Abstract
su patojen, Streptococcus iniae, su ürünleri sektörü için yıllık kayıpları 100 milyon dolar sorumludur ve balık ve insanlarda hem de sistemik hastalığa neden yeteneğine sahiptir. S. daha iyi anlaşılması iniae hastalığı patogenezinde uygun bir model sistem gerektirir. floresan bağışıklık hücrelerini etiketli ile genetik tractability ve Zebra balığı erken gelişim evrelerinde optik şeffaflık transgenik hatları üretimi ve non-invaziv görüntüleme için izin verir. birkaç hafta döllenme sonrası dek adaptif bağışıklık sistemi tamamen işlevsel değil, ama Zebra balığı larvaları nötrofiller ve makrofajlar hem korunmuş omurgalı doğuştan gelen bağışıklık sistemi var. Böylece, bir larva enfeksiyon modelinin üretimi S. kontrol sırasında bağışıklık özel katkı çalışma sağlar iniae enfeksiyonu.
Mikroenjeksiyon site bir enfeksiyon olup olmadığını belirleyeceksistemik ya da ilk olarak lokalize. Burada, biz otik vezikül Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası döllenme enjeksiyonu yanı sıra enfeksiyon floresan konfokal görüntüleme için teknikler bizim protokolleri sunuyoruz. Bir lokalize enfeksiyon sitesi ilk mikrop istilası gözlem, konak hücrelerin işe ve enfeksiyon yayılmasını sağlar. S. Zebra balığı larva modelini kullanarak Bulgularımız iniae enfeksiyonu zebra balığı lokalize bakteriyel enfeksiyonların konakçı nötrofil ve makrofajların farklı katkıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Buna ek olarak, bağışıklık hücrelerinin photolabeling enfeksiyonun seyri sırasında bireysel konakçı hücre gelişmeyi izlemek için kullanılabilir açıklanmıştır.
Introduction
Streptococcus iniae balık ve insanlarda 1 hem de sistemik hastalığa sebep olup büyük bir su patojendir. S. iken iniae su ürünleri sektöründe büyük kayıplar için sorumlu, aynı zamanda diğer streptokok insan patojenlerin neden olanlara benzer klinik patolojilerin ile bağışıklığı insan konaklarda hastalığa neden yeteneğine potansiyel zoonotik patojen olduğunu. Insan patojenleri ile benzerlikler göz önüne alındığında, bu çalışma S. önemlidir Doğal ev sahibi bağlamında iniae hastalığı patogenezi. S. Bir yetişkin zebrabalıkları modeli iniae enfeksiyonu enfeksiyon lokalize sitede yanı sıra ölümü barındırmak için hızlı bir zaman ev sahibi lökositlerin sağlam infiltrasyonu ortaya, çok kısa bir zaman adaptif bağışıklık sistemini 7 dahil etmek. Kazanmak için bir derinlemesine S. doğuştan bağışıklık yanıtı içine bakmak in vivo enfeksiyon iniae, bu n daha uygun bir model kullanmak için gerekli olanon-invaziv canlı görüntüleme.
larva Zebra balığı bu konak-patojen etkileşimleri çalışmak için giderek cazip omurgalı modeli yapmak avantajları bir numarası vardır. Balığı kullanımı ve memeli modellere göre korumak için nispeten ucuz ve kolaydır. Adaptif bağışıklık 4-6 hafta sonrası döllenme kadar işlevsel olgun değil, fakat larva fagositozu ve solunum patlaması 2-6 olmak üzere antimikrobiyal özellikleri ile tamamlayıcısı, Toll benzeri reseptörler, sitokinler, ve nötrofiller ve makrofajlar ile yüksek oranda korunmuş omurgalı doğuştan bağışıklık sistemine sahip, 8-11. Buna ek olarak, genetik izlenebilirliği ve geliştirme embriyonik ve larva aşamalarında optik saydamlık ile floresanla işaretlenmiş bağışıklık hücreleri mümkün in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak konukçu-patojen etkileşimlerine incelemek için yapım kararlı transgenik hatların üretilmesine izin verir. örneğin Den bir photoconvertible proteini kullanılarak bu transjenik nesildra2 enfeksiyonu 12 boyunca bireysel konak hücre kökeni ve kaderi takibi sağlar.
Bir Zebra balığı larva enfeksiyon modeli geliştirirken, mikroenjeksiyon seçilen site, enfeksiyon başlangıçta lokalize veya sistemik olup olmadığını belirleyecektir. Kaudal ven veya Cuvier ve Duct içine sistemik kan enfeksiyonları en sık zebrabalıkları mikrobiyal patojenlerin incelemek için kullanılan ve patojen suşları arasında virulenslikte ev sahibi ve mikrobiyal hücrelerin, sitokin yanıtları ve farklılıklar arasındaki etkileşimleri incelemek için yararlı olmaktadır. Yavaş gelişen mikroorganizmalar için, 16-1,000 hücre aşamasında bir embriyo yumurta sarısı kesesinin içine ilk enjeksiyon arasında olduğu bir yavaş büyüyen mikroorganizmaların mikroenjeksiyon için uygun gelişim aşamasında olan, sistemik bir enfeksiyon 13,14 oluşturmak için kullanılabilir 16-128 hücre aşaması 15. Ancak, ev sahibi gelişiminin sonraki aşamalarında birçok mikropların kesesi enjeksiyonları sarısı t öldürücü olma eğilimindedirO lökositler 16-18 sızma mikrop ve eksikliği için besin açısından zengin bir ortamda nedeniyle ev sahipliği.
