Summary
Her præsenterer vi en protokol til at studere invasionen af tumorceller i levende normale væv fragmenter i tre dimensioner. Denne organkultur teknik anvendes hovedsagelig til at teste potentielt anti-invasive lægemidler in vitro.
Abstract
Målet med chick hjerte-assayet er at tilbyde en relevant organkultur metode til at studere tumor invasion i tre dimensioner. Assayet kan skelne mellem invasive og ikke-invasive celler, og muliggør undersøgelse af virkningerne af testforbindelserne på tumor invasion. Kræftceller - enten som aggregater eller enkelte celler - konfronteres med fragmenter af embryonale chick hjerte. Efter organkultur i suspension i et par dage eller uger konfronterende kulturer fikseret og indlejret i paraffin for histologisk analyse. Det tredimensionale samspil mellem cancerceller og det normale væv derefter rekonstrueret fra serielle snit farvet med hematoxylin-eosin eller efter immunhistokemisk farvning for epitoper i hjertevævet eller står cancerceller. Assayet er i overensstemmelse med den seneste koncept, invasion kræft er resultatet af molekylære interaktioner mellem cancerceller og deres tilstødende stromale vært elementer (myofibroblaster, endothelial celler, ekstracellulære matrixkomponenter, etc.). Her er denne stromale miljø tilbydes cancercellerne som et levende væv fragment. Understøttende aspekter til relevansen af analysen er flere. Invasion i analysen er i overensstemmelse med kriterierne i invasion kræft: progressiv erhverv og udskiftning i tid og rum af værtens væv, og invasivitet og ikke-invasiv in vivo af de står over for celler generelt korrelerer med resultatet af analysen. Endvidere invasionen mønster af celler in vivo, som defineret af patologer, afspejles i de histologiske billeder i assayet. Kvantitative struktur-aktivitet relation (QSAR) analyse af de opnåede resultater med talrige potentielt anti-invasive organiske kongenermønstre forbindelser tillod undersøgelse af struktur-aktivitet relationer for flavonoider og chalconer og kendte anti-metastatiske lægemidler anvendt i klinikken (fx mikrotubulus inhibitorer ) inhiberer invasion i assayet samt. However, er analysen ikke hensyn til immunologiske bidrag til invasion kræft.
Introduction
Invasion er kendetegnende for maligne tumorer. Denne aktivitet ikke blot fører til ødelæggelse af omgivende væv, men er også impliceret i metastase-dannelse. Da kræftpatienter dør af invasion og metastase, og effektive anti-invasive behandlinger er stadig knappe, laboratorieanalyser, der efterligner invasion af tumorceller er blevet udviklet. Målet med chick hjerte-assayet er at tilbyde en relevant organkultur metode til at studere tumor invasion i tre dimensioner. Assayet kan skelne mellem invasive og ikke-invasive celler og gør det muligt at undersøge virkningerne af testforbindelserne på tumor invasion.
Rationalet bag brugen af analysen er selve begrebet, at tumorer er økosystemer, hvor de neoplastiske celler kontinuerligt interagerer med deres stroma (værtsceller og ekstracellulære matrix), og at gennem disse molekylære interaktioner invasion er finjusteret 1. Så i assayet tumorceller konfronteres med Living embryonale chick hjerte-fragmenter 2, der tjener ikke kun som substrater for invasion af tumorcellerne, men også som en kilde til forskellige typer af stromale celler og matrixelementer. Chick hjerte indeholder myocytter, fibroblaster og endotelceller, og den extracellulære matrix er sammensat af laminin, fibronectin og forskellige typer af collagen. På denne måde, det tredimensionale organkultur teknik omfatter mange cellulære og molekylære interaktioner impliceret i invasionen af patientens tumorer.
Den største fordel ved chick hjerte-assayet er gennemførelsen af stromale virkninger. Dette aspekt er mere komplet end i andre invasion assays in vitro, der er baseret på tumorcelleinvasion i ikke-levende geler sammensat af basalmembran 3 eller interstitiel matrix 4 molekyler. Begrebet konfrontation mellem tumorceller og normale levende vært væv som findes i orgel kultur eksperimenter er blevet indført af flereforfattere, herunder Wolff og Schneider i Frankrig 5, easty og easty i Det Forenede Kongerige 6, og Schleich i Tyskland 7. To tekniske fordele ved chick hjerte invasion assay over citerede metoder er, at mængden af fragmenterne let kan standardiseres, og at de forbliver kontraktile, som giver funktionelle integritet overvågning under organkultur. Endvidere er aviære embryoner foretrækkes, fordi de let kan udskæres fra den sterile indhold af ægget. Assayet har begrebsmæssige lighed med chick Chorioallantois membranassay 8 ved at tilbyde en kompleks stromal omkring til tumorcellerne.
Assayet har med succes været anvendt til at skelne mellem invasive og ikke-invasive celle-varianter af de samme humane tumorer såsom i MCF-7 (mamma) 9 og HCT-8 (colon) 10 cellelinje familier. Teknikken er nyttig til at teste potentielt anti-invasive forbindelser samt
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figur 1. Skematisk oversigt over de forskellige assay trin. Klik her for at se en større version af dette tal.
