Here we demonstrate the most efficient methods for freezing, embedding, cryosectioning, and staining of muscle biopsies to avoid freezing artifacts.
Гистологическая оценка мышечных биопсий служил в качестве незаменимого инструмента в понимании развития и прогрессирования патологии нервно-мышечных расстройств. Тем не менее, для того, чтобы сделать это, правильный уход должны быть приняты, когда иссечение и сохранение тканей для достижения оптимального окрашивания. Один из способов сохранения тканей включает фиксации тканей в формальдегид, а затем встраивания их парафином. Этот метод сохраняет морфологию также и позволяет длительное хранение при комнатной температуре, но громоздка и требует обработки токсичными химикатами. Кроме того, результаты формальдегида фиксации в антигена сшивки, что требует протоколы антиген извлечения для эффективного иммунного окрашивания. Напротив, замороженные секционирование не требует фиксации и, таким образом, сохраняет биологическую конформацию антигена. Этот метод также обеспечивает явное преимущество в быстрой свою очередь вокруг времени, что делает его особенно полезным в ситуациях, требующих быстрого гистологическая оценка как intraoperaного хирургических биопсий. Здесь мы опишем наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для визуализации с различными гистологическими и иммунологическими пятен.
Экспертиза мышечной гистологии играет важную роль в понимании различных типов нервно-мышечных расстройств 1-4. В сочетании с другими методами, что позволяет исследователям получить лучшее представление о проявлении и прогрессирования патологии, а также может иметь важное значение для оценки эффективности терапевтического вмешательства 5-10. Однако, чтобы быть точным, ткани должны быть сохранены в надлежащем порядке, с тем чтобы сохранить физиологическое состояние непосредственно перед удалением. Это требует большой осторожности во время удаления, сохранения, секционирования и окрашивания.
Ткани могут быть получены двумя различными способами для легкой микроскопическом исследовании. Первый способ, фиксированных формалином парафин (FFPE) секции, требуется ткани, чтобы быть фиксировали в 10% буферном растворе формальдегида природного прежде чем с встроенной парафина 11,12. Шаг фиксация помогает сохранить морфологию лучше, но также перекрестные ссылки эндогенного прoteins что требует сложная антиген извлечения процедуры иммунным и исключая возможность окрашивания ферментативной на таких участках 12. Замороженные срезы, с другой стороны, не должны быть предварительно обработаны или фиксированной; Поэтому, белки способны удерживать родные биологические конформации 13,14. Кроме того, замороженные срезы также позволяют быстро времени оборота, что в некоторых случаях необходимо, например, в интраоперационной диагностике сарком и других хирургических биопсий 15. Тем не менее, если не сделано должным образом, этот метод склонен к заморозить ущерб, который вносит изменения в мышечной архитектуре, делая секции непригодным для гистологического исследования. Эта статья будет выделить наиболее эффективный способ получения мышечной биопсии для того, чтобы достичь оптимального окрашивания для тщательного осмотра.
Гистологии и иммуногистохимии были использованы в качестве основных инструментов в понимании проявление и прогрессирование патологии в различных нервно-мышечных нарушений. Классически, мышечные биопсии были впервые зафиксированы в формальдегид, а затем с встроенной парафина. В то в…
The authors have nothing to disclose.
We would like to thank Alex Miller for manuscript revisions. This work was supported with the research grants awarded to M.G. from Cure CMD, Struggle Against Muscular Dystrophy (SAM) and Muscular Dystrophy Association (218938).
Cryostat | Leica CM 1850 | Leica Microsystems Inc. | Buffalo Grove, IL 60089 United States, office phone 1-800 248 0123 Richard Allen Scientific |
Microscope | Nikon Eclipse 50i | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Olympus |
Image analysis software | Nikon Imaging Software Basic Research | Nikon Instruments Inc. | 1300 Walt Whitman Road, Melville, N.Y. 11747-3064, U.S.A. Phone: +1-631-547-8500 Image J, Metamorph |
Isoflurane | 14043-220-05 | JD Medical Dist. Co., Inc. | JD Medical Distrubuting Co., Inc 1923 West Peoria Avenue Phoenix, Arizona 85029 |
OCT | 4583 | Sakura Inc. | Sakrua Fintek, USA, Torrence, CA 90501, USA Leica Microsystem |
Freeze It | 23-022524 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Disposable tissue mold | 22-363-554 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Colorfrost plus slides | 9991001 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Acetone | 650501-4L | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
Ethyl alcohol | HC-1300-1GL | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
2-methyl butane | M 32631-SL | Sigma-Aldrich | 3050 Spruce Street, St.Louis MO, 63103 VWR Scientific |
Xylene | HC-7001GA | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Cytoseal 280 | 8311-4 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA 02139 VWR Scientific |
Hematoxylin Gill #3 | CS402-1D | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |
Eosin | 6766007 | Thermofisher | 790 Memorial Dr, Cambridge, MA, USA, 02139 VWR Scientific |