Abstract
L'agent pathogène aquatique, Streptococcus iniae, est responsable de plus de 100 millions de dollars de pertes annuelles pour l'industrie de l'aquaculture et est capable de provoquer une maladie systémique dans les deux poissons et les humains. Une meilleure compréhension de S. maladie iniae pathogénie nécessite un système de modèle approprié. La traçabilité génétique et la transparence optique des premiers stades de développement du poisson zèbre pour permettre la génération et l'imagerie non-invasive de lignées transgéniques avec étiqueté par fluorescence des cellules immunitaires. Le système immunitaire adaptatif est pas complètement fonctionnel jusqu'à plusieurs semaines après la fécondation, mais larves de poisson zèbre ont un système immunitaire inné de vertébré conservé à la fois les neutrophiles et les macrophages. Ainsi, la génération d'un modèle d'infection larvaire permet l'étude de la contribution spécifique de l'immunité innée dans le contrôle de S. infection iniae.
Le site de micro-injection permettra de déterminer si une infection estsystémique ou localisée initialement. Ici, nous présentons nos protocoles pour l'injection de vésicule otique du poisson zèbre âgés de 2-3 jours après la fécondation ainsi que nos techniques d'imagerie confocale de fluorescence de l'infection. Un site d'infection localisée permet l'observation de l'invasion microbienne initiale, recrutement des cellules hôtes et la diffusion de l'infection. Nos résultats en utilisant le modèle des larves de poisson zèbre de S. iniae infection indiquent que le poisson zèbre peut être utilisé pour examiner les différents apports de neutrophiles et les macrophages d'accueil dans les infections bactériennes localisées. En outre, nous décrivons comment photomarquage des cellules immunitaires peut être utilisé pour suivre le destin des cellules hôte individuel au cours de l'infection.
Introduction
Streptococcus iniae est un agent pathogène aquatique majeur qui est capable de provoquer une maladie systémique dans les poissons et les humains 1. Bien que S. iniae est responsable de pertes importantes dans l'industrie de l'aquaculture, ce est aussi un agent pathogène zoonotique potentiel, capable de provoquer une maladie chez les hôtes humains immunodéprimés atteints de pathologies cliniques similaires à ceux causés par d'autres agents pathogènes humains streptocoques. Compte tenu de ses similitudes avec des agents pathogènes humains, il est important d'étudier S. iniae pathogenèse des maladies dans le contexte d'un hôte naturel. Un modèle de poisson zèbre adulte de S. infection iniae a révélé l'infiltration robuste de leucocytes d'accueil sur le site de l'infection localisée ainsi comme un temps rapide d'accueillir la mort, un temps trop court pour impliquer le système immunitaire adaptatif 7. Afin d'obtenir un regard en profondeur dans la réponse immunitaire innée à S. iniae infection in vivo, il est nécessaire d'utiliser un modèle qui est plus favorable à nsur-invasive imagerie en temps réel.
Le poisson zèbre larves a un certain nombre d'avantages qui en font un modèle vertébré plus en plus attrayant pour étudier les interactions hôte-pathogène. Poisson zèbre sont relativement peu coûteux et facile à utiliser et à entretenir par rapport aux modèles de mammifères. L'immunité adaptative est pas fonctionnellement matures jusqu'à 4-6 semaines après la fécondation, mais les larves ont un système immunitaire inné des vertébrés hautement conservée avec le complément, Toll-like récepteurs, les cytokines et les neutrophiles et les macrophages avec des capacités antimicrobiennes y compris la phagocytose et la bouffée respiratoire 2-6, 8-11. En outre, la traçabilité génétique et la transparence optique des stades embryonnaires et larvaires de développement pour permettre la génération de lignées transgéniques stables avec les cellules immunitaires marquées par fluorescence permettant d'étudier les interactions hôte-pathogène en temps réel in vivo. La génération de ces lignées transgéniques en utilisant une protéine photoconvertible tels que DenDRA2 permet le suivi de l'origine de la cellule hôte et le destin individuel au cours de l'infection 12.
Lors de l'élaboration d'un modèle d'infection des larves de poisson zèbre, le site choisi de microinjection permettra de déterminer si une infection est initialement localisée ou systémique. Infections du sang systémique dans la veine caudale ou un conduit de Cuvier sont les plus couramment utilisées pour étudier les pathogènes microbiens chez le poisson zèbre et sont utiles pour étudier les interactions entre l'hôte et des cellules microbiennes, les réponses de cytokines, et les différences de virulence entre les souches pathogènes. Pour les micro-organismes à croissance plus lente, une injection précoce dans le sac vitellin d'un embryon au stade 16-1,000 cellulaire peut être utilisée pour générer une infection systémique 13,14, avec le stade de développement optimal pour la micro-injection d'un micro-organisme à croissance lente jugée entre l'étape 16 à 128 de la cellule 15. Toutefois, le jaune injections sac de nombreux microbes à des stades ultérieurs de développement hôte ont tendance à être mortelle à til accueillera en raison de l'environnement riche en nutriments pour le microbe et le manque de leucocytes infiltrants 16-18.
Une infection localisée se traduit généralement par la migration dirigée des leucocytes vers le site de l'infection qui peut être facilement quantifiée par imagerie non invasive. Ce type d'infection peut permettre pour la dissection des mécanismes qui interviennent dans la migration des leucocytes ainsi que des enquêtes de différentes capacités migratoires et phagocytaires de diverses populations leucocytaires. Infections localisées sont également utiles lors de l'examen des différences de virulence entre les souches bactériennes ainsi que l'étude des mécanismes d'invasion de microbes depuis barrières de l'hôte physiques doivent être croisés pour une infection localisée à devenir systémique. Poisson zèbre sont généralement soulevé à des températures de 25-31 ° C 19, mais ils peuvent aussi être maintenu à des températures aussi élevées que 34 à 35 ° C pour les études de l'envahissement de certains agents pathogènes humains avec les exigences de température strictespour la virulence 20, 21.
