und Makrophagen-Chemotaxis und Phagozytose. Eine Einschränkung des Injizierens von Bakterien in das Ohrbläschen ist, daß die Fähigkeit von Neutrophilen, effizient phagozytieren Bakterien in mit Flüssigkeit gefüllte Hohlräume können abhängig von dem jeweiligen Mikroorganismus sein. Obwohl Escherichia coli und Bacillus subtilis werden nicht leicht durch Neutrophile in der Ohrbläschen 28 phagozytiert haben wir gefunden, daß Neutrophile in der Lage sind, sowohl Pseudomonas aeruginosa und S. phagozytieren iniae in diesem Ort 16, 24. Lokalisierte Infektion ist auch nützlich bei der Untersuchung der Invasivität von verschiedenen Krankheitserregern. Um eine systemische Infektion folgenden i verursachennjection in einen geschlossenen Hohlraum, wie die Ohrbläschen, muss die Mikrobe in der Lage, physische Host-Barrieren zu durchlaufen sein. Alternativ können unterschiedliche Pathogene auf Wirtszellen für den Transport und die Verbreitung von der anfänglichen Stelle der Infektion zu verlassen. Dies macht lokalisierte Injektionen nützlich für den Vergleich Stämme von veränderten Virulenz.
Während der Mikroinjektion, um Bakterien zu vermeiden, Absetzen und Verstopfen der Nadel, ändern Nadeln entweder nach jedem Zustand oder nach etwa 50 Larven. Dies wird dazu beitragen sicherzustellen, dass die Suspension in der Nadel ist gleichmäßiger. Wenn Beilegung von Bakterien in der Nadel scheint ein Problem, eine Mischung aus PBS, 2% PVP40 und 10% Glycerin sein können dazu beitragen, dass eine homogene Suspension. Um sicherzustellen, dass jeder Larve wird mit etwa der gleichen Anzahl von Bakterien injiziert, überprüfen Keimzahlen durch Homogenisierung eine Larve unmittelbar nach der Injektion und Beschichtung des Homogenats auf CNA-Agar. CNA Agar wird nicht nur für das Wachstum der kultivierbaren grampositiven Bakterien auszuwählen,S. iniae, aber es liefert eine Vorstellung davon, wie konsequent die Injektionsdosen liegen zwischen jedem einzelnen Larve. Mit einem Ziel Inokulum von 100 CFU pro Larve gibt es typischerweise zwischen 75-150 Kolonien auf einem CNA Platte. Die Anzahl der nicht-S. iniae gram-positive Kolonien wachsen auf einem CNA Platte ist wahrscheinlich sehr gering ist, da die meisten PBS injiziert Fisch Regel führen zwischen 0-20 Kolonien. Zu späteren Zeitpunkten während der Infektion ist es nicht ungewöhnlich, dass es eine Variation von bis zu sein zu einem halben log der Keimzahl zwischen Larven mit derselben infektiöse Dosis infiziert. Dies kann geringfügige Unterschiede zwischen den einzelnen Larve in ihrer Fähigkeit zur Bekämpfung der Infektion darstellen oder könnte Unterschiede in der Höhe der kultivierbaren gram-positive Bakterien in den Larven oder E3 Medium zu reflektieren.
Während der Injektion in den Ohrbläschen, ist es wichtig, nicht zu großes Volumen oder mit einem zu hohen Druck, wie dies kann bewirken, dass der Hohlraum zu Bruch zu injizieren. Injektionsvolumina shoULD etwa 1 nl gehalten werden. Wenn die Nadel zu groß ist, kann die Mikroinjektion eine Beschädigung des umgebenden Gewebes, die die Einstellung von Wirts Leukozyten an der Stelle der Infektion beeinflussen kann oder können die Bakterien aus der Ohrbläschen Eintritt führen. Es ist auch wichtig, um die Injektion in den richtigen Platz zu bestätigen. Wenn die Nadel zu tief eingesetzt, kann es durch das Ohrbläschen stecken oder es kann Blutgefäße rund um das Ohrbläschen fließt getroffen. Dies kann zur Ablagerung von Bakterien in die Blutbahn oder außerhalb der Vesikel, die Wirtsreaktionen verändern können, führen.
