Abstract
Examen histologique des biopsies musculaires a servi comme un outil indispensable dans la compréhension du développement et la progression de la pathologie des troubles neuromusculaires. Toutefois, afin de le faire, des soins appropriés doivent être prises lorsque l'excision et la préservation de tissus pour obtenir une coloration optimale. Une méthode de préservation des tissus consiste à fixer les tissus en formaldéhyde, puis les incorporer à la cire de paraffine. Cette méthode préserve la morphologie bien et permet le stockage à long terme à température ambiante, mais est lourde et nécessite une manipulation de produits chimiques toxiques. En outre, des résultats formaldéhyde de fixation à l'antigène reticulation, ce qui nécessite des protocoles d'extraction d'antigène efficace pour immunocoloration. Au contraire, le sectionnement congelé ne nécessite pas de fixation et conserve ainsi biologique antigène conformation. Cette méthode fournit également un avantage distinct à son tour rapide autour du temps, ce qui rend particulièrement utile dans les situations nécessitant une évaluation histologique rapide comme intraoperative biopsies chirurgicales. Ici, nous décrivons la méthode la plus efficace de préparer des biopsies musculaires pour la visualisation avec différents colorants histologiques et immunologiques.
Introduction
L'examen de l'histologie des muscles joue un rôle critique dans la compréhension des différents types de troubles neuromusculaires 4.1. Lorsqu'il est combiné avec d'autres techniques, il permet aux chercheurs d'obtenir une meilleure idée de la manifestation et de la progression de la pathologie et peuvent aussi être essentiel pour évaluer l'efficacité d'une intervention thérapeutique 5-10. Toutefois, pour être précis, les tissus doivent être préservées de la manière appropriée afin de préserver immédiatement l'état physiologique avant l'excision. Cela exige un grand soin lors de l'enlèvement, de la préservation, de sectionnement et coloration.
Les tissus peuvent être préparés de deux façons différentes pour étude au microscope optique. La première méthode, fixés au formol (FFPE) paraffine sections, embarqué nécessite tissus à fixer dans les 10% de formaldéhyde tamponnée naturelle avant d'être intégré avec la cire de paraffine 11,12. L'étape de fixation permet de préserver la morphologie mieux, mais aussi des liens croisés pr endogèneoteins nécessitant ainsi des procédures de récupération d'antigène complexe pour un marquage et d'éliminer la possibilité de coloration enzymatique sur ces articles 12. Coupes congelées, d'autre part, ne doivent pas être pré-fixe ou traitées; par conséquent, les protéines sont capables de retenir des conformations natives 13,14 biologiques. En outre, des coupes congelées permettent également un gain de temps, ce qui est parfois nécessaire, par exemple dans le diagnostic peropératoire de sarcomes et autres biopsies chirurgicales 15. Toutefois, si ne pas fait correctement, cette méthode est sujette à des dommages par congélation, qui apporte des modifications à l'architecture musculaire rendant les sections impropres à l'examen histologique. Ce document décrit la méthode la plus efficace pour préparer des biopsies musculaires afin de parvenir à coloration optimale pour examen approprié.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Tissue récolte et de congélation des tissus musculaires
- Euthanasier la souris avec une dose excessive de l'isoflurane (2-chloro-2- (difluorométhoxy) -1,1,1-trifluoro-éthane). Effectuez cette étape dans une hotte et utiliser une méthode de confinement secondaire comme un dessiccateur ou une cloche de verre contenant un coton-tige imbibé d'isoflurane.
- Confirmer la mort en serrant fermement coussinet plantaire. Utilisez une méthode secondaire de l'euthanasie telle que la dislocation cervicale.
- Mouiller la fourrure avec 70% d'alcool pour réduire le collage des mèches de cheveux en vrac sur les muscles. Peler la peau du membre en utilisant une pince fine tels que # 5.
- Séparez délicatement le muscle d'intérêt (jambier antérieur (TA) dans ce cas) à partir des os en dessous, à partir du tendon et à enlever.
- Exciser le muscle, le couvrir dans l'OCT (coupe optimale du composé Température), et posez-le à plat sur un moule de congélation jetable marqué. Assurez-vous que le muscle est à son orientation physiologique normal (tête tail) sans étirement. Alternativement, geler le muscle sur des petits carrés de mousse de polystyrène et l'épingler en utilisant des épingles insectes pour assurer la bonne longueur des muscles.