De nombreux sites différents ont été utilisés pour générer une infection bactérienne localisée initialement compris le ventricule du cerveau postérieur 22, queue muscle dorsal 18, la cavité péricardique 23, et la vésicule otique (oreille) 5, 16, 24. Cependant, il a été trouvé que l'injection des bactéries en queue muscle peut causer des dommages aux tissus et l'inflammation indépendante des bactéries, ce qui peut fausser les résultats lorsque l'enquête réponse des leucocytes 13. Bien que moins de dommages est associé à l'injection dans le cerveau postérieur et bien que ce est d'abord dépourvu de leucocytes chez les jeunes embryons, le ventricule rhombencéphale gagne progressivement les cellules immunitaires dans le temps que les microglies se installent. Le ventricule rhombencéphale est également un endroit plus difficile à l'image. La vésicule otique est une cavité creuse fermée sans accès direct à la vascularisation 25, 26. Il est normalement dépourvue de leukocytes leucocytes, mais peuvent être recrutés pour la vésicule otique en réponse à des stimuli inflammatoires telles que l'infection. Il est également un site privilégié de la micro-injection de bactéries chez le poisson zèbre ans après la fécondation (DPF) 2-3 jours en raison de la facilité d'imagerie et la visualisation de l'injection. Par conséquent, nous avons choisi la vésicule otique que notre site d'infection bactérienne localisée.
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Protocol
Adultes et embryonnaires poisson zèbre ont été maintenus en conformité avec l'Université du Wisconsin-Madison recherche Ressources Animales Center.
1. Préparation de microinjection Aiguilles
- Préparer aiguilles d'injection capillaire en verre de paroi mince (1,0 OD / 0,75 ID) en utilisant un dispositif micropipette extracteur avec les paramètres suivants: pression d'air 200, la chaleur 502, tirez 90, vitesse 80, heure 70, heure de l'air au début de la traction 5, temps d'antenne à la fin de la traction 5.
- En utilisant des pinces fines, détacher la pointe de l'aiguille tiré sorte que l'ouverture de la pointe a un diamètre d'environ 10 um.
2. la préparation des plats d'injection larvaires
- Rincer un peigne de gel avec la largeur des voies d'environ 4-5 mm dans de l'eau stérile et laisser sécher.
- Préparer une solution d'agarose de fusion élevé de 1,5 à 2% en milieu E3 19 et micro-ondes jusqu'à ce que la solution est claire. Une fois refroidi, verser une partie de l'agarose dans une boîte de Petri (100 x 15 mm) et tourbillon,ajoutant juste assez d'agarose pour couvrir complètement le fond de la boîte.
- Une fois que la couche d'agarose est solidifiée, placer le peigne sur gel rincée et séchée au-dessus de sorte que l'extrémité non peigné est simplement posée sur la partie supérieure de la boîte de Pétri et l'extrémité est en contact avec la peigné agarose. Assurez-vous que le peigne est aussi horizontale que possible, créant un angle de 30 ° par rapport à la couche d'agarose bas.
- Verser une petite quantité supplémentaire de agarose à l'interface entre le peigne et la couche d'agarose fond de sorte que la couche d'agarose frais couvre les puits du peigne. Laisser refroidir complètement avant de retirer le peigne. En utilisant une pointe de la pipette, retirez tous les morceaux en surplomb de agarose des puits.
- Verser moyenne E3 sur le dessus du moule d'injection et conserver à 4 ° C.
- Avant chaque utilisation, remplacer par injection chaude moyennes et des rampes frais à 28,5 ° C pendant au moins une heure avant l'injection.
- Immédiatement avant les injections, remplacer l'E3 sur la rampe d'injection avecMoyenne E3 contenant 200 ug / ml d'éthyle 3-aminobenzoate (tricaïne).
3. Préparation S. iniae inoculum
- Préparer et autoclaver milieu de bouillon de Todd Hewitt complémenté avec 0,2% d'extrait de levure et 2% de peptone de proteose (THY + P): 30 g / L de Todd Hewitt, 2 g / l d'extrait de levure, 20 g / L proteose peptone. Pour des plaques de gélose, ajouter 14 g / l d'agar.
- Préparer cultures bactériennes la veille infections par pipetage une aliquote de 100 pi de stock bactérienne congelé dans 10 ml de bouillon P + THY dans un tube scellé 15 ml. Incuber une nuit sans agitation à 37 ° C. Après 14-16 heures de la croissance, utiliser la culture du jour au lendemain de faire des stocks de congélateur ou préparer pour une utilisation dans les injections.
- Faire stocks de congélateur en plaçant 1 ml de la culture d'une nuit dans 500 pi de 80% de glycerol dans un tube de 1,7 ml de la centrifugeuse. Pour éviter les cycles de gel-dégel, faire 100 pi à usage unique aliquotes de ce mélange et conserver à -80 ° C.
- Pour S. iniae utilisé dans infections, diluer la culture de la nuit 1: 100 pour un volume total de la culture de 10 ml par addition de 0,1 ml de culture de la nuit à 9,9 ml de THY + P bouillon. Croître à 37 ° C sans agitation pendant environ 4-5 heures. Surveiller la densité optique (DO) à 600 nm en utilisant un spectrophotomètre à Nanodrop et récolter les bactéries en phase logarithmique de la mi-lorsque la DO600 de 0,250 à 0,500 nm atteint. Une DO600 nm de 0,250 correspond à environ 10 8 unités formant des colonies (UFC) / ml.