Bir lokalize enfeksiyon genellikle kolayca non-invaziv görüntüleme ile ölçülebilir enfeksiyon sitenin yönelik lökositlerin yönettiği göç sonuçlanır. Enfeksiyon Bu tür lökosit göçünü yanı sıra çeşitli lökosit popülasyonlarının farklı göçmen ve fagositik yetenekleri soruşturma aracılık mekanizmaların diseksiyon için izin verebilirsiniz. Bakteri türleri arasındaki virulenslikte farklılıkları inceleyen yanı sıra fiziksel ana engeller sistemik olmak için yerelleştirilmiş enfeksiyonu için geçti gerekir çünkü mikrop istilası mekanizmaları okuyan zaman lokalize enfeksiyonlar da yararlıdır. Balığı, tipik olarak 25-31 ° C 19 arasındaki sıcaklıklarda yetiştirilir fakat aynı zamanda sıkı bir sıcaklık şartlarına belirli insan patojen invaziflik çalışmaları için 34-35 ° C kadar yüksek bir sıcaklıkta muhafaza edilebilirvirülans 20, 21.
Birçok farklı sitelerde Beyin ventrikül 22, sırt kuyruk kas 18, perikardiyal boşluğu 23 ve otik vezikül (kulak) 5, 16, 24 dahil olmak üzere bir ilk lokal bakteriyel enfeksiyonun oluşturmak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, lökosit yanıtı 13 araştırılırken sonuçları çarpıtabilir bakteri, doku hasarı ve inflamasyon bağımsız neden olabilir kuyruk kas içine bakteri enjeksiyonunun bulunmuştur. Daha az hasar Beyin içine enjeksiyonu ile ilişkili ve genç embriyoların lökositlerin başlangıçta yoksun olmasına rağmen mikrogliya ikamet almak gibi, Beyin ventrikül giderek zamanla daha bağışıklık hücrelerini kazanır rağmen. Beyin ventrikül da görüntü bir daha zor bir konumdur. otik vezikül damar 25, 26 doğrudan erişimi olan kapalı içi boş boşluktur. Bu leu normal olarak yoksunkocytes ama lökositlerin enfeksiyon gibi iltihap uyarıcıya tepki olarak otik veziküle iyileştirilebilirler. Aynı zamanda, çünkü görüntüleme kolaylığı ve enjeksiyon görselleştirme Zebra balığı yaşlı 2-3 gün sonrası fertilizasyon (dpf) bakteri mikroenjeksiyon tercih edilen bir sitedir. Bu nedenle, biz lokalize bakteriyel enfeksiyon sitemizde olarak otik vezikül seçti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin ve embriyonik zebra balığı Wisconsin-Madison Araştırma Hayvan Kaynakları Merkezi Üniversitesi uyarınca tutuldu.
1. Mikroenjeksiyon İğneleri hazırlanması
- Çekme 5, hava zaman başında, hız 80, zaman 70, hava saati, hava basıncı 200, ısı 502 90 çekin: Aşağıdaki ayarlarla bir mikropipet çektirmesi cihazı kullanılarak ince duvar cam kılcal enjeksiyon iğneler (1.0 OD / 0.75 ID) hazırlayın çekme 5 sonunda.
- Ucu açıklığı yaklaşık 10 mikron bir çapa sahip olacak şekilde çekilmiş iğne ucu kesiyorum, ince cımbız kullanarak.
2. hazırlanması Larva Enjeksiyon Yemekleri
- Steril su içinde yaklaşık 4-5 mm şerit genişliği ile bir jel tarağı durulayın ve kurumaya bırakın.
- Çözelti berraklaşıncaya kadar E3 orta 19 ve mikrodalgada% 1.5-2, yüksek erime sıcaklığı olan agaroz çözelti hazırlayın. Soğutulmuş sonra, bir Petri kutusu (100 x 15 mm), girdap içine agaroz bazı dökünyeterli agaroz ekleyerek tamamen çanak alt kapsayacak.
- Agaroz tabaka katılaşmış sonra olmayan penye sonu sadece Petri kabı üstünde dinlenme ve penye son agaroz dokunmadan böylece, üstüne durulanır ve kurutulur jel tarağı yerleştirin. Alt agaroz tabakası ile ilgili 30 ° açı oluşturarak, tarak mümkün olduğunca yatay olduğundan emin olun.
- Taze agaroz katman petek kuyuları kapsayacak şekilde tarak ve alt katmanda agaroz arasındaki arayüzde agaroz ek bir miktar dökün. Tarağı çıkarmadan önce tamamen soğumasını bekleyin. Bir pipet ucu kullanarak, kuyulardan agaroz herhangi sarkan parçalarını çıkartın.
- 4 ° C 'de enjeksiyon kalıp ve deponun üst E3 orta dökün.
- Her kullanımdan önce, enjeksiyondan önce, en azından bir saat için 28.5 ° C'da taze ortam ve sıcak enjeksiyon rampaları ile değiştirin.
- Hemen önce enjeksiyonları, enjeksiyon rampası E3 yerine200 ug / ml, etil 3-aminobenzoat (tricaine) ihtiva eden E3 ortamı.
