Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van Published: April 21, 2015 doi: 10.3791/52788
Automatic Translation
1,2, 2,3
1Microbiology Doctoral Training Program, University of Wisconsin-Madison, 2Department of Medical Microbiology and Immunology, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin-Madison

Abstract

De aquatische ziekteverwekker, Streptococcus iniae, is verantwoordelijk voor meer dan 100 miljoen dollar in jaarlijkse verliezen voor de aquacultuursector en kan veroorzaken systemische ziekte bij zowel vis en de mens. Een beter begrip van S. iniae pathogenese van de ziekte vereist een geschikt modelsysteem. De genetische volgzaamheid en de optische transparantie van de vroege ontwikkelingsstadia van zebravis oog op het genereren en niet-invasieve beeldvorming van transgene lijnen met fluorescent gelabeld immuuncellen. Het adaptieve immuunsysteem is niet volledig functioneel tot verscheidene weken na bevruchting, maar zebravis larven een geconserveerd gewervelde aangeboren immuunsysteem zowel neutrofielen en macrofagen. Aldus, het genereren van een larvale infectiemodel maakt het onderzoek mogelijk van de specifieke bijdrage van aangeboren immuniteit in de controle S. iniae infectie.

De site van de micro-injectie zal bepalen of er een infectie issystemische of aanvankelijk gelokaliseerd. Hier presenteren we onze protocollen voor otic blaasje injectie van zebravis leeftijd van 2-3 dagen na de bevruchting, evenals onze technieken voor tl confocale beeldvorming van infectie. Een gelokaliseerde infectie site laat observatie van de eerste microbe invasie, de aanwerving van gastheercellen en de verspreiding van de infectie. Onze bevindingen met behulp van de zebravis larvale model van S. iniae infectie aan dat zebravis kan worden gebruikt om de verschillende bijdragen van ontvangst neutrofielen en macrofagen in gelokaliseerde bacteriële infecties onderzocht. Verder beschrijven we hoe fotomarkering van immuuncellen kunnen worden gebruikt om individuele gastheercel lot volgen tijdens het verloop van de infectie.

Introduction

Streptococcus iniae is een belangrijke aquatische ziekteverwekker die kan veroorzaken systemische ziekte bij zowel vissen als mens 1. Terwijl S. iniae is verantwoordelijk voor grote verliezen in de aquacultuur is ook een potentiële zoönotische pathogenen, kunnen veroorzaken ziekte bij immunogecompromitteerde menselijke gastheren met klinische pathologieën vergelijkbaar met die veroorzaakt door andere streptokokken menselijke pathogenen. Gezien de overeenkomsten met humane pathogenen, is het belangrijk S. bestuderen iniae pathogenese van de ziekte in het kader van een natuurlijke gastheer. Een volwassen zebravis model van S. iniae infectie bleek robuuste infiltratie van gastheer leukocyten naar de gelokaliseerde plaats van de infectie, evenals een snelle tijd tot de dood te hosten, een tijd te kort om het adaptieve immuunsysteem 7 betrekken. Om te winnen een diepgaande kijk in de aangeboren immuunrespons tegen S. iniae infectie in vivo, moet een model dat meer vatbaar n gebruikenon-invasieve live beeldvorming.

De larvale zebravis heeft een aantal voordelen dat het een steeds aantrekkelijker gewervelde model voor het bestuderen van gastheer-pathogeen interacties te maken. Zebravis zijn relatief goedkoop en gemakkelijk in gebruik en onderhoud in vergelijking met zoogdieren modellen. Adaptieve immuniteit is niet functioneel volwassen tot 4-6 weken na de bevruchting, maar larven hebben een sterk geconserveerd gewervelde aangeboren immuunsysteem met complement, Toll-like receptoren, cytokinen en neutrofielen en macrofagen met antimicrobiële mogelijkheden, waaronder fagocytose en respiratoire burst 2-6, 8-11. Bovendien, de genetische traceerbaarheid en optische transparantie van de embryonale en larvale stadia van ontwikkeling mogelijk maken de vorming van stabiele transgene lijnen met fluorescent gelabelde immuuncellen waardoor gastheer-pathogeen interacties in real time in vivo onderzocht. De generatie van deze transgene lijnen met een photoconvertible eiwit zoals Dendra2 maakt het volgen van afzonderlijke gastheercel oorsprong en het lot in de loop van de infectie 12.

Bij de ontwikkeling van een zebravis larvale infectie model, zal de gekozen locatie van micro-injectie te bepalen of er een infectie is in eerste instantie gelokaliseerde of systemische. Systemische bloed infecties in de caudale ader of Duct van Cuvier worden meestal gebruikt om microbiële ziekteverwekkers in de zebravis te bestuderen en zijn nuttig voor het bestuderen van interacties tussen gastheer en microbiële cellen, cytokine reacties, en verschillen in virulentie tussen ziekteverwekker stammen. Voor langzamer groeiende micro-organismen kunnen vroeg injectie in de dooierzak van een embryo in de 16-1,000 cellig stadium worden gebruikt om een systemische infectie 13,14 verwekken, optimale ontwikkelingsstadium voor micro-injectie van een langzaam groeiende micro-organisme blijkt tussen de 16-128 cellig stadium 15. Echter, dooierzak injecties van veel microben in latere stadia van de gastheer ontwikkeling neiging dodelijke aan t te zijnhij gastheer te wijten aan de voedselrijke omgeving voor de microbe en gebrek aan infiltreren leukocyten 16-18.