- Pastille 1 ml de la culture bactérienne dans un tube de centrifugeuse de 1,7 ml à 1 500 xg pendant 5 min. Remettre en suspension dans 1 ml de PBS frais et recommencer. Mesurer la DO 600 nm de la bactérie dans du PBS, d'une pastille, et remettre en suspension dans du PBS pour obtenir la concentration désirée.
- Pour faciliter la visualisation de micro-injection, le rouge de phénol à ajouter les suspensions bactériennes avant l'injection pour une concentration finale de 0,1%.
- Pour les expériences impliquant l'injection des bactéries tuées par la chaleur, le chauffage des bactéries dans du PBS à 95 ° C pendant 30 min.Assurez-vous que le processus de la chaleur tuant réduit le nombre de bactéries viables à des niveaux indétectables par placage un volume d'injection (environ 1 nl) le THY solide + plaques d'agar P et une nuit d'incubation à 37 ° C.
4. Étiquetage S. inia e avec un CellTracker rouge fluorescent Dye
- Pour étiqueter cellules bactériennes vivantes, préparer une solution de réserve d'un colorant fluorescent ou équivalent CellTracker. Comme le colorant utilisé est en 20 x 50 ug aliquotes de poudre et doit être remis en suspension dans du DMSO, ajouter 7,3 ul de DMSO dans le tube pour obtenir une concentration de 10 mM stock.
- Testez une gamme de concentrations de colorants (par exemple, 0,5 à 25 uM) sur les bactéries pour déterminer la plus faible concentration optimale qui colore les cellules. Cellules à division rapide et des expériences plus longues peuvent nécessiter une plus forte concentration de colorant.
- Pellet 1,0 ml de culture bactérienne dans un tube de 1,7 ml par centrifugation comme décrit ci-dessus (article 3). Reprendre le culot dans 1ml en PBS frais et ajouter le volume approprié de colorant pour la culture bactérienne.
- Incuber sans agitation à 37 ° C pendant 30 min. Isoler les bactéries et les remettre en suspension dans 1 ml de bouillon préchauffé THY P + et incuber sans agitation pendant encore 30 minutes à 37 ° C.
- Isoler les bactéries et laver deux fois dans du PBS avant de mesurer la DO600 nm et diluer les bactéries pour microinjection comme indiqué ci-dessus (article 3). Nous injectons habituellement environ 100 CFU en 1 volume d'injection nl pour nos études sur le recrutement des leucocytes et la phagocytose.
5. Préparation de poisson zèbre larves pour les infections
- Mettre en place couples reproducteurs la nuit avant et recueillir des embryons comme décrit par Rosen et al. 27 embryons Incuber en milieu E3 à 28,5 ° C avant d'être prêt à infecter.
- Pour le poisson zèbre qui sera imagé, empêcher le développement de pigment (mélanisation) par l'addition de N-phénylthiourée (PTU) à laE3 moyenne à 24 heures après la fécondation (HPF) pour une concentration finale de 0,2 nM.
- Pour les infections impliquant des embryons âgés de 2 dpf, embryons dechorionate manuellement avec une paire de pinces fines. Alternativement, les embryons dechorionate en supprimant E3 et les remplacer par la pronase (2 mg / ml) pendant environ 5 min ou jusqu'à ce que le pipetage douce brise embryons sur le chorion. La plupart des larves ont éclos devraient naturellement par 3 dpf.
- Anesthésier poisson zèbre plusieurs minutes avant l'infection en plaçant larves dechorionated dans le milieu E3 contenant 200 ug / ml tricaïne.
6. otique vésicules injection de S. iniae en trois jours larves âgées
- Allumez le micro-injecteur et définir la plage de temps de "milliseconde". Ouvrir la valve sur le réservoir de dioxyde de carbone de laisser du gaz dans la ligne. La pression de la microinjecteur doit indiquer environ 20 psi. Régler la pression dans l'unité de micro-injecteur par rotation vers la droite de la molette noire pour incratténué la pression ou antihoraire tourner la baisse de pression.
- Vortex préparé S. culture iniae en rouge de phénol et PBS et utiliser une pointe de microloader charger 2-3 ul de la culture dans une aiguille d'injection capillaire tiré.
- Monter l'aiguille chargée sur un micromanipulateur connecté à un support magnétique et le positionner sous un stéréomicroscope de sorte que l'aiguille se trouve à un angle d'environ 45-65 ° par rapport à la base du microscope.
- Appuyez sur la pédale de commande de la micro-injecteur pour distribuer une goutte de l'inoculum sur la pointe de l'aiguille. Mesurer le diamètre de la goutte en utilisant la barre d'échelle dans la lentille oculaire du microscope.
- En variante, estimer le diamètre de la goutte par injection d'un volume dans une goutte d'huile minérale sur une lame de microscope en verre avec une barre d'échelle. Le diamètre de la goutte doit être d'environ 0,10 mm, qui est d'environ un volume de 1 nl.
- Ajuster la taille des gouttes en ajustant le réglage de la duréele micro-injecteur ou en coupant les plus de la pointe de l'aiguille avec des pincettes fines. A noter que le temps d'injection doit être comprise entre 20 à 35 msec pour éviter de causer des dommages aux tissus trop.
- En utilisant une pipette de transfert en plastique, le transfert 12 anesthésiés larves dans chaque puits du moule d'injection.
- Utilisez une tige de verre, boucle de cheveux, ou la pointe en plastique pour positionner délicatement les larves de telle sorte que les têtes sont pointés vers l'arrière du microscope et les sacs vitellins sont contre le côté gauche du puits. Pointez l'oreille gauche de la larve vers le plafond.
- En regardant à travers la lentille oculaire du microscope stéréoscopique, utiliser les boutons sur le micromanipulateur pour aligner l'aiguille chargée avec la vésicule otique de sorte que les deux sont dans le même champ de vision. Pierce la couche épithéliale externe de la vésicule otique avec la pointe d'aiguille de sorte que la pointe de l'aiguille est juste à l'intérieur de la vésicule.