3. S. hazırlanması iniae Aşı
- % 0.2 maya ekstresi ve% 2 proteoz pepton (THY + P) ile takviye edilmiş, Todd Hewitt brotu ortamı hazırlamak ve otoklav: 30 g / L, Todd Hewitt, 2 g / L maya ekstresi, 20 g / L proteoz pepton. Agar plakaları için, 14 g / L agar ekleyin.
- Kapalı bir 15 ml tüp içinde THY + U suyu 10 ml donmuş bakteri stokunun 100 ul kısım pipetleme enfeksiyonlar önce, bakteri kültürleri gece hazırlayın. 37 ° C'de çalkalama olmadan gece boyunca inkübe edin. Büyüme 14-16 saat sonra, derin dondurucu stokları yapmak veya enjeksiyon kullanılmak üzere hazırlamak için ya gecede kültür kullanın.
- 1.7 ml'lik bir santrifüj tüpü içinde% 80 gliserol, 500 ul, gece boyunca kültürün 1 ml yerleştirerek dondurucu stokları olun. , Donma-erime döngülerinden kaçınmak -80 ° C'de bu karışıma ve deposundan 100 ul tek kullanımlık alikotları sağlamak.
- S. iniae infecti kullanılanTHY + U suyu 9.9 ml, gece boyunca kültürün 0.1 mi eklenerek 10 mi kültür toplam hacim 100: ons, gece boyunca kültürün 1 seyreltin. Yaklaşık 4-5 saat boyunca ajitasyon olmadan 37 ° C'de büyür. Nanodrop spektrofotometre kullanılarak 600 nm'de optik yoğunluk (OD) Monitör ve OD600'e nm 0,250-0,500 ulaştığında orta-logaritmik fazda bakteri hasat. 0.250 arasında bir OD600 nm yaklaşık olarak 10 8 koloni oluşturan birim (CFU) / ml sine tekabül eder.
- 5 dakika boyunca 1500 x g'de 1,7 ml santrifüj tüpü içinde bakteri kültürü 1 ml Pelet. Taze PBS ve tekrarın 1 ml süspanse. PBS içinde bakteri OD600 nm ölçün, PBS içinde topak ve tekrar süspansiyon, istenen konsantrasyon elde etmek.
- Mikroenjeksiyon görselleştirilmesine yardımcı% 0.1 bir son konsantrasyona için enjeksiyondan önce bakteriyel süspansiyonlar, kırmızı fenol ekleyin.
- Isı ile öldürülmüş bakterilerin enjeksiyonunu içeren deneyler için, 30 dakika boyunca 95 ° C de PBS içinde bakteri ısıtın.Isı-öldürme işlemi katı THY + U agar plakaları üzerinde bir enjeksiyon hacmi (yaklaşık olarak 1 nl) kaplama ve 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilerek tespit edilemez seviyelere canlı bakteri sayısını azalttığını emin olun.
4. Etiketleme S. Bir CellTracker kırmızı bir floresan boya ile Inia E
- Bakteriyel canlı hücreler etiketlemek için, bir CellTracker flüoresan boya veya eşdeğer bir stok solüsyonu hazırlanır. Kullanılan bir boya tozunun 20 x 50 ug parçalar halinde gelir ve DMSO içinde yeniden süspansiyon haline getirildi gereken zamanda, bir 10 mM stok konsantrasyonu elde etmek üzere tüpe ul DMSO 7.3 ekleyin.
- Hücreleri boyayan düşük optimal konsantrasyonunu belirlemek için bakteriler üzerinde boya konsantrasyonları (örneğin, 0,5-25 uM), bir dizi test edin. Hızla bölünen hücreler ve daha uzun deney boyanın daha yüksek bir konsantrasyon gerekebilir.
- (Bölüm 3) yukarıda tarif edildiği gibi santrifüj ile 1.7 ml tüp içinde bakteri kültürü 1.0 ml pelet. 1 pelet yeniden süspanseTaze PBS ml ve bakteri kültürüne boya uygun hacim ekleyin.
- 30 dakika süreyle 37 ° C'de çalkalama olmaksızın inkübe edin. Önceden ısıtılmış THY + U suyu, 1 ml bakteri ve tekrar süspansiyon Spin ve 37 ° C'de ek bir 30 dakika boyunca çalkalama olmaksızın inkübe edin.
- Bakterileri aşağı spin ve OD600'e nm ölçme ve (bölüm 3) Yukarıda ayrıntılı olarak mikroenjeksiyon için bakterileri seyreltilmesi önce PBS içinde iki kez yıkayın. Biz genellikle lökosit işe ve fagositoz bizim çalışmaları için 1 nl enjeksiyon hacmi yaklaşık 100 CFU enjekte.
Enfeksiyonlar için Zebra balığı Larva 5. hazırlanması
- Önceki gece üreyen kurmak ve enfekte hazır olana kadar 28.5 ° C E3 ortamında Rosen ve ark. 27 inkübe embriyolar tarafından açıklanan embriyolar toplamak.
- Yansıması olacak Zebra balığı için, N-feniltiyoüre (PTU) ekleyerek pigment (melanizm) gelişimini önlemek0.2 nM'lik bir son konsantrasyon için 24 saat sonra fertilizasyon (HPF) ile E3 ortamı.