Een gelokaliseerde infectie resulteert meestal in gerichte migratie van leukocyten naar de plaats van infectie die gemakkelijk kan worden gekwantificeerd met niet-invasieve beeldvorming. Dit type infectie kunnen zorgen voor dissectie van de mechanismen die leukocytenmigratie evenals onderzoek naar verschillende trekkende en phagocytic mogelijkheden van diverse leukocyten bevolkingsgroepen bemiddelen. Gelokaliseerde infecties zijn ook nuttig bij het onderzoek van de verschillen in virulentie tussen bacteriestammen evenals het bestuderen van microbe invasie mechanismen sinds fysieke host barrières moeten worden gekruist voor een gelokaliseerde infectie aan systemische geworden. Zebravis worden typisch verhoogd bij temperaturen van 25-31 ° C 19, maar zij kunnen ook bij temperaturen tot 34-35 ° C voor studies van de invasiviteit van bepaalde menselijke ziekteverwekkers strenge eisen temperatuur gehandhaafdvoor virulentie 20, 21.

Veel verschillende locaties zijn gebruikt om een aanvankelijk gelokaliseerde bacteriële infectie met inbegrip van de achterhersenen ventrikel 22, rug- staart spier 18, pericardiale holte 23 en otic blaasje (oor) 5, 16, 24 genereren. Er is echter gevonden dat injectie van bacteriën in de staart spier weefselbeschadiging en ontsteking onafhankelijk van de bacteriën, die resultaten scheef bij onderzoeken leukocyt reactie 13 veroorzaken. Hoewel minder schade wordt geassocieerd met injectie in de achterhersenen en hoewel het aanvankelijk verstoken van leukocyten in jonge embryo's, de achterhersenen ventrikel gestaag krijgt meer immuuncellen in de tijd als microglia te gaan wonen. De achterhersenen ventrikel is ook een moeilijker locatie om de afbeelding. De otic blaasje is een gesloten holte met geen directe toegang tot het vaatstelsel 25, 26. Het is gewoonlijk zonder leukocytes, maar leukocyten kan worden aangeworven om de otic blaasje in reactie op inflammatoire stimuli zoals een infectie. Het is ook een gewenste plaats van micro-injectie van bacteriën in zebravis leeftijd 2-3 dagen na de bevruchting (dpf) vanwege het gemak van beeldvorming en de visualisatie van de injectie. Daarom hebben we gekozen voor de otic blaasje als onze site van gelokaliseerde bacteriële infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Volwassen en embryonale zebravis werden onderhouden in overeenstemming met de Universiteit van Wisconsin-Madison Research Animal Resources Center.

1. Voorbereiding Microinjection Naalden

  1. Bereid dunne wand glazen capillaire injectienaalden (1,0 OD / 0.75 ID) met behulp van een micropipet trekker apparaat met de volgende instellingen: luchtdruk 200, warmte 502, trek 90, snelheid 80, tijd 70, zendtijd aan het begin van pull 5, zendtijd aan het einde van pull 5.
  2. Met behulp van fijne pincet, afbreken van de punt van de naald getrokken, zodat de tip opening heeft een diameter van ongeveer 10 micrometer.

2. Voorbereiden van Larvale Injectie Gerechten

  1. Spoel een gel kam met lane breedte van ongeveer 4-5 mm in steriel water en laten drogen.
  2. Bereid een 1,5-2% hoge smelt agaroseoplossing in E3 medium 19 en magnetron totdat de oplossing helder is. Eenmaal afgekoeld, giet wat van de agarose in een petrischaal (100 x 15 mm) en werveling,toevoegen net genoeg agarose volledig te bedekken de bodem van de schaal.
  3. Nadat de agarose is gestold laag, plaats de gewassen en gedroogde gel kam boven zodat de niet-gekamde einde slechts rust op de top van de petrischaal en gekamd uiteinde raakt de agarose. Zorg ervoor dat de kam zo horizontaal mogelijk, waardoor een 30 ° hoek ten opzichte van de onderste agaroselaag.
  4. Giet een extra kleine hoeveelheid agarose aan het grensvlak tussen de kam en onderste agarose laag, zodat de verse agarose laag bedekt de putjes van de kam. Laat volledig afkoelen voordat u de kam. Met behulp van een pipet tip, verwijder eventuele overhangende stukken van agarose uit de putten.
  5. Giet E3 medium bovenop de injectie schimmel en bewaar bij 4 ° C.
  6. Voor elk gebruik, te vervangen door vers medium en warm injectie hellingbanen bij 28,5 ° C gedurende ten minste een uur voor de injectie.
  7. Onmiddellijk voorafgaand aan injectie, vervangen E3 op de injectie helling metE3 medium dat 200 ug / ml ethyl 3-aminobenzoaat (tricaïne).