- Réfrigérer 2-méthylbutane (isopentane) dans un bêcher en acier avec de l'azote liquide. Cela prend en moyenne de 3 - 5 min. Gardez en remuant de façon intermittente jusqu'à précipités blancs commencent à se former sur le fond et les parois du bécher.
REMARQUE: Lorsque cela se produit, l'isopentane a atteint la température de congélation optimale (-150 ° C) - Trempez les moules contenant muscles dans le réfrigérée 2-méthylbutane. Congeler petits muscles comme le muscle long extenseur des orteils diaphragme et (EDL) pour les 6 - 12 sec et gros muscles comme le soléaire gastrocnémien (GS) et les triceps pour 15 - 20 sec. Ne pas congeler les muscles trop longtemps car cela pourrait conduire à la fissuration.
- Transférer les tissus congelés sur de la glace sèche et laissez évaporer isopentane (à noter que ce processus prend en moyenne environ 15 - 20 min). Envelopper les tissus dans du papier aluminium et les stocker à ultra basse température (-70 ° C à -80 ° C) jusqu'à ce que le sectionnement.
2. Intégrer les tissus dans PTOM Préparer bloc de tissu
- tissus de transport sur la glace sèche pour cyrostat pour éviter la décongélation. tissu Transfert à cryostat chambre (mis à -20 à -24 ° C pour éviter la décongélation complète des tissus) et les laisser équilibrer pendant 30 min.
- Tournez la baie de refroidissement Peltier sur. Si le cryostat ne possède pas ce refroidissement, utiliser un aérosol de refroidissement pour congeler rapidement les PTOM. Ne laissez pas le dégel musculaire à tout moment au cours de l'incorporation car cela peut entraîner des dommages dus au gel.
- Ajouter une couche mince et uniforme de l'OCT sur le disque de l'échantillon et le laisser refroidir. Lorsque la plupart des PTOM est gelé sur le fond tout en liquide sur le dessus, insérez le tissu à l'orientation correcte (perpendiculaire PTOM pour les sections transversales et parallèles PTOM pour les sections longitudinales). Utilisez un aérosol de refroidissement pour congeler rapidement octobre Touchez la partie unembeded du tissu avec poste de chaleurractor et attendre 45 sec.
- Ajoutez une autre couche mince de l'OCT autour du muscle, vaporiser avec un aérosol de refroidissement et d'extraire la chaleur comme dans l'étape précédente.
- Continuez à ajouter des PTOM petits incréments et rapidement geler les PTOM en utilisant une combinaison d'aérosol et d'un extracteur de chaleur de refroidissement jusqu'à ce que le muscle entier est couvert.
- Mettre l'extracteur de chaleur sur le dessus du bloc de tissu et attendre 5 min.
3. Préparer Sections et identifier les sections à partir de mi-ventre Région des Muscles
- Placer le spécimen sur la tête de l'objet. Serrez la molette pour fixer le disque. Assurez-vous que la platine est en bon contact avec la tête de l'objet.
- Réglez la température de la chambre à entre -21 et -24 ° C et attendre jusqu'à ce que la température de consigne est atteint.
- Réglez les paramètres d'épaisseur (7 pm); couper le bloc en avançant ou en rétractant le bloc en utilisant les réglages grossiers et fins.
- Recueillir les sectionspréchauffée sur des lames de microscope chargées positivement en appuyant sur la partie supérieure de la glissière sur les sections, en utilisant l'attraction entre les charges opposées pour faciliter l'adhérence des sections de coupe de la lame.
- Identifier les sections à mi-ventre par mesure de surface en coupe transversale (CSA) des sections. Pour ce faire, le logiciel d'imagerie à l'aide de l'ordinateur qui est connecté au microscope.
REMARQUE: des images à contraste de phase sont prises et la circonférence de l'ensemble du muscle est mesurée via une fonction de traçage sur le logiciel. Cela donnera à la fois la CSA ainsi que diamètre minimum de furet (mesure des fibres taille transversale qui est exprimé comme la plus petite distance entre deux tangentes parallèles sur les côtés opposés d'une particule) mesures. Remarque: Lors de la CSA et de diamètre de furet minimum mesures commencent à plateau, mi ventre a été atteint. - Inventaire et archiver les diapositives à -80 ° C pour la coloration avenir.
REMARQUE: octobre n'a pas besoin d'être enlevé avant staininprocédures de g. Lorsque les lames sont sous une lamelle, ils sont prêts à être colorées immédiatement.
4. Coloration
REMARQUE: Bien que les procédures détaillées étape par étape peuvent être trouvés sur la feuille de données du produit et doivent être suivies pour les procédures de coloration, l'optimisation personnelle peut être nécessaire pour obtenir une coloration optimale.