- Embriyoların içeren enfeksiyonlarında elle ince bir cımbız ile, dechorionate embriyolar 2 dpf yaş. Seçenek olarak ise, E3 ayrılması ve yaklaşık 5 dakika için ya da yumuşak pipetleme kadar Pronaz (2 mg / ml) ile değiştirerek dechorionate embriyolar koryon üzerinden embriyolar keser. Çoğu Larvalar 3 dpf'e tarafından doğal yumurtadan olmalıdır.
- 200 ug / ml tricaine ihtiva E3 ortam içine dechorionated larvaları yerleştirerek enfeksiyon öncesinde zebra balığı birkaç dakika anestezisi.
S. 6. Kulakla Vesikül Enjeksiyon Üç Gün Eski Larva içine iniae
- Mikropüskürtücü açın ve "milisaniye" zaman aralığını ayarlayın. Hattına gaz izin karbondioksit tankı üzerindeki valfi açın. mikropüskürtücü basıncı yaklaşık 20 PSI okumalısınız. Artır siyah tırtıllı topuzu saat yönünde döndürülmesi ile mikropüskürtücü ünitesinde basıncını ayarlayınazalmış basınç dönüm yönünün tersine basınç veya hafifletti.
- Hazırlanan S. vorteks fenol kırmızısı ve PBS ve Microloader ucu kullanın içinde iniae kültür çekti kılcal enjeksiyon iğne içine kültür 2-3 ul yüklemek için.
- İğne mikroskop tabana göre 45-65 ° bir açı yaklaşık şekilde bir stereo mikroskop altında manyetik bir stand ve konum olarak bağlı bir mikromanipülatör yüklü iğne monte edin.
- Mikropüskürtücü ayak pedalına basın iğne ucu üzerine inokulum bir damla dağıtmak için. Mikroskop göz lens ölçek çubuğunu kullanarak damla çapını ölçün.
- Seçenek olarak ise, bir ölçek çubuğu ile cam bir mikroskop lamı üzerine bir mineral yağ damla bir hacim enjekte edilerek damla çapı tahmin edilmektedir. damla çapı 1 Nl hacmi yaklaşık yaklaşık 0.10 mm olması gerekmektedir.
- Ayarını süresini ayarlayarak damla boyutunu ayarlayınmikropüskürtücü veya ince cımbız ile iğne ucu daha kapalı kırpma yoluyla. Çok fazla doku hasarı oluşmasını önlemek için 35 msn - enjeksiyon süresi 20 arasında olması gerektiğini unutmayın.
- Plastik bir transfer pipeti kullanarak, nakil 12 enjeksiyon kalıbın her kuyuya larva anestezi.
- Iyi sol tarafına karşı başları mikroskop ve yumurta sarısı kesesi arkasına doğru işaret böylece hafifçe larvaları konumlandırmak için bir cam çubuk, saç döngü veya plastik ucu kullanın. Tavana doğru larva kadar sol kulağını yöneltin.
- Stereomikroskopta göz merceğinden bakıldığında, her iki görüş aynı alanda böylece otik vezikül ile yüklenen iğne sıraya mikromanipülatör düğmeleri kullanın. Pierce iğne ucu ile otik vezikül dış epitel tabakası böylece iğne ucu sadece vezikül içinde.
- Ayak pedalına basın S. istenen dozu 1 nl enjekte iniae. Bir kullandığınızdan emin olunyeterince düşük basınç boşluğu yırtmak şekilde değil. Enjeksiyon başarılı olursa, kulak vezikül, ancak çevredeki doku, fenol kırmızı inokulum (Şekil 1 Ai) ile doldurmalısınız. Hemen enjeksiyon plakası herhangi bir yanlış enjekte balık çıkarın.
- Dikkatle larva dışarı iğne geri çekin ve bir sonraki larva görünümünde böylece elle enjeksiyon plakasını taşıyın. 5X büyütme altında yapın.
Not: iğne geri çekilme hayatta kalma ve lökosit işe sonuçlarını çarpık olabilir otik vezikül dışında bazı bakteri, birikimi neden olabilir. Bunu önlemek için, bu flüoresan boya etiketli bakteriler enjekte etmek ve görsel olarak meydana gelen herhangi bir larva kaldırmak için flüoresan mikroskop altında enjekte larvaları taranması tavsiye edilir. Doğru şekilde enjekte larvası (Şekil 1 'Bi)' de gösterilmiştir. - Enjeksiyon hacmi / inokulum deney boyunca aynı kalmasını sağlamak için, bakteriyel s damla enjekteHer 48. embriyo sonra steril PBS içinde 100 ul ihtiva eden bir 1.7 ml'lik bir santrifüj tüpüne Askı. Enjeksiyon hacmi içinde CFU'nun saptanması için bir gece boyunca 37 ° C'de THY + U agar plakaları üzerinde 100 ul Plate.
- Enjeksiyon rampası 12 larvaların tüm grup enjekte edildiğinde, dikkatle kuyulardan gelen larva kaldırmak ve yeni bir Petri kabı (35 x 10 mm 2) içine yerleştirmek için plastik bir transfer pipet kullanın. Tricaine çözüm çıkarın ve larva kurtarmak için izin yaklaşık 2 ml taze E3 ortamı ile değiştirin.