3. Voorbereiden van S. iniae Inoculum

  1. Bereid en autoclaaf Todd Hewitt bouillon medium aangevuld met 0,2% gistextract en 2% proteosepepton (THY + P): 30 g / l Todd Hewitt, 2 g / l gistextract, 20 g / l proteosepepton. Voor agarplaten, voeg 14 g / l agar.
  2. Bereid bacterieculturen de avond voor infecties door pipetteren een 100 ul aliquot van bevroren bacteriële bouillon in 10 ml van THY + P bouillon in een afgesloten buis van 15 ml. Incubeer overnacht zonder roeren bij 37 ° C. Na 14-16 uur van groei, gebruik maken van de 's nachts cultuur ofwel diepvries voorraden te maken of voor te bereiden voor gebruik in injecties.
  3. Voeg vriezer voorraden door het plaatsen van 1 ml van de overnacht cultuur in 500 pi 80% glycerol in een 1,7 ml centrifugebuis. Om vries-dooi-cycli te vermijden, moet 100 pi één aliquots van dit mengsel en bewaar bij -80 ° C.
  4. Voor S. iniae gebruikt in infections, verdunnen de overnacht cultuur 1: 100 voor een totaal volume van 10 ml cultuur door het toevoegen van 0,1 ml 's nachts cultuur tot 9,9 ml van THY + P bouillon. Kweek bij 37 ° C zonder schudden gedurende ongeveer 4-5 uur. Controleer de optische dichtheid (OD) bij 600 nm met een spectrofotometer Nanodrop en oogst de bacteriën in mid-logaritmische fase wanneer de OD600 nm bereikt 0,250-0,500. Een OD600 nm van 0,250 overeen met ongeveer 10 8 kolonievormende eenheden (CFU) / ml.
  5. Pellet 1 ml van de bacteriekweek in een 1,7 ml centrifugebuis bij 1500 xg gedurende 5 minuten. Resuspendeer in 1 ml vers PBS en herhaal. Meet de OD600 nm van de bacteriën in PBS, pellet en resuspendeer in PBS om de gewenste concentratie te bereiken.
  6. Om te helpen bij het visualiseren van micro-injectie, toe fenolrood om de bacteriële suspensies voor injectie voor een uiteindelijke concentratie van 0,1%.
  7. Voor experimenten met de injectie van hitte gedode bacteriën, verwarm de bacteriën in PBS bij 95 ° C gedurende 30 min.Controleer of de warmte dodingsproces verminderde het aantal levensvatbare bacteriën detecteerbare niveaus door bekleden een injectie (ongeveer 1 nl) op vaste THY + P agarplaten en overnacht incuberen bij 37 ° C.

4. Labeling S. inia e met een CellTracker rode fluorescerende kleurstof

  1. Labelen levende bacteriële cellen, bereiden een voorraad oplossing van een CellTracker fluorescente kleurstof of gelijkwaardig. Aangezien de gebruikte kleurstof komt 20 x 50 ug hoeveelheden poeder en moet worden geresuspendeerd in DMSO, voeg 7,3 pl DMSO aan de buis een 10 mM voorraad concentratie te verkrijgen.
  2. Test verschillende kleurstof concentraties (bijvoorbeeld 0,5-25 pM) op de bacteriën aan de laagste optimale concentratie dat de cellen kleurt bepalen. Snel delende cellen en meer experimenten kunnen een hogere concentratie aan kleurstof vereisen.
    1. Pellet 1,0 ml bacteriecultuur in een 1,7 ml buis door centrifugeren zoals hierboven (deel 3) beschreven. Resuspendeer de pellet in 1ml verse PBS en voeg de juiste hoeveelheid kleurstof om de bacteriecultuur.
    2. Incubeer zonder roeren bij 37 ° C gedurende 30 min. Spin beneden de bacteriën en resuspendeer in 1 ml voorverwarmde THY + P bouillon en geïncubeerd zonder roeren gedurende nog 30 min bij 37 ° C.
    3. Spin down de bacteriën en was twee keer in PBS voor het meten van de OD600 nm en verdunnen van de bacteriën voor micro-injectie, zoals hierboven (deel 3) beschreven. We injecteren doorgaans ongeveer 100 CFU in 1 nl injectie volume voor onze studies van leukocytaantrekking en fagocytose.

5. Voorbereiding van de zebravis Larven voor Infecties

  1. Opgezet broedparen de avond tevoren en het verzamelen van embryo's, zoals beschreven door Rosen et al. 27 Incubate embryo's in E3 medium bij 28,5 ° C tot klaar om te infecteren.
  2. Voor zebravis die worden afgebeeld, om de ontwikkeling van pigment (melanisatie) door toevoeging van N-fenylthioureum (PTU) aan deE3 medium bij 24 uur na de bevruchting (HPF) voor een eindconcentratie van 0,2 nM.
  3. Voor infecties met embryo's in de leeftijd 2 dpf, dechorionate embryo's handmatig met een paar fijne pincet. Alternatief dechorionate embryos E3 verwijderen en te vervangen met pronase (2 mg / ml) gedurende 5 minuten of totdat zacht pipetteren breekt embryo uit het chorion. De meeste larven moeten op natuurlijke wijze zijn uitgebroed door 3 dpf.
  4. Verdoven zebravis enkele minuten voorafgaand aan een infectie door het plaatsen van dechorionated larven in E3 medium dat 200 ug / ml tricaïne.