- Appuyez sur la pédale d'injecter 1 nl de la dose souhaitée de S. iniae. Veillez à utiliser unpression suffisamment faible pour ne pas rompre la cavité. Si l'injection est réussie, la vésicule otique, mais pas le tissu environnant, doivent remplir avec le phénol inoculum rouge (Figure 1 Ai). Enlever immédiatement les poissons mal injecté à partir de la plaque d'injection.
- Rétracter délicatement l'aiguille de la larve et déplacer la plaque d'injection à la main afin que la prochaine larve est en vue. Pour ce faire, en vertu de grossissement 5X.
Remarque: retrait de l'aiguille peut entraîner le dépôt de certaines bactéries à l'extérieur de la vésicule otique, ce qui peut fausser la survie et le recrutement des leucocytes résultats. Pour éviter cela, il est recommandé d'injecter des bactéries marquées par un colorant fluorescent et balayer visuellement larves injecté sous un microscope à fluorescence pour enlever les larves où cela se est produit. Une larve correctement injecté est montré dans (Figure 1 Bi). - Pour assurer le volume d'injection / inoculum reste le même au cours de l'expérience, injecter une goutte du s bactériennesUSPENSION dans un tube de 1,7 ml de centrifugeuse contenant 100 pi de PBS stérile après chaque 48 e embryon. Plaque sur les 100 pi de gélose THY P + plaques à 37 ° C pendant une nuit pour déterminer le CFU dans le volume d'injection.
- Lorsque l'ensemble du groupe des 12 larves sur la rampe d'injection a été injecté, à utiliser avec précaution une pipette de transfert en plastique pour enlever les larves des puits et les placer dans une nouvelle boîte de Pétri (35 x 10 mm 2). Retirer la solution de tricaïne et le remplacer par environ 2 ml de milieu de E3 frais pour permettre aux larves de récupérer.
- Pipet injecté larves dans des puits individuels d'une plaque de 96 puits et incuber à 28,5 ° C. Surveiller les larves au fil du temps pour la survie dans ces plaques ou supprimer plus tard pour imagerie ou UFC compte.
7. Noir Soudan Coloration des neutrophiles
Remarque: Les étapes suivantes peuvent être effectuées à la température ambiante dans une petite boîte de Petri (35 x 10 mm 2) sur un agitateur orbital à moins otherwise contraire. Pour chaque étape, la quantité de réactif utilisé est d'environ 2 ml par boîte, en utilisant juste assez de liquide pour couvrir complètement les larves.
- Pour la fixation des larves infectées, utiliser une pipette Pasteur en verre pour éliminer le milieu E3 et le remplacer par un 4% de paraformaldéhyde glacée dans une solution PBS. Immédiatement placer le poisson à 4 ° C pour euthanasier. Fixer une nuit à 4 ° C.
- Lavez 3 fois en PBS pendant 5 min chacun.
- Stain avec le Soudan noir (0,18% stocks dilué 1: 5 à 70% d'éthanol, 0,1% de phénol) pendant 30 min à 5 h. Utilisez un stéréomicroscope pour vérifier si des granules des neutrophiles ont pris la tache.
- Effectuer une série de lavages de 5 min en commençant par un seul lavage à l'éthanol 70% suivi d'un lavage d'un rapport 1: 1 d'éthanol à 70% et du PBS, suivi par un lavage final dans du PBS.
- Réhydrater dans PBS plus 0,1% entre (PBT).
- Pour effacer les larves de pigment, laver à 1% d'hydroxyde de potassium / 1% de peroxyde d'hydrogène pendant environ 6-10 min. Surveiller l'échantillon Closely et après environ 5 minutes, vérifiez les larves sous un stéréomicroscope de voir combien du pigment a autorisé. Si la solution est laissée trop longtemps, les sacs vitellins se gonflent et éclatent.
- Lavez 3 fois pendant 5 min chacune dans du PBS.
- Conserver les échantillons dans PBS ou PBT à 4 ° C jusqu'à 1 semaine avant d'être prêt à l'image et à compter.
- À l'image du Soudan teinté noir larves, transférer le poisson dans PBT et puis dans 80% de glycérol et placez sur une seule diapositive de la dépression de la cavité. Position fixé larves sous un stéréomicroscope en utilisant une pointe de pipette. Image en utilisant un appareil photo numérique de couleur sur un stéréomicroscope (Figure 1 Aii-iv).
8. dénombrement des bactéries viables de larves infectées
- Euthanasier larves au moment souhaité après l'infection dans un 200-300 mg / L solution glacée de tricaïne en milieu E3.
- Pipet euthanasié larves dans 1,7 ml tubes de centrifugation. Retirer la solution de tricaïne et les remplacer par 100 pi de 0,2%Triton X-100 dans du PBS (PBSTx).
- Homogénéiser larves en faisant passer de haut en bas 10 fois à travers une aiguille G 27.
- Préparer des dilutions en série de broyats dans PBS stérile. Par exemple, si la dose infectieuse est de 100 CFU, la pipette 100 ul de l'homogénat dans 900 ul de PBS stérile. Utiliser un nouvel embout de pipette, transférer 100 pi de l'homogénat dilué dans 900 pi de PBS stérile.
- Planche 100 ul de dilutions sur gélose Columbia CNA pour l'isolement sélectif des bactéries à Gram positif et les incuber à 37 ° C pendant 48 heures. Ce milieu offrira une plus grande sélection de plaques de gélose THY P +, qui charge la croissance de bactéries gram-négatives et gram-positives.
- Sur des plaques de moins de 500 colonies individuelles, compter le nombre de colonies et multiplier par le facteur de dilution pour déterminer le nombre d'UFC.