- Pipet, 96 oyuklu bir plaka, tekli oyuklar içine larvaları enjekte edildi ve 28.5 ° C sıcaklıkta inkübe edilir. Bu plakalar hayatta kalmak için zamanla larvaları Monitör veya görüntüleme veya CFU sayımları için daha sonra kaldırın.
Nötrofiller 7. Sudan Black Boyama
Not: Aşağıdaki adımlar yerine sürece orbital bir karıştırıcı üzerinde küçük bir petri kabının (35 x 10 mm 2) içinde, oda sıcaklığında yapılabilirherwise belirtti. Her bir aşama için kullanılan reaktif miktarı, tam larvaları kaplamak için yeterli miktarda bir sıvı ile tabak başına 2 mi, yaklaşık.
- Enfekte larva sabitlenmesi E3 orta kaldırmak ve PBS çözeltisi içinde bir buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit ile değiştirmek için bir cam Pasteur pipet kullanın. Hemen ötenazi 4 ° C 'de balık yerleştirin. 4 ° C de bir gece düzeltildi.
- 5 dakika her biri için PBS içinde 3 kez yıkanır.
- 5 saat 30 dakika boyunca Sudan Siyahı Leke (% 70 etanol,% 0.1 fenol, 5% 0.18 stok 1 seyreltilmiş). Nötrofil granüller leke almış olmadığını kontrol etmek için bir stereomikroskopta kullanın.
- PBS içinde bir son yıkama olarak% 70 etanol ve PBS 1 oranında bir 1: tek yıkama olarak% 70 etanol içinde tek bir yıkama ile başlayan 5 dakika bir dizi yıkama yapın.
- PBS artı% 0.1 tween (PBT) içine rehydrate.
- Larvaları pigment temizlemek için, yaklaşık 6-10 dakika için% 1 potasyum hidroksit /% 1 hidrojen peroksit yıkayın. Örnek closel Monitöry ve yaklaşık 5 dakika sonra, temizlenmiş ne kadar pigment görmek için bir stereo mikroskop altında larvaları kontrol edin. Çözüm çok uzun kalırsa, yumurta sarısı keseleri şişer ve patlama olacaktır.
- PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez her yıkayın.
- Görüntü hazır olana kadar 1 hafta kadar 4 ° C de PBS veya PBT ya örnekleri saklayın ve sayılır.
- Görüntü Sudan Siyah-lekeli larva için, PBT içine balık transferi ve daha sonra% 80 gliserol içine ve bir tek kavite depresyon slayt üzerine yerleştirin. Pozisyon bir pipet kullanarak bir stereo mikroskop altında larvaları sabit. Bir stereomikroskop üzerine (Şekil 1 Aii-iv) renkli dijital kamerayı kullanarak resim.
Enfekte Larvalarına gelen geçerli Bakteri 8. numaralandırma
- İstenen zaman E3 ortamında tricaine bir buz soğukluğunda 200-300 mg / L, çözelti içinde enfeksiyondan en larvaları ile öldürülür.
- Pipet 1.7 ml santrifüj tüplerine larvaları öldürüldü. Tricaine çözeltisini çıkarın ve% 0.2, 100 ul ile yerinePBS içinde Triton X-100 (PBSTx).
- 27 G iğne ile yukarı ve aşağı 10 kez geçerek larvaları homojenleştirin.
- Steril PBS homojenatlarının seri dilüsyonları hazırlayın. Örneğin, bulaşıcı dozu 100 CFU, pipetle 900 ul steril PBS içine homojenat 100 ul ise. Yeni bir pipet ucu kullanarak, 900 ul steril PBS içinde seyreltilmiş 100 ul homojenat aktarın.
- Levha 100 gram-pozitif bakterilere seçici izolasyonu için Columbia CNA agarı üzerinde seyreltileri ul ve 48 saat süre ile 37 ° C'de inkübe edin. Bu ortam, her ikisi de gram-negatif ve gram-pozitif bakterilerin büyümesini destekleyecek THY + U agar plakaları, daha fazla seçim sağlar.
- 500'den daha az bireysel koloniler ile plakaları üzerinde, kolonilerin sayısını ve CFU sayısını belirlemek için seyreltme faktörü ile çarpın.
Görüntüleme Larva 9. Sabitleme
- De olduğu gibi, PBS çözeltisi içinde bir buz gibi soğuk% 4 paraformaldehid içinde larvaları saptamakbölüm 7 tarif.
- Oda sıcaklığında, görüntüleme önce PBS içinde 5 dakika boyunca 3 kez her yıkayın.
Canlı Görüntüleme Larvalarına 10. Hazırlanması
- Çözelti berraklaşıncaya kadar mikrodalga içinde ısıtılarak E3 içinde bir% 1.5 düşük erime noktalı agaroz çözelti hazırlayın.
- Serin ama sertleşmesine etmeyelim için 55 ° C su banyosunda agaroz çözüm yerleştirin.
- 0.016% bir nihai konsantrasyona kadar agaroza tricaine ekleyin.
- Plastik bir transfer pipet kullanarak, bir stereomikroskopta aşamasında bir cam alt çanak 4-5 anestezi larvaları yerleştirin.
- 55 ° C su banyosu tricaine ve agaroz çözüm çıkarın ve 1-2 dakika için oda sıcaklığında soğumaya bırakın. Agaroz soğurken mümkün olduğu anestezi uygulanmış larvaları kadar sıvıyı ayırın.