6. Otic Vesicle Injectie van S. iniae in drie dagen oude larven

  1. Zet de microinjector en stel de tijd scala aan "milliseconde". Open de klep op de kooldioxide tank te laten gas in de lijn. De druk van de microinjector moet ongeveer 20 PSI lezen. Stel de druk in de microinjector eenheid door het rechtsom draaien van de zwarte gekartelde knop voor incrverlicht druk of linksom te draaien voor verminderde druk.
  2. Vortex de bereide S. iniae cultuur in fenol rood en PBS en gebruik een microloader tip om 2-3 ul van de cultuur te laden in een getrokken capillaire injectienaald.
  3. Monteer de geladen naald op een micromanipulator aangesloten op een magnetische standaard en plaats onder een stereomicroscoop zodat de naald in ongeveer 45-65 ° hoek ten opzichte van de basis van de microscoop.
  4. Druk op het voetpedaal van de microinjector tot een daling van het inoculum afgeven op de punt van de naald. Meet de diameter van de druppel met de schaalbalk in de oculaire lens van de microscoop.
    1. Alternatief, de mogelijke diameter van de druppel door het injecteren van een volume in een druppel minerale olie op een microscoopglaasje met een schaalbalk. De diameter van de druppel moet ongeveer 0,10 mm, dat is ongeveer 1 nl volume.
    2. Pas de druppelgrootte door het aanpassen van de tijdsduur instellen opde microinjector of door knippen meer af van de naald met fijne pincet. Merk op dat de injectietijd moet tussen 20 - 35 msec te voorkomen dat te veel weefselschade.
  5. Met een plastic overdracht pipet, overdracht 12 geanesthetiseerd larven in elk putje van de spuitgietmatrijs.
  6. Gebruik een glazen staaf, haar loop, of plastic tip om voorzichtig de positie van de larven, zodat de hoofden zijn gericht naar de achterkant van de microscoop en de dooierzakken zijn tegen de linkerkant van de put. Richt het linkeroor van de larve naar het plafond.
  7. Kijkend door de oculaire lens van de stereomicroscoop, gebruikt u de knoppen op de micromanipulator aan line-up de geladen naald met de otic blaasje zodat beide zijn in hetzelfde gezichtsveld. Pierce de buitenste epitheellaag van de otic blaasje met de naald, zodat de naald tip is net binnen het blaasje.
  8. Druk op het voetpedaal om 1 nl van de gewenste dosis van S. te injecteren iniae. Zorg ervoor dat u een te gebruikenlaag genoeg druk om niet de holte scheuren. Als de injectie is voltooid, de otic blaasje, maar niet het omringende weefsel moeten vullen met het fenolrood inoculum (figuur 1 Ai). Verwijder onmiddellijk alle mis-geïnjecteerde vis uit de injectie plaat.
  9. Trekken voorzichtig de naald uit de larve en beweeg de injectie plaat met de hand, zodat de volgende larve is in zicht. Doe dit onder 5x vergroting.
    Opmerking: terugtrekken van de naald kan leiden tot de afzetting van sommige bacteriën buiten het otisch blaasje, die overleving en leukocytaantrekking resultaten scheef. Om dit te voorkomen, is het raadzaam om fluorescerende kleurstof-gelabelde bacteriën te injecteren en visueel scannen geïnjecteerd larven onder een tl-microscoop om eventuele larven waar dit heeft plaatsgevonden verwijderen. Een correct ingespoten larve wordt getoond in (figuur 1 Bi).
  10. Om het injectievolume / inoculum gelijk blijft in de loop van het experiment injecteren een druppel van de bacteriële suspension in een 1,7 ml centrifugebuis bevattende 100 pi steriel PBS na elke 48ste embryo. Plate 100 ul op THY + P agarplaten bij 37 ° C overnight CFU bepalen het injectievolume.
  11. Als de hele groep van 12 larven op de injectie oprit is geïnjecteerd, zorgvuldig gebruiken een plastic overdracht pipet om de larven uit de bronnen te verwijderen en plaats ze in een nieuwe petrischaal (35 x 10 mm 2). Verwijder de tricaïne oplossing en te vervangen door ongeveer 2 ml vers E3 medium om de larven te herstellen.
  12. Pipet geïnjecteerd larven in afzonderlijke putjes van een plaat met 96 putjes en incubeer bij 28.5 ° C. Monitor larven in de tijd om te overleven in deze platen of later te verwijderen voor de beeldvorming of CFU telt.

7. Sudan Black kleuring van neutrofielen

Opmerking: De volgende stappen kunnen worden uitgevoerd bij kamertemperatuur in een kleine petrischaal (35 x 10 mm2) op een rondschudapparaat tenzij otherwise vermeld. Voor elke stap is de hoeveelheid toegepaste reactant is ongeveer 2 ml per schaal, met slechts voldoende vloeistof volledig bedekken de larven.

  1. Voor bevestiging van geïnfecteerde larven, gebruik dan een glas Pasteur pipet om E3 medium te verwijderen en te vervangen door een ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS oplossing. Onmiddellijk plaats de vis bij 4 ° C te euthanaseren. Fix overnacht bij 4 ° C.
  2. Was 3 maal in PBS gedurende 5 minuten elk.
  3. Vlek met Sudan Black (0,18% stock verdund 1: 5 in 70% ethanol, 0,1% fenol) gedurende 30 minuten tot 5 uur. Gebruik een stereomicroscoop om te controleren of neutrofielen korrels tot de vlek hebben genomen.
  4. Voer een reeks van 5 min wassingen ab één wassen in 70% ethanol gevolgd door een spoeling van een 1: 1 verhouding van 70% ethanol en PBS, gevolgd door een laatste wasbehandeling in PBS.
  5. Rehydrateren in PBS plus 0,1% tween (PBT).
  6. Om pigment verwijderen uit de larven, wassen in 1% kaliumhydroxide / 1% waterstofperoxide gedurende ongeveer 6-10 minuten. Bewaken van de steekproef Closely en na ongeveer 5 minuten, controleer dan de larven onder een stereomicroscoop om te zien hoeveel van het pigment is verdwenen. Als de oplossing overblijft te lang, zal de dooierzakken zwellen en barsten.
  7. Was 3 maal gedurende 5 minuten elk met PBS.
  8. Bewaar de monsters in ofwel PBS of PBT bij 4 ° C gedurende maximaal 1 week tot klaar om imago en tellen.
  9. Om het beeld Sudan Black-gekleurde larven, de overdracht van de vis in de PBT en vervolgens in 80% glycerol en plaats op een enkele holte depressie dia. Positie vast larven onder een stereomicroscoop met een pipet tip. Afbeelding met behulp van een kleuren digitale camera op een stereomicroscoop (figuur 1 Aii-iv).