9. Fixation des larves for Imaging
- Fixer les larves dans un paraformaldehyde à 4% glacé dans une solution de PBS comme ledécrit dans l'article 7.
- A température ambiante, laver 3 fois pendant 5 min chacune dans du PBS avant l'imagerie.
10. Préparation de larves pour l'imagerie en direct
- Préparer une solution d'agarose à bas point de fusion de 1,5% en E3 par chauffage au micro-ondes jusqu'à ce que la solution est claire.
- Placez solution de gélose dans un bain-marie à 55 ° pour le laisser refroidir mais pas durcir.
- Ajouter tricaïne de l'agarose à une concentration finale de 0,016%.
- Aide d'une pipette de transfert en plastique, placez 4-5 larves anesthésiés dans un plat à fond de verre sur la scène d'un stéréomicroscope.
- Retirez la tricaïne et solution d'agarose du bain d'eau à 55 ° C et le laisser refroidir à la température ambiante pendant 1 à 2 min. Alors que l'agarose se refroidit, retirer autant de liquide des larves anesthésié que possible.
- Verser le agarose refroidi dans le moule jusqu'à ce que environ la moitié de la surface est couverte. Agiter le plat de répandre l'agarose. Notez que si l'agaroseest trop chaud, il va tuer les larves. En outre, si trop d'agarose est ajoutée à la boîte, la lentille d'objectif du microscope peut frapper le fond de la boîte lors de la focalisation à travers l'agarose.
- Aide d'une pipette de transfert, ramasser les larves qui ont flotté sur les côtés du plat et pipeter les ramener vers le centre.
- Sous la loupe binoculaire, placez doucement les larves comme vous le souhaitez avec une boucle de cheveux, une pointe de pipette long ou une tige de verre. Pour l'imagerie de la vésicule otique, positionner les larves de sorte que la vésicule otique est laissé à plat contre le fond de la boîte.
- Laissez refroidir agarose pendant environ 10 minutes avant de passer le plat. Les larves peuvent passer positions si l'agarose ne est pas solide. Pipeter doucement certains tricaïne et la solution E3 au sommet de la couche d'agarose pour le garder humide.
11. imagerie confocale des maladies infectieuses
- Placer le plat à fond de verre avec des larves sur la scène d'un microscope inversé avec un balayage laser confoca FV-1000Système de l.
- Réglez le sténopé à 200-300 um et en utilisant une ouverture numérique 0,75 / 20X objectif, ensemble Z-piles avec 3-6 um tranches.
- Utilisation balayage de ligne continu pour ajuster le gain de puissance du laser et du détecteur pour chaque canal.
- Utilisant un balayage de ligne séquentiel pour chaque canal de fluorescence (par exemple, 488 et 543 nm) et contraste d'interférence différentiel (DIC), effectuer un film laps de temps de la vésicule otique laissé toutes les 3 min pour les 2-6 heures pour observer recrutement initial et la phagocytose par les neutrophiles et les macrophages. Pour de plus longues plages de temps, placer un couvercle sur la boîte de Pétri pour éviter l'évaporation et le dessèchement de la gélose.
- Acquérir des images fixes de fixe (figure 1B) ou de vivre (Figure 2) larves à 20X ou 40X.
12. Photoconversion de Dendra2-leucocytes marqués à l'otique vésicules
Remarque: Dendra2 peut être photoconverted du vert au fluorescence rougeen focalisant un laser 405 nm (puissance du laser de 50 à 70% doit être suffisante) sur la région d'intérêt (ROI) pendant 1 min. Ci-dessous est le protocole étape par étape, utilisée pour le système à balayage laser confocal FV-1000:
- Visualisez l'échantillon en utilisant un balayage z-stack avec le 488 nm et 543 nm lasers. Utilisation balayage de ligne continu pour ajuster le gain de puissance du laser et du détecteur. Assurez-vous qu'il n'y a pas fluorescence rouge accidentellement photoconverted.
- Dans la fenêtre "Image Acquisition de contrôle", sous "Paramètres de stimulation" sélectionnez l'outil "Utiliser Scanner" et choisissez "principale". Sélectionnez le laser de 405 nm et le fixer à 70% de la puissance. Utilisation de l'option de cercle, définir le ROI dans la vésicule otique.
- Sous la rubrique «Réglage de stimulation Démarrer", sélectionnez "Activation en série" avec un pré-activation de 1 cadre et un temps d'activation de 60 000 ms. Dans la fenêtre "Réglage acquisition» dans le cadre du "Temps de Scan rubrique«, choisissez 2intervalles de 00:01:00 (un pour avant et une pour photoconversion post).
Remarque: Après le temps de balayage de la série de déchéance est complète, le Dendra2 aurait été photoconverted à son état rouge fluorescent. - Balayer l'échantillon par une z en utilisant la pile 488 nm et 543 nm lasers pour visualiser la fluorescence rouge photoconverted ainsi que toute fluorescence verte restante (figure 3).
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Representative Results
Microinjection de S. iniae dans la vésicule otique (Figure 1 et Figure 2) conduit à une réponse de l'hôte initialement localisée. Lorsqu'elle est injectée correctement, les bactéries doivent seulement être vu dans la vésicule otique et non dans le tissu ou le sang environnant. Ceci peut être visualisé au cours de la micro-injection en utilisant un colorant rouge de phénol (figure 1A). Alternativement, si bactéries marquées sont injectées, une analyse rapide des larves infectées poster immédiatement injection peut confirment les bactéries ne sont dans la vésicule otique et non le tissu environnant (figure 1B). Bien qu'une dose aussi peu que 10 CFU sauvage de type S. iniae est en mesure d'établir une infection mortelle dans les 24-48 heures post infection (HPI), l'injection de 1 000 UFC d'une souche non virulente, AFPC, ne entraîne pas d'infection mortelle et que la souche semble incapable de proliférer dans l'hôte 24. Ainsi, ce modèle d'infection localisée est capable de differentiate entre les souches bactériennes de virulence altérée.