1. Fremstilling af fordyrket Heart Fragmenter (PHF'er)
- Inkuber et befrugtet æg chick ved 37 ° C i 9 dage. Fuldføre denne inkubation inden en dato, der tillader efterfølgende fremstilling af PHF'er i 4 dage (f.eks, på en torsdag), og endelige konfrontation med tumor celleaggregater (f.eks på reden mandag).
- Desinficere skallen med 70% (v / v) ethanol i vand. Udføre alle yderligere manipulationer i en vævskultur kabinet bruger sterile opløsninger og materialer. Åbn skallen på embryonale pol hjælp stumpe pincet.
- Træk fosteret ved holding halsen med en enucleation ske (figur 2). Placer embryo i et glas petriskål med en diameter på 5 cm indeholdende 5 ml Ringers saltopløsning.
- Åbne ventrale thorax hud ved at rippe åbne huden med en skarp pincet i begge hænder, fjern brystbenet af samme type manipulation og dissekere ud hjertet under anvendelse mikrodissektion iridectomy saks til at afbryde sin store blodkar. Udfør alle yderligere manipulationer under en makroskop med en kalibreret okular gitter.
Figur 2. Løft af embryo ud af ægget med en enucleation skeen. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Overfør hjertet til et glas petriskål meden diameter på 5 cm indeholdende 5 ml MEM-Rega 3 dyrkningsmedium med 5% føtalt bovint serum. Fjern forkamre og tilknyttede fartøjer ved resektion den øverste kranie tredjedel af hjertet ved hjælp mikrodissektions iridectomy saks. Dissekere pericardium fra ventriklerne med et par skarpe pincet.
- Lav en sagittal hemisektion i hjertekamrene hjælp mikrodissektion iridectomy saks, og fjern blodet ved forsigtigt at ryste med en skarp pincet.
- Overfør hjertekamrene i en anden glas petriskål med en diameter på 5 cm indeholdende 5 ml frisk MEM-Rega 3 dyrkningsmedium med 5% føtalt bovint serum. Skær hjertekamrene i stykker af ca. 0,4 mm i diameter ved hjælp af mikrodissektion iridectomy saks. Et hjerte kan give omkring 100 fragmenter.
Bemærk: Et hjerte kan give omkring 100 fragmenter - Drej petriskålen forsigtigt at køre alle ventrikulære fragmenter mod midten af fadet. Fjern alle corpora afhæn med en rustfri stål nål med septemberarating dem fra de ventrikulære fragmenter og køre dem mod periferien af petriskålen.
- Overfør hjertet fragmenter med en glas Pasteur-pipette til en 50 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 2 til 3 ml dyrkningsmedium (MEM-Rega 3 plus 10% v / v føtalt bovint serum).
Bemærk: Den nøjagtige medium volumen afhænger af de variable nederste konveksiteter af de enkelte kolber: centrum for deres bund skal være dækket af en tynd film af væske alene. - Gas kolben (r) med en blanding af 5% CO2 i luft via propperne, og inkuberes kolben (r) på en gyrotory ryster ved 37 ° C ved 70 omdrejninger / min (rpm) i 24 timer. Begrundelsen for denne suspensionskultur trin er at opnå sfæriske hjerte vævsfragmenter egnet til efterfølgende konfrontation med tumor celleaggregater.
- Overfør hjertet fragmenter og deres dyrkningsmedium til en petriskål. Kassér corpora afhæn, nekrotiske (mørke) fragmenter, og konglomerater af hjerte fragmenter med en nål.
- Inkubere de resterende hjerte fragmenter i en anden 50 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 6 ml dyrkningsmedium som beskrevet i trin 1.9 i yderligere 60 timer.
Bemærk: I løbet af denne inkubationsperiode, vil fragmenterne bliver sfæriske. De består af en kerne af myoblaster og et tyndt lag af fibroblastceller ved periferien. - Vælg sfæroide fragmenter der udviser et tyndt, homogent lag af fibroblastceller (danner en gennemskinnelig kapsel) og en diameter på 0,4 mm ved hjælp af en makroskop og nåle. En kylling hjerte vil give omkring 20 egnede PHF'er. Overføre disse PHF'er, hvoraf mange vil skaffe sig rytmisk ved 37 ° C, til en anden petriskål indeholdende frisk dyrkningsmedium. Disse PHF'er klar til konfrontation med test celler.
2. Forberedelse og Konfrontation kugleformede Test celleaggregater
- Forbered halvfast agarmedium: opløses 100 mg agar i 15 ml Ringers saltopløsning ved kogning tre gange. Coolsuspensionen til 40 ° C og tilsæt 7,5 ml Ringers saltopløsning / æggehvide (1: 1) og 7,5 ml føtalt bovint serum.
- Forbered 6 ml af en suspension indeholdende 1 x 10 5 test celler / ml i deres passende dyrkningsmedium i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe. Gøre dette 3 dage før starten af konfronterende kultur er planlagt. Inkubér kolben på en gyrotory ryster ved 37 ° C ved 70 opm i 3 dage. Gas kolberne med en blanding af 5% eller 10% (vol / vol) CO2 i luft, afhængigt af typen af anvendte dyrkningsmedium.
- Se aggregaterne under en makroskop udstyret med en kalibreret okular gitter. Vælg (med nål) kugleformet celleaggregater med en diameter på 0,2 mm.