- Yüzeyinin yaklaşık yarısı kaplıdır kadar çanak içine agaroz soğutmalı dökün. Agarozun yaymak için çanak girdap. Not agaroz eğerçok sıcak, bu larvaları öldürür. Çok fazla agaroz çanak eklenirse agaroz ile odaklama Ayrıca, mikroskop objektif lens çanak dibe vurmak olabilir.
- Bir transfer pipet kullanarak, yemeğin yüzüne yüzmekte olan larva pick up ve merkeze geri içine pipetlemeyin.
- Saç döngüsü, çok uzun bir pipet ya da bir cam çubuk ile arzu edildiği gibi stereomikroskop altında, yavaşça larvaları yerleştirin. Sol kulak vezikül çanak dibine düz böylece otik vezikül görüntüleme için, larva yerleştirin.
- Çanak taşımadan önce yaklaşık 10 dakika agaroz soğuması. Agaroz katı değilse larva pozisyonları kayabilir. Hafifçe nemli tutmak için agaroz tabakanın en üstüne bir tricaine E3 çözelti pipetleme.
Enfeksiyon 11. Konfokal Görüntüleme
- Bir FV-1000 lazer tarama confoca ile bir ters mikroskop sahneye larvaları ile cam alt çanak yerleştirinl sistemi.
- 200-300 um iğne deliği ayarlayın ve bir sayısal diyaframı 3-6 mikron dilim z-yığınları set 0.75 / 20X objektif lens kullanarak.
- Her kanal için lazer güç ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgili tarama kullanın.
- Her floresan kanal için sıralı çizgi tarama kullanarak (örneğin, 488 ve 543 nm) ve diferansiyel girişim kontrast (DIC), nötrofiller tarafından ilk işe ve fagositoz gözlemlemek için 2-6 saat sol kulak vezikül bir zaman atlamalı film, her 3 dk yapmak ve makrofajlar. Uzun zaman kurslar için, agaroz dışarı buharlaşmasını ve kurumasını önlemek için Petri kabı bir kapak yerleştirin.
- 20X veya 40X büyütmede (Şekil 2) larvaları hala sabit (Şekil 1B) görüntüler elde veya canlı.
Otik vezikül de Dendra2 etiketli lökosit 12. Fotoçevrim
Not: Dendra2-kırmızı flüoresans yeşilden photoconverted edilebilir1 dakika faiz (ROI) bölgede bir 405 nm lazer (% 50-70 lazer güç yeterli olmalıdır) odaklanarak. Aşağıda FV-1000 lazer konfokal tarama sistemi için kullanılan adım adım protokol şöyledir:
- 488 nm ve 543 nm lazerler ile z-yığın tarama kullanarak örnek gözünüzde canlandırın. Lazer gücü ve dedektör kazancını ayarlamak için sürekli çizgili tarama kullanın. Hiçbir yanlışlıkla photoconverted kırmızı floresan olduğundan emin olmak için kontrol edin.
- "Görüntü Alma Denetimi" penceresinde, "Uyaran Setting" altında "Use Tarayıcı" aracını seçin ve "ana" seçiniz. 405 nm lazer seçin ve% 70 güçte ayarlayın. Daire seçeneği kullanarak, otik vezikül içinde yatırım getirisini tanımlar.
- "Uyarıcı Başlat Ayarlama" altında 1 çerçevenin bir önceden etkinleştirilmesi ve 60.000 msn bir aktivasyon süresi ile "serisinin Aktivasyon" seçeneğini seçin. "Başlığı Zaman Scan" altında "Acquisition Ayarı" penceresinde, içinde 2 seçin00:01:00 (ön için ve biri sonrası Fotoçevrim için) ve aralıklarda.
Not: Zaman atlamalı serisi Tarama işlemi tamamlandıktan sonra, Dendra2 kırmızı floresan durumuna photoconverted olmalıdır. - Photoconverted kırmızı floresan yanı sıra kalan yeşil floresan (Şekil 3) görselleştirmek için 488 nm ve 543 nm lazerler kullanarak z-yığını ile örnek tarayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
S. Mikroenjeksiyon bir ilk lokal yanıtta otik vezikül iniae (Şekil 1 ve Şekil 2) oluşur. Doğru enjekte edildiğinde, bakteriler sadece otik vezikül ve değil çevredeki doku veya kanda görülmelidir. Bu fenol kırmızı boya (Şekil 1A) kullanarak mikroenjeksiyon sırasında görülebilir. Etiketli bakteriler enjekte edilir Alternatif olarak, enfekte larva hızlı bir tarama hemen bakteriler sadece otik vezikül ve değil çevredeki doku (Şekil 1B) olan teyit edebilirsiniz enjeksiyon sonrası. Her ne kadar 10 CFU yabani tip S. olduğunca az bir doz iniae 24-48 saat sonra enfeksiyonu (HPI), bir avirülan soyu, cpsA 1000 CFU enjeksiyon içinde ölümcül bir enfeksiyonun kurabilmektedir öldürücü enfeksiyona neden olabilir ve bu suş ana bilgisayar 24 prolifere mümkün görünmektedir değildir. Bu nedenle, bu lokalize enfeksiyon modeli differentiat edebilmektedirdeğişmiş virülansa bakteriyel suşları arasında e.