- Parce que les médias de montage (voir tableau) est non miscible à l'eau, déshydrater diapositives en augmentant les qualités d'alcool (2 min chacun à 70%, 95% et 100% d'éthanol) et les effacer avec du xylène (100% pendant 5 min) pour assurer diapositives ne deviennent pas opaque au fil du temps.
- Lamelle sections et les laisser sécher. Image avec microscope équipé d'un logiciel d'imagerie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La mise en place pour la récolte et la congélation des tissus peut être vu sur la figure 1. Tissus excisés doivent être stockés sur une gaze trempée dans du PBS afin d'éviter le séchage (figure 1A). Lorsque les tissus sont sélectionnés pour être utilisé pour l'analyse histologique, ils devraient être trempés dans de l'OCT et disposés sur cryo moule dans le bon sens et que près de la longueur physiologique que possible pour assurer la morphologie précise (figure 1B). Suspension de l'isopentane approprié pour la congélation de tissu peut être obtenue par refroidissement isopentane dans l'azote liquide et remuer jusqu'à ce que les petits précipités blancs apparaissent en bas. À ce stade, le média est adapté à la congélation (figure 1C). Les tissus doivent être congelés 6-15 sec dans de l'isopentane refroidi en fonction de la taille / épaisseur du tissu (figure 1D). Après la congélation, le muscle apparaîtra blanc crayeux à quel point il doit être stocké sur de la glace sèche et transféré plus tard à -80 <strong> ° C congélateur.
Cryostat réglage et les ingrédients nécessaires à la préparation du bloc de muscle par enrobage graduellement le tissu en octobre sont présentés sur la figure 2. Le cryostat doit être réglé entre -20 et -24 ° C (Figure 2A). PTOM et Gel-Il devraient être facilement disponibles pour créer le bloc adapté pour la coupe. A l'intérieur du cryostat devrait avoir de petites brosses à manipuler et aplatir sections coupées pour la diapositive de décision ainsi que des pinces pour la manipulation de bloc de tissu, car il ne devrait jamais être touché avec les mains pour assurer le tissu reste congelé (figure 2B). Octobre devrait être ajouté au tissu pour créer le bloc de sectionnement mais devrait être immédiatement congelé Freeze-Il pulvérisation et ensuite encore refroidi avec de la chaleur-extracteur représenté ici (figure 2C). Pour les sections transversales, le tissu doit être placé sur la tête de l'objet afin qu'il soit orienté perpendiculairement à la lame (Figure 2D). Seraccords doivent être ajustées pour obtenir l'épaisseur de la section désirée (5-10 pm en fonction du tissu).
Si gelé correctement le visage de tissu doit être blanc crayeux tout un tissu qui a été gelé de façon abusive ou décongelé pendant le processus de montage apparaît rouge / rose. La figure 3 montre tissus représentatifs pour les échantillons manipulés de manière inadéquate (figure 3A) et échantillons manipulés correctement (figure 3B) .
La région du ventre mi est déterminée en mesurant la CSA et le diamètre de furet minimum en utilisant un microscope équipé d'une optique à contraste de phase et des logiciels d'analyse d'images. Est représentée Une capture d'écran représentant du logiciel d'analyse de la figure 4. Hématoxyline et l'éosine images colorées d'une biopsie correctement congelés et sectionnés avec une biopsie endommagé de gel des jambier antérieur (TA) muscles sont présentés dans la figure 5. Les articles qui sont correctement transformés aura morpholo cohérentegy et même tout au long de la coloration (figure 5A). Incorrectement traitée muscles qui sont endommagés ou gel prématurément décongelé apparaîtra d'avoir plusieurs pauses dans la morphologie et avoir l'aspect de «blé déchiqueté" (figure 5B). La figure 6 montre la chambre humidifié pour immunocoloration optimale. Les lames doivent être couverts avec du parafilm, maintenue sur une serviette en papier humide, et scellé dans une petite boîte pour éviter le séchage des sections pendant immunocoloration. La figure 7 illustre une lame de immunohistochimie de l'échantillon qui a été bien préparé et colorées.