8. Bepaling van het aantal levende bacteriën uit Infected Larven

  1. Euthanaseren larven op de gewenste tijden na infectie in een ijskoude 200-300 mg / l oplossing van tricaïne in E3 medium.
  2. Pipet geëuthanaseerd larven in 1,7 ml centrifuge buizen. Verwijder de tricaïne oplossing en vervangen door 100 pl van 0,2%Triton X-100 in PBS (PBSTx).
  3. Homogeniseren larven door het passeren van op en neer 10 keer door een 27 G naald.
  4. Maak seriële verdunningen van homogenaten in steriele PBS. Als bijvoorbeeld de infectieuze dosis van 100 CFU Pipetteer 100 ul van het homogenaat in 900 pi steriel PBS. Met behulp van een nieuwe pipet tip, overdracht 100 ul van de verdunde homogenaat in 900 pi steriel PBS.
  5. Plaat 100 pl van de verdunningen op Columbia agar CNA voor selectieve isolatie van gram-positieve bacteriën, en incubeer bij 37 ° C gedurende 48 uur. Dit medium zal grotere selectie opleveren dan de THY + P agarplaten, die de groei van zowel gram-negatieve en gram-positieve bacteriën ondersteunt.
  6. Bij platen met minder dan 500 afzonderlijke kolonies Tel het aantal kolonies en vermenigvuldigen met de verdunningsfactor het aantal CFU te bepalen.

9. Bevestiging van Larven for Imaging

  1. Fix larven in een ijskoude 4% paraformaldehyde in PBS-oplossing als debeschreven in paragraaf 7.
  2. Bij kamertemperatuur was 3 maal gedurende 5 minuten elk in PBS voor de beeldvorming.

10. Voorbereiding van Larven for Live Imaging

  1. Bereid een 1,5% laag smeltpunt agarose oplossing E3 door verwarmen in de magnetron totdat de oplossing helder is.
  2. Plaats agarose oplossing in een 55 ° C waterbad te laten afkoelen, maar niet te harden.
  3. Tricaïne Aan de agarose tot een eindconcentratie van 0.016%.
  4. Met behulp van een plastic transferpipet, plaatst 4-5 verdoofd larven in een glazen bodem schotel op het podium van een stereomicroscoop.
  5. Verwijder de tricaïne en agarose oplossing van 55 ° C waterbad en laat afkoelen op kamertemperatuur gedurende 1-2 min. Terwijl de agarose wordt koeling, verwijder zoveel vloeistof uit de verdoofde larven mogelijk.
  6. Giet de afgekoelde agarose in de schaal tot ongeveer de helft van het oppervlak beslaan. Zwenk de schotel naar de agarose verspreiden. Merk op dat als de agarosete warm is, zal de larven te doden. Ook als teveel agarose wordt toegevoegd aan de schotel, de objectieflens van de microscoop kan de bodem van de schotel al tijdens het scherpstellen door agarose.
  7. Met behulp van een transferpipet, halen de larven die hebben gedreven aan de zijkanten van de schotel en pipet ze terug naar het centrum.
  8. Onder de stereomicroscoop, zachtjes de positie van de larven naar wens met een haar loop, een lange pipet tip of een glazen staaf. Voor beeldvorming van de otic blaasje, plaatst de larven zodat de linker otic blaasje plat tegen de bodem van de schaal.
  9. Laat de agarose koel ongeveer 10 minuten voordat u het gerecht. De larven kunnen posities verschuiven als de agarose is niet vast. Voorzichtig pipet enkele tricaïne en E3 oplossing naar de top van de agarose laag om het vochtig te houden.

11. confocale Imaging van infectie

  1. Plaats de glazen bodem schotel met larven op het podium van een omgekeerde microscoop met een FV-1000 laser scanning confocal systeem.
  2. Stel de pinhole tot 200-300 micrometer en met een numerieke opening van 0,75 / 20X objectief, set z-stacks met 3-6 micrometer plakjes.
  3. Gebruik doorlopende lijn scannen naar het laservermogen en de detector te krijgen voor elk kanaal aan te passen.
  4. Met behulp van sequentiële lijn scannen voor elk fluorescentie kanaal (bijvoorbeeld 488 en 543 nm) en differentieel interferentie contrast (DIC), voert een time lapse film van de linker otic blaasje elke 3 min voor 2-6 uur tot indienstneming, fagocytose door neutrofielen te observeren en macrofagen. Voor langere tijd cursussen, plaats een deksel op de petrischaal om verdamping en uitdroging van de agar te voorkomen.
  5. Acquire foto van vaste (figuur 1B) of live (figuur 2) larven op 20x of 40x vergroting.