Ilk olarak lokalize enfeksiyonun Mikroenjeksiyon siteleri, lökosit kemotaksisine çalışmak için de yararlıdır. Lökositin görevlendirilmesi, nötrofil granüller Sudan siyah boyama (Şekil 1A) veya floresan transgenik kuşaklar (Şekil 1B) formaldehit tespit ya ile ölçülebilir tarafından olabilir. Işe ve bağışıklık hücrelerinin fagositik yeteneklerini görselleştirmek için, biz özellikle makrofajlar yeşil floresan proteinini Dendra2 sentezleyen transgenik çizgiler kullanılan Tg (MPEG1: dendra2) 24 veya nötrofil Tg (mpx: dendra2) 12. Zaman S. iniae 3 dpf larvalarının otik kesecik içine enjekte edilir, her ikisi de nötrofiller ve makrofajlar hızla ilk 2 HPI (Şekil 1) içinde alınırlar. Doğru yapılan Ancak, otik vezikül içine PBS mikroenjeksiyon (ev sahibi lökositlerin aynı sağlam işe neden olmaz
Şekil 2: S. Fagositoz otik vezikül fagositler tarafından iniae Transgenik MPX:. dendra2 (A) ya da MPEG1: dendra2 (B), larva kırmızısı etiketli S. ile enfekte iniae (eflatun tasvir) ve lazer Scann kullanarak 60 dakika sonrası enfeksiyon görüntülendikonfokal mikroskop ing. Ölçek çubuğu, 30 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: S. ile otik vezikül 5 HPI de makrofajların Fotoçevrim iniae. daire (A) tarafından belirlenen otik vezikül (yeşil tasvir) Makrofajlar, bir konfokal mikroskop 405 nm lazer kullanarak (B) photoconverted ve zamanla takip edildi. 24 HPI olarak, (kırmızı işaret edilen) kadar gövde / kaudal hematopoetik doku (C) olarak göç eden makrofajlar photoconverted; Ölçek çubuğu, 50 mikron. C çerçeve içindeki bölgelerin yüksek büyütme (i) ve (ii), ölçek çubuğu 30 um gösterilmiştir; oklar Photocon işaretdönüştürülüyor ve makrofajlar. Photoconverted hücreler nedeniyle 488 nm yeşil floresan kalan birleştirilmiş 543 nm kırmızı floresan ve herhangi beyaz görünür. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada kullanılan enfeksiyon yöntemi 2-3 dpf embriyolar ve larvaların bir ilk lokal enfeksiyona konak bağışıklık tepkisinin incelenmesi için yararlıdır. Bu tür kulak kesecik gibi kapalı bir boşlukta enfeksiyon gibi bir enflamatuar uyarıcı, odak nötrofil ve makrofaj kemotaksisi ve fagositoz çalışma sağlar. Otik vezikülleri içine bakteri enjekte bir uyarı nötrofillerin yeteneği etkili bir sıvı dolu boşluklarında fagosite ederler bakteriler, özellikle bir mikrop bağlı olabilir olmasıdır. Escherichia coli ve Bacillus subtilis kolayca otik vezikül 28 nötrofiller tarafından fagosite değildir, ancak biz, nötrofiller, Pseudomonas aeruginosa ve S. hem fagosite mümkün olduğunu bulduk Bu konumda 16, 24 iniae. Çeşitli patojenlerin invazivliğini okuyan zaman lokalize enfeksiyon da yararlıdır. Sistemik bir enfeksiyon takip i neden olmak içinkapalı boşluğuna njection gibi kulak vezikül gibi, mikrop fiziksel ana engelleri çapraz gerekir. Alternatif olarak, farklı patojenler enfeksiyon ilk sitesinden ulaşım ve yayılması için konak hücreler güveniyor olabilir. Bu değişmiş virülansa suşları karşılaştırmak için yararlı yerelleştirilmiş enjeksiyonları yapar.
Mikroenjeksiyon sırasında, yerleşme ve her koşul sonra veya yaklaşık 50 larva sonra ya iğne, iğne değişim tıkanma bakterileri önlemek için. Bu iğne süspansiyon daha düzgün sağlamaya yardımcı olacaktır. Iğne bakteri yerleşimi, homojen bir süspansiyon tutmaya yardımcı olabilir bir sorun, bir PBS karışımını,% 2 PVP40,% 10 gliserol gibi görünüyorsa. Her larva bakteri yaklaşık aynı sayıda enjekte ediliyor emin olmak için, hemen bir larva homojenize enjeksiyonunu takiben ve CNA agarda homojenatın kaplama ile CFU sayımları kontrol edin. CNA ağar, sadece, kültürlenebilir gram-pozitif bakterilerin büyümesi için seçecektirS. iniae, ancak enjeksiyon dozları her larva arasında nasıl tutarlı bir fikir verecektir. Larva başına 100 CFU bir hedef inokulum ile, bir CNA plaka üzerinde tipik 75-150 arasında koloniler vardır. olmayan S. sayısı En PBS enjekte balık genellikle 0-20 koloniler arasında neden bu yana CNA plaka üzerinde büyüyen iniae gram pozitif koloniler, muhtemelen çok düşüktür. Aynı bulaşıcı doz ile enfekte larva arasındaki koloni sayımları yarım günlüğüne kadar değişimini olması için enfeksiyon sırasında sonraki zaman noktalarında, bu nadir değildir. Bu enfeksiyon kontrol etme yeteneği bireysel larva arasındaki ufak farklar temsil edebilecek ya da larva veya E3 ortamında kültürlenebilen gram pozitif bakterilerin miktarı farklılıkları yansıtıyor olabilir.