Es ist auch möglich, dass, wenn die Nadel entnommen wird, einige Bakterien können zufällig außerhalb der Ohrbläschen abgeschieden, wie durch Colucci-Guyon et al. 28 gezeigt werden, aber wir feststellen, daß dies nur in weniger als 5% der Injektionen der Fall sein. Der Versuch, in der Mitte des Ohrbläschen injizieren kann dazu beitragen, diese Situation zu vermeiden. In einer erfolgreichen Infektion sollte die Ohrbläschen bis w füllenit der Phenolrot-Farbstoff, aber der Farbstoff nicht austreten in das umliegende Gewebe. Jede Fehl injizierten Larven sollten sofort beseitigt werden. Injizieren markierten Bakterien ist ein nützlicher Weg, um eine erfolgreiche Injektion (1B) bestätigt. Einer der Nachteile der Verwendung eines Celltracker Farbstoff ist, dass dieser Farbstoff werden verdünnte, da die Bakterien zu unterteilen, so dass schließlich die Bakterien davor, unter Fluoreszenz sichtbar gemacht. Wir haben uns für einen roten Farbstoff verwendet, weil wir aus grün-markierten Neutrophilen und Makrophagen-transgenen Linien für die meisten unserer Studien.
Dendra2 ist ein Photokonvertierbare Protein aus octocoral Dendronephthya sp. die aus einem grünen auf einem roten fluoreszierenden Zustand mit einem 405 nm Laser 29 photokonvertiertem werden kann. Diese Photo ist eine nichtinvasive Weise, Zellen zu markieren und zu verfolgen ihr Schicksal im Laufe der Infektion. Leukozyten an der Stelle der Infektion rekrutiert kann photokonvertiertem und über die Zeit verfolgt, um ihre d überwachenERBREITUNG gesamten Wirtsgewebe (Abbildung 3). Alternativ könnte Leukozyten vor der Infektion photokonvertiertem und überwacht werden post-Mikroinjektion, den Ursprung der Zellen an den Ort der Infektion zu bestimmen, dann rekrutiert. Kennzeichnung Bakterien und Immunzellen können für die Untersuchung der Leukozyten-Pathogen-Interaktionen in vivo einschließlich der Rekrutierung und Phagozytose (1B und Abbildung 2). Unterscheidung der roten markierten S. iniae von der roten Fluoreszenz eines photokonvertiertem Leukozyten schwierig ist, so dass eine unterschiedliche Fluoreszenzcelltracker Farbstoff verwendet werden könnten. Dies wäre besonders nützlich, um zu bestimmen, welche der photokonvertiertem Immunzellen, die Ohrbläschen lassen S enthalten iniae.
Zukünftige Anwendungen der Ohrbläschen infizieren könnten Messung der Geschwindigkeit und Ausrichtung, mit der Neutrophilen und Makrophagen als Reaktion auf verschiedene Infektionen zu verschieben. Die Infektion kinetics kann auch untersucht werden, um festzustellen, welche Zelltypen der Erste, der einen Ort der Infektion und dem Zelltypen sind die meisten robust neben dem die Zellen stammen oder wo sie zu verbreiten 30 rekrutiert anreisen. Neben der Untersuchung des Interesses an einer anfänglich lokalisierten Infektion kann dieses Infektionsmodell verwendet, um die Funktion des Wirtsimmunsystems Komponenten während der anfänglichen Infektion zu studieren. Antisense-Morpholino-Oligonukleotide, die bestimmte RNAs Ziel verwendet werden, um knock down Ausdruck der Immunkomponenten einschließlich Toll-like Rezeptoren, Zytokin-Rezeptoren und Leukozyten und werden CRISPR-Cas oder TALEN Technologie kann verwendet werden, um genetische Mutanten erstellen. Genexpression unter Verwendung RNAseq oder qPCR können auch verwendet werden, um die Expression bestimmter Gene in Wirtsantwort auf eine Infektion zu charakterisieren.
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Acknowledgments
Die Autoren bedanken sich bei Labormitglieder für Zebrafisch Pflege und Wartung zu danken. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 EA Harvie und NIH R01GM074827 Anna Huttenlocher unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
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