12. Photoconversion van Dendra2 gelabelde leukocyten in de otic Vesicle

Opmerking: Dendra2 kan worden photoconverted van groen naar rood fluorescentiedoor focusseren van een 405 nm laser (50-70% laservermogen moet voldoende zijn) op het gebied van belang (ROI) gedurende 1 min. Hieronder is de stap-voor-stap protocol voor de FV-1000 laser scanning confocale systeem:

  1. Visualiseer het monster met behulp van een z-stack scan met de 488 nm en 543 nm lasers. Gebruik doorlopende lijn scannen naar het laservermogen en de detector bij te stellen. Controleren om ervoor te zorgen dat er geen ongeluk photoconverted rode fluorescentie.
  2. Op het venster "Image Acquisition Control", selecteer onder "Stimulus Instelling" de "Use Scanner" tool en kies "hoofd". Selecteer de 405 nm laser en zet deze op 70% vermogen. Met behulp van de optie cirkel, bepalen de ROI in de otic blaasje.
  3. Onder "Stimulus Start instellen" selecteer "Activering in serie" met een pre-activatie van 1 frame en een activatie tijd van 60.000 msec. Op het venster "Acquisitie Instelling" onder de "Time Scan rubriek", kies 2 intijdsinterval van 0:01:00 (één voor pre- en één voor post- photoconversion).
    Opmerking: Na de time lapse serie scan voltooid is, moet de Dendra2 zijn photoconverted om zijn rode fluorescerende toestand.
  4. Scan het monster door een z-stack met de 488 nm en 543 nm lasers om de photoconverted rode fluorescentie alsmede alle resterende groene fluorescentie (figuur 3) zichtbaar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Micro-injectie van S. iniae in de otic blaasje (figuur 1 en figuur 2) resulteert in een aanvankelijk gelokaliseerde gastheer respons. Wanneer correct geïnjecteerd, moet de bacteriën alleen gezien in de otic blaasje en niet in het omringende weefsel of bloed. Dit kan worden gevisualiseerd in micro-injectie met fenol rode kleurstof (Figuur 1A). Als alternatief, als het label bacteriën worden geïnjecteerd, een quick scan van geïnfecteerde larven onmiddellijk injectie plaatsen kan bevestigen de bacteriën zijn alleen in de otic blaasje en niet het omliggende weefsel (Figuur 1B). Hoewel een dosis zo weinig als 10 CFU wild-type S. iniae kan een letale infectie richten binnen 24-48 uur na infectie (HPI), injectie van 1000 CFU van een avirulente stam cpsA, niet tot dodelijke infectie en die stam lijkt niet prolifereren in de gastheer 24. Zo, dit lokale infectie model is in staat om Gedifferen-e tussen bacteriestammen van veranderde virulentie.

Micro-injectie plaatsen van aanvankelijk lokale infectie zijn nuttig voor het bestuderen van leukocyten chemotaxis. Leukocytaantrekking kan door gekwantificeerd door een van beide sudanzwart kleuring van neutrofielen korrels (Figuur 1A) of formaldehyde fixatie van TL-transgene lijnen (Figuur 1B). Om de werving en fagocytische capaciteiten van immuuncellen te visualiseren, gebruikten we transgene lijnen uiting van de groen fluorescerend eiwit Dendra2 specifiek in macrofagen Tg (MPEG1: dendra2) 24 of neutrofielen Tg (MPX: dendra2) 12. Toen S. iniae wordt geïnjecteerd in de otic blaasje van 3 dpf larven worden zowel neutrofielen en macrofagen snel geworven binnen 2 HPI (figuur 1). Echter, wanneer correct uitgevoerd, micro-injectie van PBS in de otic blaasje niet tot dezelfde robuuste recrutering van leukocyten gastheer ( S. iniae kan worden gevonden in zowel neutrofielen en macrofagen (figuur 2). De photoconvertible eiwit Dendra2 neutrofielen en macrofagen label zorgt voor niet-invasieve fotomarkering voor het volgen van individuele lot van de cel in de loop van de infectie. Macrofagen die werden aangeworven om de otic blaasje op 5 HPI werden photoconverted en vervolgens bijgehouden over de volgende 24 uur. Hoewel sommige photoconverted cellen blijven in de otic blaasje of het hoofd regio, kunnen sommige ook te vinden verspreid door het hele lichaam van de larven (figuur 3).

Figuur 1
S. iniae. (A) Neutrophil rekrutering van S. iniae infectie. (I) Succesvolle injectie van een fenol rood gemerkte inoculum in de otic blaasje. (Ii - iv) sudanzwart kleuring van larven voor onderzoek van neutrofielen werving op 2 hpi. PBS-mock geïnfecteerde larven tonen weinig rekrutering van neutrofielen naar de otic blaasje (ii), terwijl een infectie met ofwel wild-type S. iniae of de cpsA mutant resultaten in robuuste neutrofielen werving (III, IV). Schaal bar, 300 micrometer. (B) Macrophage rekrutering van S. iniae infectie. (I) Succesvolle micro-injectie van rood gemerkte S. iniae (afgebeeld in magenta) in de otic blaasje. (Ii - iv) Fluorescerende confocale beelden van microgeïnjecteerde transgene mpEG1: dendra2 larven vastgesteld op 2 HPI. PBS-mock geïnfecteerde larven tonen werving weinig macrofagen (ii), maar larven besmet met CellTracker rood gemerkte (afgebeeld in magenta) wild-type S. iniae of de cpsA mutant tonen robuuste macrofagen werving voor de otic blaasje op 2 hpi (III, IV). Schaal bar, 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2: Fagocytose van S. iniae door fagocyten in de otic blaasje Transgene MPX:. dendra2 (A) of MPEG1: dendra2 (B) larve met rood-gelabeld S. besmet iniae (afgebeeld in magenta) en afgebeeld op 60 min na infectie met behulp van een laser scanning confocale microscoop. Schaal bar, 30 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Figuur 3
Figuur 3: Photoconversion van macrofagen in de otic blaasje 5 hpi met S. iniae. Macrofagen (afgebeeld in groen) aan de otic blaasje, door de cirkel (A) aangeduid, werden photoconverted (B) met behulp van een 405 nm laser op een confocale microscoop en bijgehouden in de tijd. Door 24 HPI, photoconverted macrofagen (afgebeeld in magenta) hebben tot aan de romp / caudale hematopoietische weefsel (C) gemigreerd; schaal bar, 50 micrometer. Hogere vergroting van de omkaderde gebieden in C wordt in (i) en (ii), schaalbalk 30 micrometer; pijlen wijzen naar photoconomgezet macrofagen. Photoconverted cellen blijken wit vanwege de samengevoegde 543 nm rode fluorescentie en de resterende 488 nm groene fluorescentie. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De infectie hier gebruikte methode is bruikbaar voor de studie van de gastheer immuunrespons op een aanvankelijk gelokaliseerde infectie in 2-3 dpf embryo's en larven. De focus van een inflammatoire stimulus, zoals infectie, in een gesloten ruimte zoals de otic blaasje maakt de studie van neutrofielen en macrofagen chemotaxis en fagocytose. Een waarschuwing injecteren bacteriën in de otic blaasje is dat het vermogen van neutrofielen efficiënt fagocyteren bacteriën in met fluïdum gevulde holtes kan afhankelijk van de specifieke microbe. Hoewel Escherichia coli en Bacillus subtilis niet gemakkelijk fagocytose door neutrofielen in de otic blaasje 28 hebben wij gevonden dat neutrofielen kunnen zowel Pseudomonas aeruginosa en S. fagocytose iniae op deze locatie 16, 24. Lokale infectie is ook nuttig bij het bestuderen van de invasiviteit van de verschillende ziekteverwekkers. Om een ​​systemische infectie na i veroorzakennjection in een gesloten ruimte zoals de otic blaasje, moet de microbe in staat zijn om fysieke host barrières doorkruisen. Alternatief kunnen verschillende pathogenen afhankelijk gastheercellen transport en verspreiding van de oorspronkelijke plaats van de infectie. Hierdoor gelokaliseerde injecties handig voor het vergelijken stammen van veranderde virulentie.