Figure 1. Préparation et mis en place pour la congélation de tissu propre. (A) excisée tissus doivent être stockés sur de la gaze trempé dans PBS. (B) Les tissus selectedfor histologiqueanalyse plongé dans de l'OCT et la posa sur cryo moule dans le bon sens (du ventre au tendon) et aussi près que possible la longueur physiologique. (C) Lisier d'isopentane appropriée pour le tissu. Remarque: petits précipités blancs apparaissent en bas. (D) de tissu congelé après trempage dans de l'isopentane. Note:. Aspect blanc crayeux S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. paramètres cryostat et les ingrédients nécessaires pour la coupe. (A) Cryostat réglée entre -20 et -24 ° C avec des PTOM et aérosol de refroidissement disponibles. (B) à l'intérieur du cryostat configuration complète avec de petits pinceaux à manipuler et à aplatir secti coupéesons pour la diapositive de décision ainsi que des pinces pour la manipulation de bloc de tissu. (C) bloc de tissu congelé prêt à être refroidi avec extracteur de chaleur (flèche blanche). Bloc (D) de tissus mis sur la tête prête à être coupée de montage. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. tissus représentatifs de muscles correctement et incorrectement conservés. (A) mal congelé ou manipulé (B) correctement congelé et manipulés musculaire. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. Détermination de la zone de section transversale de TA musculaire en utilisant un logiciel d'imagerie Nikon. Screenshot image de contraste de phase de section musculaire qui a été encerclé utilisant imaginer logiciels pour la mesure de la CSA et le diamètre de furet min. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 5. images représentatifs de muscles H & E colorées correctement et mal préparés. (A) bien section traitées. (B) de la section de muscle gel endommagé mal traitée. S'il vous plaît click ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 6. chambre humidifiée approprié pour immunocoloration. S'il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 7. Exemple immunohistochimie diapositive correctement et colorés diapositive. Faites glisser a été souillé avec de la fibronectine (vert) et DAPI (bleu). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Histologie et immunohistochimie ont été utilisés comme outils essentiels à la compréhension de la manifestation et l'évolution de la pathologie dans divers troubles neuromusculaires. Classiquement, les biopsies musculaires ont d'abord été fixés dans du formol puis intégrés avec de la cire de paraffine. Le formaldéhyde fixation préserve l'architecture des tissus et permet le stockage de tissus et de transport à température ambiante, il inactive également des enzymes et protéines reticulations nécessitant des mesures supplémentaires pour atteindre un marquage précis. Ce problème est éliminé avec l'utilisation de coupes congelées mais cette méthode présente des défis techniques uniques dans l'obtention des résultats de coloration optimales et une interprétation exacte 14,15.
Tout d'abord, il est essentiel que les échantillons sont congelés immédiatement après excision chirurgicale autolyse et la décomposition commencent peu de temps après l'enlèvement du corps. Tissus doivent également être congelés rapidement et complètement pour la quantité de temps qui varie en fonction de la taille/ Épaisseur du tissu. Si cela ne se fait pas correctement, des dommages par congélation se produira rendre le tissu inutile pour une évaluation histologique. Après congélation, les tissus doivent être immédiatement stockés sur de la glace sèche et ensuite transféré à une basse température ultra (-80 ° C) de congélateur jusqu'à ce que la coupe. Il est important de noter que les tissus ne doivent pas être retiré du congélateur et sans être sur de la glace sèche à cause de gel-dégel sera également endommager l'architecture des tissus.
Une autre note d'importance lors de l'exécution analyse histologique est de prendre soin d'analyser toujours la même partie du tissu d'intérêt pour assurer l'uniformité entre les analyse. Cela peut être fait pour les sections de muscle en effectuant une analyse de la midbelly. Ceci est la partie du muscle qui est la plus épaisse et donc aura la plus grande surface de section transversale. Afin d'assurer que vous êtes bien sectionnant les midbelly, CSA des sections suivantes doit être mesurée à l'aide de logiciels d'imagerie histologique. Measuremparents devraient continuer à être faite jusqu'à la zone transversale commence à plateau. Une fois que cela se produit, le milieu du ventre a été atteint; seule cette partie du tissu doit être utilisé pour l'analyse histologique pour assurer l'uniformité entre les comparaisons.
Après sectionnement est terminé et diapositives ont été préparés, ils doivent être laissés à sécher à température ambiante pendant 1-2 heures. Séchage permet une bonne adhérence de la section à la diapositive et empêche également l'excès d'eau à cristalliser après le transfert à -80 ° C congélateur. Il est important de noter que les lames doivent également être manipulés uniquement sur de la glace sèche lors de la sélection des diapositives pour l'analyse afin d'éviter les cycles de gel-dégel. Lorsque les lames ont été sélectionnés pour la coloration, les protocoles inclus avec la tache devrait être suivi d'abord sur une base d'essai jusqu'à ce que des résultats optimaux ont été atteints. Lorsque vous effectuez un marquage, il est important de veiller à ce que les diapositives ne se dessèchent pas pendant toute la procédure. Séchage des diapositives peut entraîner des interactions transitoiress de rester intact après incubation. Ces interactions ne peuvent pas être supprimés au cours des lavages et se traduisent par une coloration non spécifique. Le séchage peut être évitée en maintenant les lames dans une atmosphère humidifiée. Exécution d'incubations avec des sections recouvertes de parafilm et glisse sur une serviette en papier humide scellé dans une petite boîte de glissement est suffisante pour assurer diapositives ne seront pas sèches à tout moment au cours de la procédure.