les sites de microinjection d'infection localisée initialement sont utiles pour étudier la chimiotaxie de leucocytes. Le recrutement des leucocytes peut par quantifiée par coloration soit noir du Soudan de granules des neutrophiles (figure 1A) ou le formaldéhyde fixation des lignées transgéniques fluorescents (figure 1B). Pour visualiser le recrutement et les capacités phagocytaires de cellules immunitaires, nous avons utilisé des lignées transgéniques exprimant la protéine verte fluorescente Dendra2 spécifiquement dans les macrophages Tg (MPEG1: Dendra2) 24 ou neutrophiles Tg (mpx: Dendra2) 12. Lorsque S. iniae est injecté dans la vésicule otique de 3 larves de dpf, les neutrophiles et les macrophages sont rapidement recrutés dans le premier hpi 2 (figure 1). Cependant, lorsqu'il est effectué correctement, la micro-injection de PBS dans la vésicule otique ne aboutit pas à la même robuste recrutement de leucocytes de l'hôte (
Figure 2: La phagocytose de S. iniae par des phagocytes dans la vésicule otique de mpx Transgénique:. Dendra2 (A) ou MPEG1: Dendra2 (B) larve infectée par le rouge marqué S. iniae (représenté en magenta) et imagée après l'infection de 60 min en utilisant un laser scanning microscope confocal. La barre d'échelle, 30 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Photoconversion des macrophages à la vésicule otique 5 HPI avec S. iniae. macrophages (représentés en vert) à la vésicule otique, désignés par le cercle (A), ont été photoconverted (B) en utilisant un laser de 405 nm sur un microscope confocal et suivi dans le temps. En 24 HPI, macrophages photoconverted (représenté en magenta) ont migré aussi loin que le tronc / caudale tissu hématopoïétique (C); barre d'échelle, 50 um. Grossissements plus élevés des régions encadrées dans C sont présentés dans (i) et (ii), barre d'échelle 30 um; flèches pointent vers Photoconmacrophages convertis. Photoconverted cellules apparaissent en blanc à cause de la fluorescence rouge fusionnée 543 nm et tout en restant 488 nm fluorescence verte. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
La méthode d'infection utilisé ici est utile pour l'étude de la réponse immunitaire de l'hôte à une infection localisée initialement dans 2 à 3 dpf embryons et les larves. La mise au point d'un stimulus inflammatoire, comme une infection, dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique permet l'étude de la chimiotaxie de neutrophiles et de macrophages et de phagocytose. Une mise en garde de l'injection de bactéries dans la vésicule otique est que la capacité des neutrophiles à phagocytent efficacement les bactéries dans les cavités remplies de liquide peut dépendre du microbe particulier. Bien que Escherichia coli et Bacillus subtilis sont pas facilement phagocytés par les neutrophiles dans la vésicule otique 28, nous avons trouvé que les neutrophiles sont capables de phagocyter les deux Pseudomonas aeruginosa et S. iniae à cet endroit 16, 24. Infection localisée est également utile lorsque l'on étudie le caractère invasif de divers agents pathogènes. Afin de provoquer une infection systémique i suivantenjection dans une cavité fermée de telle sorte que la vésicule otique, le microbe doit être capable de traverser les barrières physiques de l'hôte. Alternativement, différents agents pathogènes peuvent se appuyer sur des cellules hôtes pour le transport et la diffusion à partir du site initial de l'infection. Cela rend les injections localisées utiles pour comparer les souches de virulence altérée.
Au cours de la micro-injection, pour éviter les bactéries décantation et le colmatage de l'aiguille, aiguilles de changement soit après chaque état, soit après environ 50 larves. Cela aidera à assurer la suspension dans l'aiguille est plus uniforme. Si le règlement de bactéries dans l'aiguille semble être un problème, un mélange de PBS, 2% PVP40, et 10% de glycérol peut aider à garder une suspension homogène. Pour se assurer que chaque larve est injecté à environ le même nombre de bactéries, de vérifier le nombre de CFU par homogénéisation d'un larve immédiatement après l'injection et l'homogénat de placage sur de l'agar CNA. Agar ANC sélectionner pour la croissance des bactéries gram-positives cultivables, non seulementS. iniae, mais il fournira une idée de la façon cohérente les doses d'injection sont entre chaque larve individuelle. Avec un inoculum cible de 100 UFC par larve, il ya généralement entre 75 à 150 colonies sur une plaque de l'AIIC. Le nombre de non-S. colonies Gram positif iniae croissants sur une plaque AIIC est probablement très faible, car la plupart PBS injecté poissons entraîne habituellement entre 0-20 colonies. Aux points de temps plus tard au cours de l'infection, il ne est pas rare qu'il y ait variation de jusqu'à un demi-log du nombre de colonies entre larves infectées avec la même dose infectieuse. Cela pourrait représenter de légères différences entre la larve individu dans leur capacité à contrôler l'infection ou pourrait refléter des différences dans la quantité de bactéries gram-positives cultivables dans les larves ou moyen E3.
Tout en injectant dans la vésicule otique, il est important de ne pas injecter un volume trop grand ou avec une pression trop élevée, car cela pourrait provoquer la cavité à la rupture. Les volumes d'injection shoULD être maintenue à environ 1 nl. Si l'aiguille est trop grande, la micro-injection peut causer des dommages aux tissus environnants, ce qui peut affecter le recrutement des leucocytes d'accueil sur le site de l'infection ou peut permettre aux bactéries de se échapper de la vésicule otique. Il est également important de confirmer injection dans l'espace correcte. Si l'aiguille est insérée trop profond, il peut pointer à travers la vésicule otique ou il peut frapper les vaisseaux sanguins se écoulant autour de la vésicule otique. Cela peut conduire au dépôt de bactéries dans la circulation sanguine ou à l'extérieur de la vésicule, ce qui peut modifier les réponses de l'hôte.