Tijdens micro-injectie, om bacteriën te voorkomen afwikkeling en verstopping van de naald, verandering naalden ofwel na elke aandoening of na ongeveer 50 larven. Dit zal helpen om de schorsing van de naald is meer uniform. Als bezinking bacteriën in de naald is een probleem, een mix van PBS, 2% PVP40, en 10% glycerol kan helpen om een ​​homogene suspensie. Om ervoor te zorgen dat elke larve wordt geïnjecteerd met ongeveer hetzelfde aantal bacteriën, controleer CFU tellingen door het homogeniseren van een larve onmiddellijk na de injectie en plating het homogenaat op CNA agar. CNA agar kiest voor de groei van kweekbare grampositieve bacteriën, niet alleenS. iniae, maar het zal een beeld van hoe consistent de injectie doseringen tussen elke afzonderlijke larve verschaffen. Met een doel entstof van 100 CFU per larve, zijn er meestal tussen de 75-150 kolonies op een CNA plaat. Het aantal niet-S. iniae gram-positieve kolonies groeien op een CNA plaat is waarschijnlijk zeer laag, aangezien de meeste PBS geïnjecteerd vis meestal resulteren in tussen 0-20 kolonies. Op latere tijdstippen tijdens de infectie is niet ongewoon dat er variatie heid tot half log in kolonies tussen larven geïnfecteerd met hetzelfde infectieuze dosis. Dit kan kleine verschillen tussen individuele larve in hun vermogen om de infectie te beheersen die van verschillen in het aantal kweekbare grampositieve bacteriën in de larven of E3 medium kunnen weerspiegelen.

Bij het injecteren in de otic blaasje, is het belangrijk te grote hoeveelheid of een te hoge druk kan veroorzaken holte scheuren te injecteren. Injectievolumes should tot ongeveer 1 nl worden gehouden. Als de naald te groot is, kan micro-injectie schade aan het omringende weefsel, dat de werving van gastheer leukocyten naar de plaats van infectie kan beïnvloeden of kunnen de bacteriën te lekken uit de otic blaasje veroorzaken. Het is ook belangrijk injectie bevestigen in de juiste ruimte. Als de naald te diep wordt ingebracht, kan het porren door de otic blaasje of het kan de bloedvaten stroomt rond de otic blaasje geraakt. Dit kan leiden tot de afzetting van bacteriën in de bloedstroom of buiten het blaasje, die gastheer respons kunnen veranderen.

Het is ook mogelijk dat wanneer de naald wordt geëxtraheerd, sommige bacteriën kunnen eenvoudig buiten het otic blaasje gedeponeerd als getoond door Colucci-Guyon et al. 28, maar vinden we dat dit alleen het geval in minder dan 5% van de injecties. Proberen te injecteren in het midden van de otic blaasje kan helpen voorkomen deze situatie. In een succesvolle infectie dient de otic blaasje vullen wet de fenolrood kleurstof, maar de kleurstof niet lekken in het omringende weefsel. Any-mis geïnjecteerd larven moeten onmiddellijk worden weggegooid. Injecteren gemerkte bacteriën is een nuttige manier om een succesvolle injectie (Figuur 1B) bevestigen. Eén van de nadelen van de CellTracker kleurstof dat deze kleurstof verdund worden naarmate de bacteriën verdelen uiteindelijk voorkomen dat de bacteriën onder fluorescentie gevisualiseerd. We kozen voor een rode kleurstof, omdat we vroeger groen gelabelde neutrofielen en macrofagen transgene lijnen voor de meerderheid van onze studies.