- Brug en Pasteur-pipette for at overføre otte udvalgte PHF'er (diameter = 0,4 mm) i en minimal mængde af dyrkningsmedium til en embryologisk urglas indeholdende halvfast agar-medium 13. Flytte de enkelte PHF'er med en nål for at danne en cirkel. Aspirat overskydende mediumanvendelse af et lille stykke filtrerpapir (se figur 3).
Figur 3. Aspiration af overskydende væske omkring PHF'er. Otte PHF'er er placeret på halvfast agar i en embryologisk urglas, og flydende overskud fjernes med et lille trekantet stykke op filtrerpapir. Pile angiver de 8 individuelle PHF'er. Klik her for at se en større version af dette tal.
- Bringe ti udvalgte sfæroid celleaggregater (diameter = 0,2 mm) ind i cirklen under anvendelse af en Pasteur-pipette. Aspirere overskydende medium. Flytte en samlet mod hinanden af PHF med nålen, indtil de kommer i kontakt med hinanden. Aspirer overskydende medium ved anvendelse et lille stykke filtrerpapir.
- Forsegle låget på urglasset med paraffin og INCUBATE ved 37 ° C i 4 - 24 t, afhængigt af de klæbende egenskaber af testcellerne til PHF'er.
- Fordybe konfronterende par med foropvarmet (37 ° C) dyrkningsmedium, og overføre hvert enkelt par med en Pasteur-pipette til et 5 ml Erlenmeyer-kolbe indeholdende 1,5 ml dyrkningsmedium.
- Inkubere kolberne på en gyrotory rysteapparat ved 37 ° C indstillet til 120 omdrejninger pr. Gas kolberne med 5% eller 10% (vol / vol) CO2 i luft, afhængigt af typen af dyrkningsmedium, der anvendes til testcellerne (se figur 4).
- For at undgå koncentration af medierne, fugte gasserne ved at føre dem gennem to supplerende 5 ml Erlenmeyer-kolber fyldt med 2 ml Ringers saltopløsning. Opdatere dyrkningsmediet hver 8 dage.
Figur 4. Lille Erlenmeyerkolber på toppen af en gyrotory shak. ER Kolberne med 1,5 ml dyrkningsmedium forsegles med silikone propper udstyret med en gas i - og udløb nål, og flyttede ved 120 rpm ved 37 ° C. Gassen ledes af et indløb rør (1) til den større Erlenmeyer-kolbe (2) fyldt med sterilt Ringers saltopløsning, og yderligere fordelt (3 og 4) til mindre kolber indeholdende dyrkningsmedium med individuelle konfronterende par (5 og 6). Endelig er brugt gas opsamlet i en større kolbe med en steril vandlås (7), hvorfra den kan slippe ud i luften (8). Figuren viser to sæt af kultur batterier på toppen af en hjemmelavet platform plade. Klik her for at se en større version af dette tal.
3. Histologi af Confronting Cultures
- Forbered Bouin-Hollande s fiksering løsning.
- 2,5 g cupriacetat (neutral) i 100 ml enkelt-destilleret vand opløses ogtilsæt langsomt 4,0 g picrinsyre.
- Opløsningen filtreres gennem et papirfilter. Der tilsættes 10 ml formalin og 1 ml eddikesyre. Bland 9 dele af denne opløsning med 1 del af en mættet kviksølvchlorid opløsning i single-destilleret vand.
ADVARSEL: Denne løsning indeholder flere giftige stoffer. Formalin er giftig ved indånding, ved hudkontakt og ved indtagelse. Eddikesyre er ætsende for mund og tarmkanal efter indtagelse. Picrinsyre er allergifremkaldende og eksplosivt, når hurtigt opvarmet eller slagtøj. Mercurichlorid er stærkt ætsende på slimhinder og nefrotoxic. Bær beskyttelsesdragt og handsker til at forberede Bouin-Hollande løsning, og håndtere det i et godt ventileret område fjernt fra brand. En alternativ fiksering procedure er baseret på 4% formaldehyd i phosphatbufret saltvand.
- Fastsætte de enkelte kulturer efter flere dage eller uger inkubation som følger. Først overføres kulturerne til Ringers saltopløsning i et par sekunder for at fjerne serumproteiner. Dernæst fordybe i petriskåle med en diameter på 3 cm, der indeholder 3 ml Bouin-Hollande s fiksering løsning til ca. 2 timer.
- Skyl kulturerne tre gange i 3 ml demineraliseret vand før inkubere dem i vand i 2 timer for at fjerne så meget fiksering opløsning som muligt. Endelig overføres til 3 ml 70% (v / v) ethanol i vand. Hold kulturerne i denne løsning O / N, men dette kan forlænges med et antal dage.
- Dehydrere ved at overføre sekventielt gennem krukker indeholdende 100 ml 96% (v / v) ethanol i vand, 100% ethanol eller 100% isopropanol og 100% xylen i 2 timer hver.
- Overfør hver kultur til en separat dækglas (med en minimal mængde xylen), placere dækglasset på bunden af en vinflaske kapsel til paraffin embedding, og dække det faste materiale med flydende paraffin ved 56 ° C. Der inkuberes ved 56 ° C i 24 timer og derefter afkøle det indlejrede materiale til stuetemperatur.