Il est également possible que lorsque l'aiguille est extraite, certaines bactéries peuvent être déposés accidentellement en dehors de la vésicule otique comme indiqué par Colucci-Guyon et al. 28, mais nous avons trouvé que cela ne serait le cas en moins de 5% des injections. Essayer d'injecter dans le centre de la vésicule otique peut aider à éviter cette situation. Dans une infection réussie, la vésicule otique doit remplir wvec le colorant rouge de phénol, mais le colorant ne doit pas se échapper dans les tissus environnants. Toute larves de mal injecté doit être immédiatement éliminé. L'injection bactéries marquées est un moyen utile pour confirmer une injection réussie (figure 1B). L'un des inconvénients de l'utilisation d'un colorant CellTracker est que ce colorant sera dilué que les bactéries se divisent, éventuellement empêcher les bactéries d'être visualisés sous fluorescence. Nous avons choisi un colorant rouge parce que nous avons utilisé neutrophiles vert marqué et lignées transgéniques macrophages pour la majorité de nos études.
Dendra2 est une protéine dérivée de photoconvertible octocoraux Dendronephthya sp. qui peut être photoconverted du vert à un état rouge fluorescent avec un laser à 405 nm 29. Ce photoconversion est une façon non invasive pour marquer les cellules et de suivre leur sort au cours de l'infection. Leucocytes recrutés sur le site de l'infection peuvent être photoconverted et suivies au fil du temps pour surveiller leur dIFFUSION tout au long de tissus de l'hôte (Figure 3). Alternativement, les leucocytes pourraient être photoconverted avant l'infection, puis suivis post-microinjection pour déterminer l'origine des cellules recrutés sur le site de l'infection. Bactéries étiquetage et les cellules immunitaires permet pour l'étude des interactions leucocytes-pathogène in vivo y compris le recrutement et la phagocytose (figure 1B et Figure 2). Distinguer l'S. rouge marqué iniae de la fluorescence rouge d'un leucocyte photoconverted est difficile, si un autre colorant fluorescent CellTracker pourrait être utilisé. Cela serait particulièrement utile afin de déterminer laquelle des cellules immunitaires photoconverted qui quittent la vésicule otique contient S. iniae.
Les applications futures de la méthode d'infection de la vésicule otique pourraient inclure la mesure de la vitesse et la directionnalité de neutrophiles et les macrophages qui se déplacent en réponse à diverses infections. L'infection kinetics peut également être étudié pour voir quels types de cellules sont les premiers à arriver à un site d'infection et quels types de cellules sont le plus robuste recrutés en plus à l'endroit où les cellules proviennent ou où ils diffusent 30. En plus d'étudier le recrutement à une infection localisée initialement, ce modèle d'infection peut être utilisée pour étudier la fonction des hôtes composants du système immunitaire lors de l'infection initiale. Oligonucléotides antisens morpholino qui ciblent ARN spécifiques peuvent être utilisés pour faire tomber l'expression des composants immunitaires de l'hôte, y compris les récepteurs Toll-like récepteurs de cytokines, et les leucocytes, et CRISPR-Cas ou la technologie TALEN peuvent être utilisés pour créer des mutants génétiques. L'expression des gènes en utilisant RNAseq ou qPCR peut également être utilisée pour caractériser l'expression de certains gènes de l'hôte en réponse à l'infection.
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Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier les membres du laboratoire pour les soins de poisson zèbre et la maintenance. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health, National Service Award recherche A155397 à EA Harvie et NIH R01GM074827 à Anna Huttenlocher.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.7 ml Eppendorfs | MidSci | AVSS1700 | |
| 14 ml Falcon tube | BD Falcon | 352059 | |
| 27 G x ½ in. needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 96-well Plate | Corning Incorporated | 3596 | |
| Agar | BD Biosciences | 214030 | |
| CellTracker Red | Molecular Probes, Invitrogen | C34552 | |
| CNA agar | Dot Scientific, Inc | 7126A | |
| Disposable transfer pipets | Fisher Scientific | 13-711-7m | |
| Dissecting scope | Nikon | SMZ745 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Ethanol 200 proof | MDS | 2292 | |
| Fine tweezers | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| Gel comb | VWR | 27372-482 | 4.2 mm width, 1.5 mm thick |
| Glass bottom dishes | Custom made by drilling a 16 - 18 mm hole in the center of a 35 mm tissue culture dish bottom and placing a 22 mm round #1 coverslip in the hole and sealing with a thin layer of Norland Optical Adhesive 68 cured by UV light. | ||
| Glycerol | Fisher Scientific | G33-4 | |
| High melt agarose | Denville Scientific, Inc. | CA3510-6 | |
| Hydrogen peroxide | Fisher Scientific | H325 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | with FV-1000 system | |
| Low melt agarose | Fisher | BP165-25 | |
| Magnetic stand | Tritech (Narishige) | GJ-1 | |
| Microinjection system | Parker | Picospritzer III | |
| Microloader pipet tips | Eppendorf | 930001007 | |
| Micromanipulator | Tritech (Narishige) | M-152 | |
| Micropipette puller | Sutter Instrument Company | Flaming/Brown P-97 | |
| Nanodrop spectrophotmeter | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| N-Phenylthiourea (PTU) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Paraformaldheyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712 | 100 x 15 mm |
| Phenol | Sigma Aldrich | P-4557 | |
| Phenol Red | Ricca Chemoical Company | 572516 | |
| Phosphate buffered saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Potassium hydroxide | Sigma Aldrich | P-6310 | |
| Pronase | Roche | 165921 | |
| Protease peptone | Fluka Biochemika | 29185 | |
| Small cell culture dish | Corning Incorporated | 430165 | 35 x 10 mm |
| Sudan Black | Sigma Aldrich | S2380 | |
| Thin wall glass capillary injection needles | World Precision Instruments, Inc. | TW100-3 | |
| Todd Hewitt | Sigma Aldrich/Fluka Analytical | T1438 | |
| Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate) | Argent Chemical Laboratory/Finquel | C-FINQ-UE-100G | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Yeast extract | Fluka Biochemika | 92144 |
References
- Agnew, W., Barnes, A. C. Streptococcus iniae: An aquatic pathogen of global veterinary significance and a challenging candidate for reliable vaccination. Vet. Microbiol. 122 (1-2), 1-15 (2007).