Otik vezikül içine enjekte ederken, bu boşluğu yırtılmasına neden olabilir çok büyük bir hacim veya çok yüksek bir basınç ile enjekte etmek önemlidir. Enjeksiyon hacmi shoYaklaşık 1 nl tutulabilir uld. İğne çok büyükse, mikroenjeksiyon enfeksiyon siteye ev sahibi lökositlerin işe etkileyebilir veya bakteri otik vezikül dışarı sızmasına izin verebilir çevredeki dokuya zarar görmesine neden olabilir. Bu nedenle, doğru boşluk içine enjekte teyit etmek için de önemlidir. İğne çok derin takılırsa, bu otik vezikül ile karıştırmak olabilir veya kulak vezikül etrafında akan kan damarları vurabilir. Böylece, ana yanıtları değiştirebilir kan akışına ya da vezikül dışındaki bakteri birikmesi, neden olabilir.
Bu iğne çıkarıldığı zaman Colucci-Guyon ve diğ., 28 ile gösterildiği gibi, bazı bakteriler yanlışlıkla otik vezikül dışındaki tevdi edilebilir olması da mümkündür, ama sadece enjeksiyonları% 5'ten daha az durumda olmasını bulabilirsiniz. Otik vezikül merkezine enjekte çalışılıyor, bu durumu önlemeye yardımcı olabilir. Başarılı bir enfeksiyon ise, otik vezikül w doldurmak gerekirfenol kırmızı boya i, ancak boya çevreleyen dokulara dışarı sızmaması gerekir. Herhangi bir yanlış enjekte larvalar hemen atılmalıdır. Etiketli bakteriler enjekte başarılı bir enjeksiyon (Şekil 1B) onaylamak için kullanışlı bir yoldur. Bir CellTracker boya kullanılarak dezavantajlarından biri bakteriler sonunda floresan altında görüntülendi olan bakterilerin önlenmesi, bölmek gibi bu boya sulandırılmış olacak olmasıdır. Yeşil etiketli nötrofil ve çalışmaların çoğunluğu için makrofaj transgenik hatları kullanılan çünkü kırmızı boya seçti.
Dendra2 octocoral Dendronephthya sp.'den türetilmiş bir photoconvertible proteindir. hangi bir 405 nm lazer 29 kırmızı floresan duruma bir yeşilden photoconverted edilebilir. Bu Fotoçevrim hücrelerini işaretlemek ve enfeksiyon boyunca kendi kaderini izlemek için invaziv olmayan bir yoldur. Enfeksiyon bölgesine işe lökositler photoconverted ve d izlemek için zaman içinde takip edilebilirev sahibi dokulardaki boyunca issemination (Şekil 3). Alternatif olarak, lökositler önce enfeksiyon photoconverted ve daha sonra enfeksiyon siteye işe hücrelerin kökenini belirlemek için post-mikroenjeksiyon takip edilebilir. Etiketleme bakteri ve bağışıklık hücreleri alımı ve fagositoz (Şekil 1B ve Şekil 2) da dahil olmak üzere, in vivo olarak lökosit-patojen etkileşimlerinin çalışma sağlar. Kırmızı-etiketli S. ayırt Bir photoconverted lökosit kırmızı floresans iniae zordur, bu nedenle başka bir floresan CellTracker boya kullanılabilir. Bu S. içeren otik vezikül terk photoconverted bağışıklık hücreleri belirlemek için özellikle faydalı olur, iniae.
Otik vezikül bulaşma yönteminin Gelecek uygulamalar nötrofiller ve makrofajlar çeşitli enfeksiyonlara tepki olarak hareket ettiği hızı ve yönünü ölçmek içerebilir. enfeksiyon kinetics ayrıca hücre tipleri, en sağlam hücreler geldiği yerin ya da 30 yaymak nerede ek olarak işe alınırlar bir enfeksiyon yerinde ve hangi gelmesi ilk hangi hücre tipleri görmek için incelenebilir. Bir ilk lokal enfeksiyona işe incelenmesine ek olarak, bu enfeksiyon modeli, ilk enfeksiyonu sırasında konağın immün sistemi bileşenlerinin fonksiyonlarını incelemek için kullanılabilir. Belirli RNA hedef antisens morfolino oligonükleotitler Toll benzeri reseptörler, sitokin reseptörleri ve lökositlerin, ve de dahil olmak üzere konakçı bağışıklık bileşenlerinin sentezlenmesi yıkmak için kullanılabilir CRISPR-Cas veya TALEN teknolojisi genetik mutantlar oluşturmak için de kullanılabilir. Gen ifadesi RNAseq kullanılarak veya qPCR da enfeksiyona karşılık olarak belirli bir ev sahibi gen ekspresyonunu karakterize etmek için kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Zebra balığı bakımı ve bakım için laboratuvar üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri, EA HARVIE Ulusal Araştırma Hizmet Ödülü A155397 ve Anna Huttenlocher NIH R01GM074827 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