L'histologie est un outil essentiel dans la visualisation de la morphologie et de divers aspects de la pathologie. Bien que peu triviale, il est de la plus haute importance de prendre grand soin dans la préparation des tissus pour être utilisé pour l'histologie. De l'excision à la congélation, la coupe et la coloration, des tissus doivent être traitées de manière à éviter toute blessure gel et obtenir les images les plus précises possible. Sans une bonne conservation, la coloration ne sera pas refléter fidèlement la physiologie et donc conduire à des interprétations erronées.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 U.S.A., office phone 1-800-248-0123 Alternative: Richard Allen Scientific |
| Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064 U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternative: Olympus |
| Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A., Phone: 1-631-547-8500 Alternatives: Image J, Metamorph |
| Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | 1923 West Peoria Avenue, Phoenix, AZ 85029 U.S.A. |
| OCT | 4583 | Sakura Inc. | Torrence, CA 90501 U.S.A. Alternative source: Leica Microsystem |
| Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| 2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St. Louis, MO 63103 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
| Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 U.S.A. Alternative source: VWR Scientific |
References
- Bonnemann, C. G., et al. Diagnostic approach to the congenital muscular dystrophies. Neuromuscular disorders : NMD. 24, 289-311 (2014).
- Caughey, J. E., Pachomov, N.
- Fetterman, G. H., Wratney, M. J., Donaldson, J. S., Danowski, T. S. Muscular dystrophy. I. History, clinical status, muscle strength, and biopsy findings. AMA J Dis Child. 91, 326-338 (1956).
- Platzer, A. C., Chase, W. H. Histologic Alterations in Preclinical Mouse Muscular Dystrophy. The American journal of pathology. 44, 931-946 (1964).
- Mercuri, E., et al. Muscle magnetic resonance imaging involvement in muscular dystrophies with rigidity of the spine. Ann Neurol. 67, 201-208 (2010).
- Tasca, G., et al. Different molecular signatures in magnetic resonance imaging-staged facioscapulohumeral muscular dystrophy muscles. PloS one. 7, e38779 (2012).
- Girgenrath, M., Dominov, J. A., Kostek, C. A., Miller, J. B. Inhibition of apoptosis improves outcome in a model of congenital muscular dystrophy. The Journal of clinical investigation. 114, 1635-1639 (2004).
- Kumar, A., Yamauchi, J., Girgenrath, T., Girgenrath, M. Muscle-specific expression of insulin-like growth factor 1 improves outcome in Lama2Dy-w mice, a model for congenital muscular dystrophy type 1A. Human molecular genetics. 20, 2333-2343 (2011).
- Mehuron, T., et al. Dysregulation of matricellular proteins is an early signature of pathology in laminin-deficient muscular dystrophy. Skeletal muscle. 4, 14 (2014).
- Yamauchi, J., Kumar, A., Duarte, L., Mehuron, T., Girgenrath, M. Triggering regeneration and tackling apoptosis: a combinatorial approach to treating congenital muscular dystrophy type 1 A. Human molecular genetics. 22, 4306-4317 (2013).
- Sheriffs, I. N., Rampling, D., Smith, V. V. Paraffin wax embedded muscle is suitable for the diagnosis of muscular dystrophy. Journal of clinical pathology. 54, 517-520 (2001).
- Fox, C. H., Johnson, F. B., Whiting, J., Roller, P. P.
- Maccarty, W. C. The Diagnostic Reliability of Frozen Sections. The American journal of pathology. 5, 377-380 (1929).
- Shi, S. R., et al. Evaluation of the value of frozen tissue section used as 'gold standard' for immunohistochemistry. Am J Clin Pathol. 129, 358-366 (2008).
- Turan, T., et al. Accuracy of frozen sections for intraoperative diagnosis of complex atypical endometrial hyperplasia. Asian Pacific journal of cancer prevention : APJCP. 13, 1953-1956 (2012).