- Danilova, N., Steiner, L. A. B cells develop in the zebrafish pancreas. Proc. Natl. Acad. Sci. 99, 13711-13716 (2002).
- Lam, S. H., Chua, H. L., Gong, Z., Lam, T. J., Sin, Y. M. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev. Comp. Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Willett, C. E., Cortes, A., Zuasti, A., Zapata, A. Early Hematopoiesis and Developing Lymphoid Organs in the Zebrafish. Dev. Dyn. 214, 323-336 (1999).
- Le Guyader, D., et al. Origins and unconventional behavior of neutrophils in developing zebrafish. Blood. 111 (1), 132-141 (2008).
- Herbomel, P., Thisse, B., Thisse, C. Ontogeny and behaviour of early macrophages in the zebrafish embryo. Development(Cambridge, England). 126 (17), 3735-3745 (1999).
- Neely, M. N., Pfeifer, J. D., Caparon, M. G. Streptococcus-Zebrafish Model of Bacterial Pathogenesis. Infect. Immun. 70 (7), 3904-3914 (2002).
- Jault, C., Pichon, L., Chluba, J. Toll-like receptor gene family and TIR-domain adapters in Danio rerio. Mol. Immunol. 40 (11), 759-771 (2004).
- Meijer, A. H., et al. Expression analysis of the Toll-like receptor and TIR domain adaptor families of zebrafish. Mol. immunol. 40 (11), 773-783 (2004).
- Seeger, A., Mayer, W. E., Klein, J. A Complement Factor B-Like cDNA clone from the Zebrafish (Brachydanio rerio). Mol. immunol. 33, 511-520 (1996).
- Hermann, A. C., Millard, P. J., Blake, S. L., Kim, C. H. Development of a respiratory burst assay using zebrafish kidneys and embryos. J. Immunol. Methods. 292 (1-2), 119-129 (2004).
- Yoo, S. K., Huttenlocher, A. Spatiotemporal photolabeling of neutrophil trafficking during inflammation in live zebrafish. J. Leukoc. Biol. 89 (5), 661-667 (2011).
- Benard, E. L., et al. Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens. J. Vis. Exp. , 1-9 (2012).
- Carvalho, R., et al. A High-Throughput Screen for Tuberculosis Progression. PLoS ONE. 6 (2), e16779 (2011).
- Veneman, W. J., Marín-Juez, R., et al. Establishment and Optimization of a High Throughput Setup to Study Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum Infection as a Model for Drug Discovery. J. Vis. Exp. (88), (2014).
- Deng, Q., Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Distinct signaling mechanisms mediate neutrophil attraction to bacterial infection and tissue injury. Cell. Microbiol. , (2012).
- Sar, A. M., et al. Zebrafish embryos as a model host for the real time analysis of Salmonella typhimurium infections. Cell. Microbiol. 5 (9), 601-611 (2003).
- Lin, A., Loughman, J. A., Zinselmeyer, B. H., Miller, M. J., Caparon, M. G. Streptolysin S Inhibits Neutrophil Recruitment during the Early Stages of Streptococcus pyogenes Infection. Infect. Immun. 77 (11), 5190-5201 (2009).
- Volhard, C., Dahm, R. Zebrafish: A Practical Approach. , Oxford University Press. New York, NY. (2002).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J. Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Haldi, M., Ton, C., Seng, W. L., McGrath, P. Human melanoma cells transplanted into zebrafish proliferate, migrate, produce melanin, form masses and stimulate angiogenesis in zebrafish. Angiogenesis. 9 (9), 139-151 (2006).
- Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
- Wiles, T. J., Bower, J. M., Redd, M. J., Mulvey, M. A. Use of Zebrafish to Probe the Divergent Virulence Potentials and Toxin Requirements of Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli. PLoS Pathog. 5 (12), e1000697 (2009).
- Harvie, E. A., Green, J. M., Neely, M. N., Huttenlocher, A. Innate Immune Response to Streptococcus iniae Infection in Zebrafish Larvae. Infect. Immun. 81 (1), 110-121 (2013).
- Haddon, C., Lewis, J. Early Ear Development in the Embryo of the Zebrafish, Danio rerio. J. Comp. Neurol. 365, 113-128 (1996).
- Whitfield, T. T., Riley, B. B., Chiang, M. -Y., Phillips, B. Development of the zebrafish inner ear. Dev. Dyn. 223 (4), 427-458 (2002).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J. Vis. Exp. (25), (2009).
- Colucci-Guyon, E., Tinevez, J. Y., Renshaw, S. A., Herbomel, P. Strategies of professional phagocytes in vivo: unlike macrophages, neutrophils engulf only surface-associated microbes. J. Cell Sci. 124 (18), 3053-3059 (2011).
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nat. Biotechnol. 24 (4), 461-465 (2006).
- Deng, Q., et al. Localized bacterial infection induces systemic activation of neutrophils through Cxcr2 signaling in zebrafish. J. Leukoc. Biol. 93 (5), 761-769 (2013).