ADVARSEL: Som benzenderivat xylen kan være giftige ved indånding og bør kun håndteres i godt ventilerede områder.
- Overfør hver kultur til en separat dækglas (med en minimal mængde xylen), placere dækglasset på bunden af en vinflaske kapsel til paraffin embedding, og dække det faste materiale med flydende paraffin ved 56 ° C. Der inkuberes ved 56 ° C i 24 timer og derefter afkøle det indlejrede materiale til stuetemperatur.
- Fjern vinflaske kapslen og dækglasset, og skåret ud paraffinblokken som indeholder den faste kultur.
- Gør 8 um tykke paraffinsnit af hele konfronterende pair under anvendelse af en mikrotom 14, og indsamle alle afsnittene om tre alternerende mikroskop objektglas, der er blevet forbehandlet med vævsklæberopløsning som et klæbemiddel. Undgå æggehvide som stikning agent, fordi det kan forstyrre immunfarvning.
Bemærk: Forbehandling af mikroskopet objektglas gøres ved at levere 1 lille dråbe vævsklæberopløsning og 3 små dråber demineraliseret vand med en Pasteur-pipette, og blande dem til at omfatte objektglasset. - Fjerne paraffinen fra det første lysbillede ved nedsænkning to gange i en beholder indeholdende 100 ml 100% xylen i 10 min.
- Rehydrere dias ved nedsænkning i 10 s ikrukker indeholdende 100 ml af følgende løsninger: xylen / ethanol (1: 1), 100% ethanol, 96% (v / v) ethanol i vand, 70% (v / v) ethanol i vand, og endelig demineraliseret vand.
- Opløs kviksølvchlorid krystaller ved nedsænkning i en beholder indeholdende 100 ml 0,5% (vægt / volumen) iod i 96% (v / v) ethanol i vand i 2 min.
- Rydde sektionerne i en beholder indeholdende 100 ml 5% (w / v) natriumthiosulfat i vand i 10 sek. Derefter vaskes objektglassene grundigt i destilleret vand.
- Glassene inkuberes i en beholder indeholdende 100 ml Harris 'hæmatoxylin i 2 minutter, nedsænkes kortvarigt i 0,1 M HCl, og vask derefter i rindende vand i 10 minutter.
- Inkuber i en beholder indeholdende 100 ml eosin 0,1% (w / v) i vand i 1 min.
- Dehydrere via kort nedsænkning i krukker indeholdende 100 ml af følgende serie af opløsninger: demineraliseret vand, 70% (v / v) ethanol, 96% (v / v) ethanol, 100% ethanol to gange, xylen-ethanol (1: 1) og endelig i 100% xylen.
- Monterdias med montering medium ved at levere 2 separate dråber af medium på dias, lad disse ekspandere ved at sætte et dækglas på toppen af dem, og lad det hærde ved stuetemperatur i 24 timer.
4. Immunohistokemi
- Forbered Tris-bufret saltvand (TBS). 6,0 g tris- (hydroxymethyl) aminomethan (Tris-base) og 45,0 g NaCl i 4,5 liter demineraliseret vand opløses. Bring til pH 7,6 med 1 M HCI (ca. 42 ml). Tilføj destilleret vand for at lave 5 L.
- Forbered Tris-HCI-buffer. 60 g Tris-base opløses i 800 ml demineraliseret vand. Bring til pH 7,6 med 6 M HCI (ca. 65 ml). Tilsæt destilleret vand til fremstilling af 1 L. Fortynd 10x med destilleret vand før brug.
- Forbered Tris-BSA 0,1% puffer. 12,1 g Tris-base og 45,0 g NaCl i 4,5 liter demineraliseret vand opløses. Bring til pH 8,2 med 1 M HCI (ca. 42 ml). Tilføje 5,0 g bovint serumalbumin (BSA) og 6,5 g NaN3. Tilføj demineraliseret vand til fremstilling 5 L.
ADVARSEL: NaN3 er en megettoksisk produkt. Kontakt med syre meget giftige gasser. Bær handsker og undgå indtagelse med alle midler. NaN3 formularer meget følsomme eksplosive forbindelser med kobber, bly og andre metaller. Skyl dræn med rigelige mængder vand. En alternativ konserveringsmiddel er 0,01% thiomersal. - Følg elementer 3,2-3,10.
- Dyp dias i TBS eller Tris-0,1% BSA buffer, og tør overskydende væske omkring afsnittene ved hjælp af en køkkenrulle.
- Påfør 150 pi normalt gede-serum fortyndet 1:20 i TBS eller i 5% (vægt / volumen) BSA i Tris-0,1% (vægt / volumen) BSA-puffer i 30 minutter i en high-fugtkammer (en lukket kasse for co -incubation af dias med en åben vand modtager sikrer høj luftfugtighed inde). Fjern derefter overskydende væske med en køkkenrulle.
- Påfør 150 pi primære antiserum fortyndet i Tris-0,1% (vægt / vol) BSA suppleret med 1% (vol / vol) normalt gedeserum i mindst 2 timer i en høj-fugtighedskammer. Bestemme den optimale fortynding af det primære antiserum empirimatisk.
Bemærk: Immunhistokemi kan anvendes til at påvise chick hjerte-antigener, men under anvendelse af specifikke antistoffer, kan teknikken beskrevet for chick hjerte antigener anvendes til andre antigener (såsom grønt fluorescerende protein) 15 samt. - Vaskes objektglassene to gange i Tris-0,1% vægt / volumen BSA på en vippende bord til 5-10 min.
- Fjerne overskydende væske ved hjælp af en køkkenrulle og anvende 150 ul gede-anti-kanin-antiserum i overskud (f.eks., 1:20 i TBS) i mindst 1 time i en høj-fugtighedskammer.
- Vaskes to gange med TBS på en rokkende bord til 5-10 min.
- Fjerne overskydende væske ved hjælp af en papirserviet. Påfør peroxidase-anti-peroxidase-kompleks fortyndet 1: 250 i TBS tilsat 1% (vol / vol) normalt gedeserum i mindst 1 time i et kammer med høj fugtighed. Fortyndingen af komplekset afhænger af batchen.
- Vaskes objektglassene med TBS og overførsel til Tris-HCI-buffer pH 7,6.
- Overfør dias i en Tris-HCI-buffer indeholdende 0,25 g / l af diaminobenzidin og 0,01% (vol / vol) H 2 O 2 i et par minutter. Stop inkubationen når chick hjertet farves. Kontrollér regelmæssigt under lup.
- Overfør objektglassene til Tris-HCI i 10 minutter og derefter til destilleret vand.
- Følg varer 3.13 og 3.14.
Bemærk: antigener, som er let ødelagt under fiksering, kan cryosectioning af kulturerne tilbyde et alternativ til immunhistokemisk analyse. Dette er beskrevet i den følgende protokol trin: - Vask de levende kulturer med 3 ml Ringers saltopløsning for at fjerne serumproteiner.
- Tilsæt en dråbe indlejringsmedium til kølet (-16 ° C) eksemplar indehaver af en cryomicrotome. Overføre det dyrkede væv fra kanten af et dækglas til toppen af dette fald før det er helt frosset.
- Køle kulturen til -16 ° C, skåret 6 um tykke frosne snit, og samle dem på gelatine-overtrukneobjektglas.
- Fastsætte objektglassene i acetone ved 4 ° C i 10 minutter før opbevaring ved 4 ° C.
- Følg varer 4,5-4,15.
5. Vurdering af analyseresultaterne
Bemærk: I den foreliggende assay invasion defineret som gradvis besættelse af PHF de står over testceller. Mikroskopisk analyse af alle på hinanden følgende sektioner fra en overfor kulturen tillader genopbygningen af samspillet mellem test celleaggregater og PHF'er i tre dimensioner.
- Overhold de forskellige mønstre af interaktion og karakter efter følgende skala (se figur 5).
Grad 0: Kun PHF observeret. Ingen står celler kan observeres.
Grade I: De står testceller er fastgjort til PHF, men optager ikke hjertet væv, ikke engang de yderste fibroblastiske cellelag.
Grade IIa: Stilling af PHF er begrænset til det ydre fibroblastlignende og myoblast cell lag.
Grade IIb: Den PHF har omgivet de celleaggregater, men der er ingen tegn på besættelse.
Grade III: De står celler har besat PHF, men har efterladt mere end halvdelen af det oprindelige beløb af hjerte væv intakt.
Grad IV: De står celler har besat mere end halvdelen af det oprindelige volumen af PHF.
Bemærk: kvaliteter I og II observeres med ikke-invasive cellepopulationer, mens kvaliteter III og IV er typiske for invasion. For at evaluere progression inden for forskellige tidsrammer, bør histologisk analyse anvendes på konfrontere kulturer faste efter forskellige inkubationsperioder.
Figur 5. Eksempler på samspillet mellem står kræftceller og PHF'er. Histologiske snit af konfrontere kulturer farvet enten med hematoxylin-eosin (venstre paneler) eller immunohistochemically med et antistof mod chick heart (højre paneler). Interaktion kvaliteter er defineret i protokollen tekst. (H: hjertevæv, T: tumorceller). Klik her for at se en større version af dette tal.
6. Toksicitet Assessment efter Drug Behandlinger
- Overfør står kulturer i et minimalt volumen til 24 brønds vævsdyrkningsplader multiskåle med en Pasteur-pipette.
- Vask kulturerne ved at tilsætte 500 pi stoffri dyrkningsmedium, og opdatere efter 6 timer.
- Inspicere alle brønde dagligt for celleudgroning fra eksplantaterne under anvendelse af et omvendt mikroskop (objektivlinse 40X). Dividere antallet af outgrowing kulturer med det samlede antal eksplanterede kulturer for at opnå et indeks af overlevelse af de står over kulturer. Sammenligne resultaterne af lægemiddelbehandlede kulturer med opløsningsmidler behandlede dem.
Bemærk: Brugen af Ki67 immunhistokemisk (for celle spredningsrelateredebejde) og TUNEL assay (for apoptose) er foreslået som komplementære teknikker til eksplantatet analysen for vurdering af toksicitet.
7. Vækst Vurdering at konfrontere Cultures
- Foretag sort-hvide fotografier af kulturerne lige før fiksering, ved hjælp af et mikroskop udstyret med en digital photocamera (objektiv 50X)
- Mål i mm større (a) og mindre (b) diameter af kulturen under hensyntagen til forstørrelse.
- Beregn den omtrentlige volumen (V) i mm 3 via formlen 16
- V = 0,4 xaxb 2
- Beregn væksten af kulturen ved at sammenligne denne slutvolumen med de kombinerede mængder af PHF og celleaggregat i starten af konfrontation.
Bemærk: Da ensomme PHF'er tendens til at formindske deres volumen under dyrkning, vækst står parrene er afhængig af tumorcellerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De histologiske sektioner som vist i figur 5 viser det endelige resultat af en række succesfulde assays. Lyden histologi af kulturerne indikerer levedygtige celler og tillader at fortolke interaktionen mellem tumorceller og normale væv. Endvidere kan iagttages nogen immunreaktion fra det normale væv, hvilket bekræfter den korrekte alder kyllingefostre anvendt f.eks før immunafstødning systemet udvikles. Der er ingen bakterier, synlige, hvilket indikerer fravær af (brutto) kontaminering under kultur periode. Endelig afrundede periferien af sektionerne bekræfter kultur i suspension uden tegn på (midlertidig) tilslutning til Erlenmeyerkolbe væg.
Mange forbindelser er blevet testet i assayet. Lægemidler leveres som regel til dyrkningsmediet på det tidspunkt, hvor de står over for PHF / tumor aggregerede par er overført til små Erlenmeyerkolber (trin 2.7). Nogle blev brugt som redskaber (kendt iantistofreaktion og aktivatorer) at udrede veje og effektormolekyler impliceret i processen af tumor invasion. For andre forbindelser, som var strukturelt beslægtede, blev en kvantitativ struktur-aktivitet relationer (QSAR) oprettet på grundlag af resultaterne af chick hjerte invasion assay. Så for beslægtede polyphenoler blev anvendt en række beregningsmæssige deskriptorer at muliggøre forudsigelse af deres anti-invasiv aktivitet i assayet. Over en periode på 15 år 139 forskellige analoger blev testet for deres mulige anti-invasive virkninger i analysen, og deres aktiviteter blev inddelt i 4 klasser. En uddannelse og en validering sæt bestående af 93 og 46 af disse polyphenoler henholdsvis blev tilfældigt udvalgt. Ved hjælp af en QSAR neurale netværk resultaterne af valideringen sættet viste en klar korrelation mellem forudsagte og eksperimentelle anti-invasive aktiviteter 17 (se figur 6).
Dataene viser robusthed the chick hjerte invasion assay, da sammenhængen mellem forudsagte og eksperimentelle resultater var gyldig over 15 år, og bekræftet i en nylig (upubliceret) forudsigelse studie med forskellige polyphenoler. Usikkerhedsmatrixen præsenteret i figur 6 opsummerer svaghed og styrken af assayet grafisk: det giver et groft udtryk for nøjagtighed og reproducerbarhed. Fortolkningen af denne graf bør tage hensyn til den biologiske variabilitet af levende organkulturer, og semikvantitativ score på invasionen resultater.
Figur 6. Ekstern validering af en prædiktiv QSAR model (kunstigt neuralt netværk) for aktiviteten af små molekyler i chick hjerte invasion assay. Resultatet af denne model er den anti-invasiv aktivitet klasse af en forbindelse. Der er defineret fire sådanne klasser, Representing den laveste koncentration, ved hvilken et molekyle har en anti-invasiv aktivitet (dvs. invasion grad I eller II) i CHI-assay: klasse 4 (aktiv ned til 1 uM), klasse 3 (10 uM), klasse 2 (100 uM) og klasse 1 (ingen anti-invasiv aktivitet ved koncentrationer så høje som 100 uM). Den afbildede forvirring matrix sammenligner forudsagt og eksperimentelt bestemt anti-invasive aktivitet klasser for forbindelserne valideringen sæt. Validering sæt indeholder 46 stoffer, uddannelse sæt 93. Model forudsigelser er udelukkende på deskriptorer beregnet ud fra molekylstruktur baseret, og kan således opnås for hypotetiske forbindelser. På denne måde kan syntetiske indsats være fokuseret på molekyler med lovende i silico aktivitet. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Under forberedelsen af PHF'er kan fragmenterne ikke ophold i suspension, men holde sig til karvæggen; dette kan overvindes ved forøgelse af volumenet af dyrkningsmediet. Hvis antallet af PHF'er er for lavt, og deres størrelse er for stor, sænke lydstyrken af dyrkningsmediet. Svigt i testcellerne at aggregere kan skyldes udsving i temperatur eller til mikrobiel infektion. Alternativt kan en manglende evne til at aggregere som en iboende egenskab af cellerne. Under fastgørelse af aggregaterne til PHF, kan dårlig vedhæftning overvindes ved at forlænge inkubationsperioden oven på halvfast agar-medium eller ved at fjerne mere væske dyrkningsmedium rundt kulturerne ved hjælp af absorberende filtrerpapir. Check også for mikrobiel kontaminering i dette tilfælde. Vanskeligheder under sektionering kan skyldes nedbrydning af de paraffinblokke: Dette sker, når opbevaringsperioden af blokkene har været for længe (smelte paraffin igen). Når sektionering kunstifacts forekomme, integriteten af mikrotomen kniv og fravær af corpora afhæn i de faste kulturer bør kontrolleres. Nekrotiske områder i kulturer er tegn på dårlige dyrkningsbetingelser. Hvis disse områder er begrænset til centrum af kulturerne, bør man formoder volumen konfrontationerne bliver for stor. Korrekt udvælgelse af de mængder af PHF og celleaggregater er faktisk en kritisk faktor. Men mere generaliseret nekrose point mod uhensigtsmæssig pH-kontrol, mikrobiel forurening eller fiksering artefakter. Endelig, når sektionerne vises for mørkt, kan nedsænkning periode i hæmatoxylin være for lang, eller sektioner kan være for tyk (> 8 pm).
Mange variationer på chick hjerte assay er blevet anvendt med succes i invasion studier. Disse variationer vedrører oprindelsen af værtsvævet, præsentationen af de står over testcellerne, og inkubationsbetingelserne. Heart fragmenter fra arterbortset chick 18, og fra væv såsom lever 19, lunge 20, og hjerne 21, er blevet undersøgt. I stedet for aggregater, biopsiprøver 22 monolag fragmenter 23, og cellesuspensioner er blevet anvendt til at konfrontere med PHF i organkultur. Suspensionskulturer er undertiden erstattet af statiske kulturer på toppen af en halvfast underlag 24, og serumfrie konfrontationer er blevet vist at være muligt med visse typer af celler 25. Generelt er interaktionen beskrevet i overensstemmelse med en semi kvantitativ skala 26 har dog computer-assisteret automatiseret billedanalyse systemer også blevet udviklet 27,28. Sidstnævnte formål at give kvantitative oplysninger om omfanget af tumor celle invasion.
Som chick hjerte assayet indbefatter en levende vært væv, opsætningen forsøger at rekapitulere situationen in vivo, og klart er af nogen relevans i forhold til other systemer in vitro (se indledning afsnit). Det bør imidlertid erkendes, at assayet ikke omfatte alle de elementer i microecosystem stede i naturlige tumorer, miljøer hvor f.eks immunologiske faktorer kan påvirke den invasive opførsel af kræftcellerne. I mindst én undersøgelse, har fraværet af sådanne faktorer i analysen ført til modstridende resultater mellem resultaterne af chick hjerte assay 29 og de en dyremodel 30.
En fremtidig anvendelse vil være studiet af cardiomyocyte progenitorceller i assayet. Disse celler kan injiceres terapeutisk i infarkt zoner af hjertepatienter, men de bør være i stand til at integrere i myokardiet. I chick hjerte analysen progenitorcellerne vil blive konfronteret med chick hjerte fragmenter, og deres migration og differentiering vil blive analyseret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ringer's salt solution | Braun | CEO123 | |
| Bacto-agar | Becton Dickinson | 214010 | |
| Tris-(hydroxymethyl)-aminomethaan Analar | VWR | 103157P | |
| BSA : albumin from bovine serum, cohn V fract. | Sigma | A4503-500G | |
| MEM-Rega 3 | Life Technologies | 19993013 | |
| Gyrotory shakers | New Brunswick Scientific | G10 and G33 | |
| Erlenmeyer flasks 50 ml | Novolab | 92717 | |
| Glass Petri dishes | Novolab | 68516 | |
| Iridectomy scissors | Rumex | 11-0625 | |
| Macroscope with calibrated ocular grid | Wild | 157702 | |
| Paraffin wax | International Medical products | 8599956 | |
| Eosin Y | Sigma | 230251-25g | |
| Harris' hematoxylin | Sigma | HHS32-1L | |
| Coverslipping resin (Tissue-Tek) | Sakura | 4494 | |
| Paraffin melting apparatus | GFL | 1052 | |
| Microtome for paraffin sectioning | Reichert | ||
| Stppers for Erlemeyer flasks with gas in- and outlets | Novolab | 2602421 and 260243 | |
| Diaminobenzidine | Sigma | D8001 | |
| REAX rocking table | Heidolph | 54131 | |
| 24-well tissue dishes | VWR | NUNC142475 | |
| Ophtalmological enucleation spoon | Rumex | 16-060 | |
| Sharp forceps | Rumex | 4-111T | |
| Blunt forceps | Nickel-Electro LTD | 7112 | |
| Erlenmeyer flasks 5 ml | Novolab | 211901 | |
| Microscope slides washed and degreased | International Medical products | 8613908 |
References
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Van Roy, F. M., de Baetselier, P. Molecular mechanisms of cancer invasion. Encyclopedia of Cancer. JR, B. ertino 2, Academic Press. San Diego. 1072-1083 (1997).
- Mareel, M., Kint, J., Meyvisch, C. Methods of study of the invasion of malignant C3H mouse fibroblasts into embryonic chick heart in vitro. Virchows Arch. B. Cell Pathol. Incl. Mol. Pathol. 30 (1), 95-111 (1979).
- Albini, A., Noonan, D. M. The ‘chemoinvasion’ assay, 25 years and still going strong: the use of reconstituted basement membranes to study cell invasion and angiogenesis. Curr. Opin. Cell Biol. 22 (5), 677-689 (2010).
- De Wever, O., et al. Single cell and spheroid collagen type I invasion assay. Methods Mol. Biol. 1070, 12-35 (2014).
- Wolff, E., Schneider, N. La transplantation prolongée d’un sarcome de souris sur des organes embryonnaires de poulet cultivés in vitro. C.R. Seances Soc. Biol. Fil. 151 (7), 1291-1292 (1957).
- Easty, G. C., Easty, D. M. An organ culture system for the examination of tumor invasion. Nature. 199, 1104-1105 (1963).
- Schleich, A. B., Frick, M., Mayer, A. Patterns of invasive growth in vitro. Human decidua graviditatis confronted with established human cell lines and primary human explants. J. Natl. Cancer Inst. 56 (2), 221-237 (1976).
- Sys, G. M. L., et al. The In ovo CAM-assay as a Xenograftodel for Sarcoma. J. Vis. Exp. (77), e50522 (2013).
- Bracke, M. E., Van Larebeke, N. A., Vyncke, B. M., Mareel, M. M. Retinoic acid modulates both invasion and plasma membrane ruffling of MCF-7 human mammary carcinoma cells in vitro. Br. J. Cancer. 63 (6), 867-872 (1991).
- Vermeulen, S. J., et al. Transition from the noninvasive to the invasive phenotype and loss of alpha-catenin in human colon cancer cells. Cancer Res. 55 (20), 4722-4728 (1995).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of 3,7-dimethoxyflavone in vitro. J. Pharma. Sci. 83 (9), 1217-1221 (1994).
- Parmar, V. S., et al. Anti-invasive activity of alkaloids and polyphenolics in vitro. Bioorg. Med. Chem. 5 (8), 1609-1619 (1997).
- Gaillard, P. J. Organ culture technique using embryologic watch glasses. Methods in Medical Research. MB, V. isser 2, Year Book Publishers. Chicago. 241-24 (1951).
- Romeis, B. Das mikrotom. Mikroskopische Technik. 15 Verb. Aufl. Kapitel. 7, München: Leibniz. 114-120 (1948).
- Van Marck, V., et al. P-cadherin promotes cell-cell adhesion and counteracts invasion in human melanoma. Cancer Res. 65 (19), 8774-8783 (2005).
- Attia, M. A., Weiss, D. W. Immunology of spontaneous mammary carcinomas in mice. V. Acquired tumor resistance and enhancement in strain A mice infected with mammary tumor virus. Cancer Res. 26 (8), 1787-1800 (1966).
- Katritzky, A. R., et al. QSAR modeling of anti-invasive activity of organic compounds using structural descriptors. Bioorg. Med. Chem. 14 (20), 6933-6939 (2006).
- McKinnell, R. G., Bruyneel, E. A., Mareel, M. M., Seppanen, E. D., Mekala, P. R. Invasion in vitro by explants of Lucke renal carcinoma cocultered with normal tissue is temperature dependent. Clin. Exp. Metastasis. 4 (4), 237-243 (1986).
- Wanson, J. C., de Ridder, L., Mosselmans, R. Invasion of hyperplastic nodule cells from diethylnitrosamine treated cells. Cancer Res. 41 (12 Pt 1), 5162-5175 (1981).
- Mareel, M. M., et al. Effect of temperature on invasion of MO4 mouse fibrosarcoma cells in organ culture. Clin. Exp. Metastasis. 2 (2), 107-125 (1984).
- Laerum, O. D., Steinsvag, S., Bjerkvig, R. Cell and tissue culture of the central nervous system: recent developments and current applications. Acta Neurol. Scand. 72 (6), 529-549 (1985).
- Schroyens, W., Mareel, M. M., Dragonetti, C. In vitro invasiveness of human bladder cancer from cell lines and biopsy specimens. Clin. Exp. Metastasis. 1 (2), 153-162 (1983).
- Mareel, M. M., De Bruyne, G. K., Vandesande, F., Dragonetti, C. Immunohistochemical study of embryonic chick heart invaded by malignant cells in three dimensional culture. Invasion Metastasis. 1 (3), 195-204 (1981).
- Bjerkvig, R., Laerum, O. D., Mella, O. Glioma cell interactions with fetal rat brain aggregates in vitro and with brain tissue in vivo. Cancer Res. 46 (8), 4071-4079 (1986).
- Bracke, M. E., et al. Confrontation of an invasive (MO4) and a non-invasive (MDCK) cell line with embryonic chick heart fragments in serum-free culture media. In Vitro Cell Dev. Biol. 22 (9), 508-514 (1986).
- Mareel, M. M., Bracke, M. E., Storme, G. A. Mechanisms of tumor spread: a brief overview. Cancer Campaign. 9: The Cancer Patient. Grundmann, E. , Gustav Fisher Verlag. Stuttgart and New York. 59-64 (1985).
- De Neve, W. J., Storme, G. A., De Bruyne, G. K., Mareel, M. M. An image analysis system for the quantification of invasion in vitro. Clin. Exp. Metast. 3 (2), 87-101 (1985).
- Smolle, J., et al. Quantitative evaluation of melanoma cell invasion in three-dimensional confrontation cultures in vitro using automated image analysis. J. Invest. Dermatol. 94 (1), 114-119 (1990).
- Bracke, M. E., et al. flavonoid effect on tumor invasion and metastasis. Food Technol. 48 (11), 121-124 (1994).
- Bracke, M. E., et al. The influence of tangeretin on tamoxifen’s therapeutic benefit in mammary cancer. J. Natl. Cancer Inst. 91 (4), 354-359 (1999).