Dendra2 is een photoconvertible eiwitten afkomstig van octocoral Dendronephthya sp. die kan worden photoconverted van een groene tot een rode fluorescerende staat met een 405 nm laser 29. Dit photoconversion is een niet-invasieve manier om cellen te markeren en volgen hun lot in de loop van de infectie. Leukocyten aangeworven om de plaats van de infectie kan worden photoconverted en gevolgd in de tijd te bewaken hun dissemination gehele gastheer weefsels (Figuur 3). Alternatief kunnen leukocyten worden photoconverted vóór infectie en vervolgens gecontroleerd na microinjectie de oorsprong cellen aangeworven om de plaats van infectie te bepalen. Labeling bacteriën en immuuncellen maakt de studie van leukocyt-pathogeen interacties in vivo waaronder werving en fagocytose (figuur 1B en figuur 2). Het onderscheiden van de rood-gelabelde S. iniae van de rode fluorescentie van een photoconverted leukocyt moeilijk, dus een andere fluorescerende CellTracker kleurstof worden gebruikt. Dit zou bijzonder nuttig zijn om te bepalen welke van de photoconverted immuuncellen die de otic blaasje verlaten S. bevatten iniae.

Toekomstige toepassingen van de otic blaasje infectie methode kan omvatten het meten van de snelheid en richting waarmee neutrofielen en macrofagen bewegen in reactie op verschillende infecties. De infectie kinetics kan ook worden onderzocht om te zien welke celtypen de eerste aan een plaats van infectie en welke cellen zijn sterkst gerekruteerd naast waarbij de cellen afkomstig zijn of wanneer zij 30 verspreiden. Naast het bestuderen van de rekrutering van een aanvankelijk gelokaliseerde infectie, kan deze infectie model worden gebruikt om de functie van gastheer immuunsysteemcomponenten bestuderen tijdens de eerste infectie. Antisense oligonucleotiden die morfolino RNA's doel kan worden gebruikt voor het neerslaan van expressie van gastheer immune componenten waaronder Toll-like receptoren, cytokine receptoren en leukocyten en CRISPR-Cas of TALEN technologie kan worden gebruikt om genetisch mutanten te creëren. Genexpressie met RNAseq of qPCR kan ook worden gebruikt om de expressie van bepaalde genen samen te karakteriseren als reactie op infectie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen graag lab leden bedanken voor de zebravis verzorging en onderhoud. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health, National Research Service Award A155397 aan EA Harvie en NIH R01GM074827 aan Anna Huttenlocher.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.7 ml Eppendorfs MidSci AVSS1700
14 ml Falcon tube BD Falcon 352059
27 G x ½ in. needle BD Biosciences 305109
96-well Plate Corning Incorporated 3596
Agar BD Biosciences 214030
CellTracker Red Molecular Probes, Invitrogen C34552
CNA agar Dot Scientific, Inc 7126A
Disposable transfer pipets Fisher Scientific 13-711-7m
Dissecting scope Nikon SMZ745
DMSO Sigma Aldrich D2650
Ethanol 200 proof MDS 2292
Fine tweezers Fine Science Tools 11251-20
Gel comb VWR 27372-482 4.2 mm width, 1.5 mm thick
Glass bottom dishes Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light.
Glycerol Fisher Scientific G33-4
High melt agarose Denville Scientific, Inc. CA3510-6
Hydrogen peroxide Fisher Scientific H325
Laser scanning confocal microscope Olympus with FV-1000 system
Low melt agarose Fisher BP165-25
Magnetic stand Tritech (Narishige) GJ-1
Microinjection system Parker Picospritzer III
Microloader pipet tips Eppendorf 930001007
Micromanipulator Tritech (Narishige) M-152
Micropipette puller Sutter Instrument Company Flaming/Brown P-97
Nanodrop spectrophotmeter Thermo Scientific ND-1000
N-Phenylthiourea (PTU) Sigma Aldrich P7629
Paraformaldheyde Electron Microscopy Sciences 15710
Petri dishes Fisher Scientific FB0875712 100 x 15 mm
Phenol Sigma Aldrich P-4557
Phenol Red Ricca Chemoical Company 572516
Phosphate buffered saline Fisher Scientific BP665-1
Potassium hydroxide Sigma Aldrich P-6310
Pronase Roche 165921
Protease peptone Fluka Biochemika 29185
Small cell culture dish Corning Incorporated 430165 35 x 10 mm
Sudan Black Sigma Aldrich S2380
Thin wall glass capillary injection needles World Precision Instruments, Inc. TW100-3
Todd Hewitt Sigma Aldrich/Fluka Analytical T1438
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) Argent Chemical Laboratory/Finquel C-FINQ-UE-100G
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-500
Tween 20 Fisher Scientific BP337-500
Yeast extract Fluka Biochemika 92144

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
  2. Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
  3. Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  4. Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
  5. Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
  6. Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
  7. Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
  8. Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
  9. Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
  10. Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
  11. Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
  12. Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
  14. Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
  15. Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
  16. Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
  17. Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
  18. Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
  19. Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
  20. He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
  21. Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
  22. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  23. Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
  24. Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
  25. Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
  26. Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
  27. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
  28. Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
  29. Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
  30. Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).

Tags

Immunologie immunologie infectie aangeboren immuniteit zebravis larven, Neutrofielen macrofagen, Micro-injectie confocale beeldvorming fotoconversie
Niet-invasieve beeldvorming van de aangeboren immuunrespons in een zebravis larven Model van<em&gt; Streptococcus iniae</em&gt; Infectie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Harvie, E. A., Huttenlocher, A.… More

Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Non-invasive Imaging of the Innate Immune Response in a Zebrafish Larval Model of Streptococcus iniae Infection. J. Vis. Exp. (98), e52788, doi:10.3791/52788 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter