Pancreatic cancer stem cells (CSCs) can be expanded in vitro using the anchorage-independent sphere culture technique, which represents a powerful tool to study CSC biology and can serve as the first step to develop novel CSC-targeting therapies. Here the methodology for expanding, analyzing and targeting of pancreatic CSCs is provided.
Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) enthält eine Teilmenge ausschließlich tumorigenen Krebsstammzellen (CSCs), die gezeigt haben, um Tumor-Initiation, Metastasierung und Beständigkeit gegenüber Radio- und Chemotherapie zu fahren. Hier beschreiben wir eine spezifische Methode zur Kultivierung von primären humanen Pankreas-CSCs als Tumorsphären in verankerungsunabhängigen Bedingungen. Die Zellen werden in serumfreiem, nicht haftenden Bedingungen, um für CSCs zu bereichern, während ihre differenzierter Nachkommen nicht überleben und vermehren sich in der Anfangsphase nach der Aussaat von Einzelzellen gezüchtet. Dieser Assay kann verwendet werden, um den Prozentsatz der in einer Population von Tumorzellen vorhanden KSZ abzuschätzen. Sowohl Größe (die von 35 bis 250 Mikrometer liegen kann) und die Anzahl der Tumor Kugeln gebildet stellt CSC-Aktivität entweder in bulk Populationen von kultivierten Krebszellen oder frisch geerntet und aufgeschlossen Tumoren 1,2 barg. Unter Verwendung dieses Tests haben wir vor kurzem festgestellt, dass Metformin selektiv abträgt pancreatic CSCs; ein Befund, der anschließend weiter durch den Nachweis verminderte Expression von Pluripotenz-assoziierten Gene / Oberflächenmarker untermauert und in vivo Tumorbildung von Metformin behandelten Zellen reduziert wurde. Als letzter Schritt für die präklinische Entwicklung, die wir behandelten Mäusen mit etablierten Tumoren mit Metformin und Ergebnis signifikant verlängert das Überleben. Klinische Studien testet den Einsatz von Metformin bei Patienten mit PDAC sind derzeit im Gange (zB NCT01210911, NCT01167738 und NCT01488552). Mechanistisch, fanden wir, dass Metformin führt zu einem tödlichen Energiekrise in CSCs durch Verbesserung reaktive Sauerstoffspezies (ROS) Produktion und die Verringerung der mitochondrialen Transmembranpotentials. Im Gegensatz dazu wurden nicht-CSCs nicht durch Metformin Behandlung beseitigt, sondern unterzog reversible Zellzyklusarrest. Daher dient unserer Studie als gelungenes Beispiel für das Potenzial der in vitro Kugel Bildung als Screening-Instrument, um Verbindungen, die möglicherweise gezielt CSC identifizierens, aber diese Technik weitere in vitro- und in vivo-Validierung erforderlich, falsche Entdeckung zu vermeiden.
Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDAC) ist eine der aggressivsten soliden Tumoren. Es ist derzeit die 4. häufigste Krebs-Todesfälle in der westlichen Gesellschaft und wird voraussichtlich auf der 2. häufigste Ursache innerhalb des nächsten Jahrzehnts steigen (~ 400.000 Todesfällen pro Jahr weltweit) 3 .Am Zeitpunkt der Diagnose 90% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung, die eine 5-Jahres-Überlebensrate von weniger als 5% aufweist. Diese Überlebensrate enttäuschend trotz immer intensivere Forschungsaktivitäten 4 unverändert in den letzten 50 Jahren. Von den verbleibenden 10% der Patienten, die potenziell "heilbar" Krankheit durch chirurgische Resektion haben, werden 80% von Rezidiv innerhalb von 5 Jahren zu sterben. Seit vielen Jahren die Standardtherapie bei fortgeschrittener Erkrankung ist Gemcitabin-Monotherapie, aber dies nur verleiht eine marginale Überlebensvorteil 5. Kleine Verbesserungen in kurzfristige Überleben wurden durch die Zugabe erreicht wurdevon Erlotinib 6 oder 7 Capecitabin jedoch die Überlebensvorteil in der Größenordnung von Wochen mit der mediane Gesamtüberleben noch ~ 6 Monate. In jüngster Zeit haben mehrere ermutigende Ergebnisse für Gemcitabin / nab -paclitaxel 8 und die FOLFIRINOX Kombination Regime 9,10 entstanden. Diese Therapien verbessert mediane Überlebenszeit von bescheidenen 2 und 4 Monate sind, aber sind sehr giftig und Langzeitüberlebenden immer noch eine seltene Ausnahme. Obwohl die Behandlung bietet das Potenzial für Verbesserungen, diese sind giftig Regime, auf die viele Patienten nicht reagieren oder nur zeigen, schrittweise Verbesserung des Gesamtüberlebens. In der Folge gibt es eine dringende Notwendigkeit, die derzeitigen Therapien ergänzen und sich auf neue, wahrscheinlich multimodale Therapieansätze zu entwickeln.
Tumor Heterogenität
Es wird immer deutlicher, dass Krebs Heterogenität ist nicht nur auf unterschiedliche evolutionäre Subklone withi beschränktn jeden Tumor 11, sondern auch durch phänotypische und funktionelle Heterogenität und Plastizität in jedem Subklon 12 angetrieben. So genannte Krebsstammzellen (CSCs) oder tumorfördernde Zellen sind für intraklonale Heterogenität 13-16 verantwortlich. Insbesondere CSCs stellen eine Untergruppe der Krebszelle, für die wir und andere haben schlüssige Nachweise erbracht hat, bis in die einzelne Zelle, die sie vertreten die Wurzel der Krankheit durch, die zu allen differenzierten Nachkommen in jedem Subklon 17 Krebs. Noch wichtiger ist, sind diese Zellen die für metastatische Verhalten und auch eine wichtige Quelle für Rezidiv nach der Behandlung, auch bei relativ wirksame Medikamente zur Induktion anfänglichen Tumorrückbildung (zB nab -paclitaxel) 15,18-20. Es ist wichtig zu beachten, dass KSZ stellen nicht notwendigerweise bona fide Stammzellen, noch haben sie aus Gewebestammzellen entstehen in vielen Fällen, sondern sie haben acquired bestimmte Merkmale von Stammzellen. Die meisten davon sind funktional definiert, beispielsweise CSCs sind mit unbegrenzter Selbsterneuerungskapazität macht sie resistent gegen herkömmliche Chemotherapie ausgestattet und zeigen eine erhöhte Invasivität, die metastatische Aktivität fördert.
Funktionelle Krebsstammzellen Phänotypen
Die funktionelle Phänotyp KSZ beruht auf ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung, die in vitro unter Verwendung serieller Formation Kugel und Koloniebildungstests jeweils getestet werden kann, nach. Noch wichtiger ist, CSCs in der Lage sich selbst zu erneuern Bär in vivo Tumorbildung, die durch Grenzverdünnung in vivo-Tests als die ultimative Funktionsanzeige, vorzugsweise während serielle Transplantation Hinweis auf ausschließliche langfristige Tumorbildung getestet werden können. Darüber hinaus gibt es die Heterogenität innerhalb des CSC Raum, mit einem deutlichen Subpopulation von CSCs mit dem exklusiven Fähigkeit, Anlass zu Metastasen zu geben, die nicht nur einedirekte Konsequenz aus der exklusiven in vivo Tumorbildung. Tatsächlich metastastitic CSCs erwerben die Fähigkeit, den Primärtumor zu umgehen, zu überleben und schließlich anoikis translozieren und Samen sekundären Standorten. Diese erweiterten funktionalen Fähigkeiten können in vitro unter Verwendung von modifizierten Invasion Assays und in vivo mit Metastasen Assays getestet werden.
Targeting Cancer Stem Cells
Wir und andere haben überzeugende Beweise, dass Behandlungen, die sich auf die Großtumor differenzierter PDAC-Zellen, auch in Kombination mit Stroma-Targeting-Mittel zur Verfügung gestellt, die nicht über einen großen Einfluss auf die Tumorprogression und anschließende Ergebnis, es sei denn mit einem CSC-Targeting Strategie 21 kombiniert, 22. Somit, bezogen auf die wesentlichen Funktionen des CSCS in den Krankheitsverlauf und Therapieresistenz Diese Zellen sollten ein wesentlicher Bestandteil für jede neue Behandlungsansatz 18,20 bedeuten, aber ein viel besseres Verständnis o erfordernf Regulierungsapparat CSCs. Obwohl CSCs und deren differenzierter Nachkommen tragen identische genetische Grundzustände in Bezug auf genetische Veränderungen, CSCs zeigen deutliche und damit epigenetisch bestimmten Genexpressionsprofilen, die Aktie Module mit pluripotenten Stammzellen. Die meisten der in Erzeugungs induzierte pluripotente Stammzellen (Nanog, Oct3 / 4, Klf4, Sox2) beteiligten Gene nicht nur im Zusammenhang mit Krebs, aber ihr Ausdruck ist vor allem auf die CSCs Raum beschränkt. Darüber hinaus haben die funktionelle Relevanz von CSCs loss-of-function-Experimente unter Verwendung genetischer Werkzeuge für die Ausrichtung CSCs jetzt fest etabliert die CSC-Konzept für mehrere Krebsarten 23-25. Während die meisten dieser Ansätze beruhen auf Mausmodelle basieren und sind daher nicht leicht übertragbar in der Klinik bieten sie proof-of-concept für die potentielle klinische Bedeutung Targeting KSZ in Kombination mit Massentumorzellen.
Studieren Cancer Stem Cells In Vitro ihre Achillesferse Identifizieren
Um neue und klinisch anwendbare Möglichkeiten für die Ausrichtung CSCs zu identifizieren, werden ihre Funktionen regelmäßig in vitro untersucht und Kugelbildung ist weit verbreitet in diesem Zusammenhang verwendet. Ursprünglich für das Studium normalen Stammzellbiologie, einschließlich Selbsterneuerung und Differenzierung Kapazität entwickelt, wurde dieser Test später angepasst CSCs in vitro zu studieren und hat für die Untersuchung von CSCs von PDAC 20 getrennt verwendet. Wir haben festgestellt, dass Tumor-Kugeln aus primären humanen PDAC Zellen gebildet tragen alle unterschiedliche Merkmale von CSCs daher anzeigt, dass sie nach Treu und Glauben Bauchspeicheldrüsen CSCs 21 enthalten. Somit wird der Tumor Sphäre Assay stellt ein leistungsfähiges Tool, um Bildschirm für effektivere Therapien in vitro, aber die Ergebnisse müssen weiter in strenger in vivo-Tests bewertet werden. Tatsächlich sollte Daten mit diesem in-vitro-Test erzeugt mit großer Vorsicht behandelt werden, wie the-Test kann mit erheblichen Irrtum. Hoch standardisierte Protokolle, darunter automatisierte Zählung der gebildeten Kugeln, eingerichtet werden, um reproduzierbare und Vorhersagedaten zu gewährleisten.
In diesem Zusammenhang haben wir kürzlich dieses Assays Bauchspeicheldrüsenkrebsstammzellen aus einem unterschiedlichen Satz von primären humanen PDACs abgeleitet screenen und zeigte, dass diese Zellen höchst anfällig für metabolische Umprogrammieren antidiabetische Verbindung Metformin. Zuvor war nachgewiesen worden Metformin zur Krebszellexpansion durch indirekten Aktivierung von AMP-aktivierten Proteinkinase (AMPK) Signal- und anschließender Inhibierung von mTOR 26, was zu einer reduzierten Proteinsynthese und die Zellproliferation hemmen 27. Zusätzlich zu diesen Wirkungen auf die Schütttumorpopulation haben wir und andere herausgefunden, dass Metformin imstande zum Ziel und tatsächlich keine CSCS Subpopulation in einer Reihe von festen Tumoren, wie Brustkrebs, Speiseröhrenkrebs, Glioblastom und Bauchspeicheldrüsenkrebs 28-31 </ Sup>. Somit stellt Metformin eine vielversprechende und sichere neue therapeutische Strategie für verschiedene Krebsarten mit derzeit nicht gedeckten medizinischen Bedarf. Darüber hinaus mit Kugelbildung als eine Möglichkeit, für CSCs zu bereichern, haben wir gezeigt, dass die primäre Wirkung von Metformin über Bauchspeicheldrüsen CSCs war der AMPK-Aktivierung unabhängig und vor allem auf seine bescheidene mitochondriale Toxizität verlassen (über eine Hemmung der Komplex I), die offenbar war tödlich für die Teilmenge von CSCs nur. Für letztere konnten wir ihre zellulären Sauerstoffverbrauch und mitochondriale ROS-Produktion als Indikatoren für Toxizität des Medikaments auf zellulärer Ebene zu bewerten. Anschließend könnten diese in vitro-Daten in präklinischen Mausmodellen validiert werden, und in der Tat zu einer signifikant verlängerten Überlebenszeit 31. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die schnelle Erzeugung von Medikamentenempfindlichkeitsprofile für CSCs, einschließlich Studien über ihre Auswirkungen auf die CSC-Stoffwechsel. Wir haben jetzt erweitert experimentelle Einzelheiten über die verwendeten com liefernergänzende in vitro und in vivo-Verfahren.
Mit dem Aufkommen und anschließende Validierung des CSC-Konzept für viele Tumoren hat sich auf dem Gebiet der Arzneimittelentwicklung neue Impulse für die Entwicklung von effizienteren Krebstherapien und in der Folge die Reduzierung von Risiken für Rezidiv gewonnen, mit dem Potenzial. Allerdings ist der Bereich CSC noch in einem frühen Zustand und es muss mehr in Bezug auf das Verständnis CSC Ursprung und Ausbreitung, und ihre Rolle bei der Gestaltung der Tumorarchitektur und die Förderung der Metastasen erreicht werden.
In diesem Zusammenhang ist die Verwendung von reproduzierbaren und sinn CSC Assays sowie die informierte Interpretation der erhaltenen Daten ist ein entscheidender Bestandteil für unser Verständnis von CSC Biologie. Von vielen biologischen Perspektiven hat Sphäre Bildung als äußerst wertvoll Test hervorgegangen; dennoch Benutzer sollten sich bewusst sein, seine Grenzen, um ihre experimentellen Ergebnisse richtig zu interpretieren. Ein wichtiger Aspekt, sogar vor der Bewertung der Kugel forma betrachtention Daten ist der Ursprung der untersuchten Probe, da die aus frischen Patienten stammende Proben erhaltenen Ergebnisse wesentlich verschieden von denen von etablierten Tumorzelllinien erhalten werden.
Klassischen Kugelbildung Assays beinhalten Impfen Zellen bei klonaler Dichte in ultraniedriger Befestigungsplatten und Auswerten Kugelbildung in Gegenwart von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) und / oder basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (b-FGF) angereichertes, aber serumfreien Medium 21, 34. Die Zusammensetzung des Kulturmediums ist ebenfalls ein wichtiges Thema, das zu berücksichtigen. Nach unserer Erfahrung haben wir festgestellt, dass das DMEM / F12 mit B27, bFGF und Glutamin in Abwesenheit von Serum ergänzt war ein optimales Medium in undifferenzierten Bedingungen wachsen, erweitern und Aufrechterhaltung der CSC. Wir haben festgestellt, dass in diesem Kulturbedingung (mittel und Suspension) exprimieren die Zellen hohe Mengen an Krebsstammzellmarker (einschließlich CD133 +, CD44 + und CD24 +) und nicht zum Ausdruck bringen Differenzierung assoziierten Proteinen (CK-20 Und CK-19).
Eine der grundlegenden Annahmen für diese Tests ist, dass jede Kugel ist klonalen, dh führt eine Kugel aus der Erweiterung eines einzelnen Stammzelle. Allerdings sind Kugeln eigen dynamische Strukturen, die anfällig für selbst bei geringen Aussaatdichte 35 zu verschmelzen sind. Plating-Zellen ist ein wichtiger Schritt in der Protokoll und die Dichte einer Zelle / Vertiefung kann sicherlich die Aggregation Problem zu umgehen. Aber auch für prospektiv sortiert Vorläuferzellen, diese regelmäßig zu sehr niedrigen Bildungssphäre durch geringe Eigensphäre Bildungsaktivität und kann auch beschränkt auf autokrine Stimulation durch Verdünnungseffekte zurückzuführen. Nach unserer Erfahrung haben wir beobachtet, dass nur 30% der Zellen ausplattiert können Kugeln bilden. Wir empfehlen, mindestens 100 Zellen / Vertiefung, um konsistente und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.
Andere Kulturmethoden, um das Wachstum CSC auf festen oder halbfesten 3D-Kulturen (zB auf der Basis, basierend auf mAtrigel, Kollagen oder Methylcellulose). Diese Methoden wurden verwendet, um Zellmobilität und anschließende Zellaggregation 36 zu begrenzen. Jedoch trägt jeder dieser Matrizen ihre eigenen Grenzen. So ist zum Beispiel Matrigel ein lösliches Basalmembran aus Engelbreth-Holm-Swan (EHS) isoliert Tumor und obwohl der Extrakt ähnelt dem komplexen extrazellulären Tumorumgebung in vielen Geweben gefunden wird, enthält es mehrere mehr oder weniger definierten Wachstumsfaktoren, die oft macht mechanistische Studien für spezifische regulatorische Elemente sehr schwierig. Ein weiterer Punkt der Überlegung ist, dass Kugel bildenden Kapazitäten und Stammzellfunktionen sind nicht austauschbar 34 Begriffe. Während bestimmte Stamm- und Vorläuferzellen wurde gezeigt, dass Kügelchenbildungsfähigkeit 37, das Versagen der Kugeln in vitro zu erzeugen in vivo nicht Stammzellen / Vorläuferfunktion auszuschließen aufweisen. Beispielsweise ruhenden Stammzellen kann einfach nicht auf die extrazelluläre Signale durch das zur Verfügung gestellt zu reagierenIn-vitro-Kulturbedingungen ausgewählt. Somit langfristig in vitro als auch in vivo Selbsterneuerungskapazität gereinigte Zellpopulationen, bevorzugt während serielle Passagierung sollte, um zu beweisen oder zu widerlegen Stammzellenfunktion beurteilt werden. In diesem Zusammenhang ist die Fähigkeit, unterschiedliche Populationen von Stammzellen und Vorläuferzellen prospektiv und gleichzeitig ausbreiten ein entscheidender Aspekt der Kügelchenbildungsassay und macht diesen Test für den Bereich CSC sehr wertvoll; solange seine Grenzen sind im Kopf für die Interpretation der gewonnenen Daten gehalten.
Sphere bildenden Tests sind weit verbreitet, um rückwirkend identifizieren Stammzellen auf der Grundlage ihrer Fähigkeit zur Selbsterneuerung und Differenzierung auf Einzelzellebene in vitro. Die Entdeckung von Markern, die die prospektiven Isolierung von Stammzellen und deren Nachkommenschaft, die aus ihrer in vivo Nische ermöglichen können die funktionellen Eigenschaften der gereinigten Populationen zu definieren. Die combination der Sphäre Bildungstest und der FACS ist eine erfolgreiche Strategie, um Zellen aus festem Gewebe zu isolieren oder anzureichern spezifische Subpopulationen von PDAC in Kultur. Zum Beispiel die gleichzeitige Expression von EpCAM, CD24 und CD44 definiert eine Subpopulation von CSCs in der Lage sein: Selbsterneuerung, zu differenzieren und zu initiieren einen Tumor, was die Heterogenität des ursprünglichen Tumors. Hermann et al. zeigte, dass CD133 + Zellen besaß Augmented proliferative Kapazität und CSC verfügt über 15. Andere Marker zur Charakterisierung des CSCS verwendet: ALDH- 1 (Aldehyd-Dehydrogenase-1) Expression mit hoch tumorigenen Zellen im Pankreaskarzinom 38 zugeordnet ist; Zellen in der Lage, die DNA-Farbstoff Hoechst 33342 ausschließen, benannt Seitenpopulation (SP) Zellen, haben die Fähigkeit, Tumoren geprüftes 39 zu initiieren. Kürzlich haben wir gezeigt, dass eine subzelluläre Autofluoreszenz Fach kennzeichnet einen deutlichen Population von menschlichen Zellen mit exklusiven CSC Züge in verschiedenen Tumorarten40. Obwohl keines dieser Marker scheint selektiv charakterisieren eine reine Population KSZ, mehr und mehr komplexe Kombinationen von Markierungen müssen mit FACS verwendet werden, zu reinigen verfeinerten Zellpopulationen.
Viele Fragen bleiben über die genaue Rolle von CSCs in der Herkunft, der Progression und Arzneimittelresistenz von Tumoren. Zum Beispiel besteht ein Weg, um die Frage der klonalen Evolution Adresse zu definieren, ob und wie eine einzelne CSC initiiert einen Tumor, könnte es sein, die Patientenproben bei verschiedenen Stadien der Erkrankung zu analysieren, und zwar folgendermaßen die Zahlen des CSCS während und nach der Behandlung. Durch die Beantwortung dieser Fragen, können wir sinnvolle Fortschritt unserer Kenntnis von CSCs in soliden Tumoren zu machen und zu entwickeln, Drogen-Therapien, um letztlich zu verhindern Tumorprogression und Rückfall.
The authors have nothing to disclose.
Die vorliegende Studie wurde unterstützt durch einen ERC Advanced Investigator Grant (Pa-CSC 233460), dem Siebten Rahmenprogramm der Europäischen Gemeinschaft (FP7 / 2007-2013) im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr 256974 (EPC-TM-NET) und keine 602.783 (CAM-Pac ), der Subdirección General de Fomento y Evaluación de la Investigación, Fondo de Investigación Sanitaria (PS09 / 02129 & PI12 / 02.643) und die Programa Nacional de internacionalización de la I + D, Subprogramma: FCCI 2009 (PLE2009-0105; Ministerio de Economía y Competitividad, Spanien). E. Lonardo wurde von Roche Fellowship unterstützt. M. Cioffi wurde von der La Caixa Predoctoral Stipendienprogramm unterstützt.
Counting Chamber/Hemocytometer | Hausser Scientific Co | 3200 | |
CASY Cell Counter and Analyzer for proliferation and viability measurement | Roche Innovatis | AG CASY Model TTC 45,60,150 μm | |
GentleMACS Dissociator | Miltenyi Co | 130-093-235 | |
GentleMACS C Tubes | Miltenyi Co | 130-093-237 | |
24-well Ultra-low Attachment Plates | Corning | 3474 | |
100-mm tissue culture dishes | BD Falcon | 353803 | |
Cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
15-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352097 | |
50-mL polypropylene conical tube | BD Falcon | 352070 | |
1.5 ml sterile tubes | Eppendorf | 0030 120.086 | |
50 ml centrifuge tubes | Corning | 430828 | |
Sterile petri dishes, 10 cm dishes | Corning | 353003 | |
26G needles | BD Falcon | 300600 | |
100 ul Hamilton Syringe | Hamilton Syringe Co | 81075 | |
Collagenase type IV | Stem Cell Technologies | 7909 | |
RPMI Medium 1640 | Life technologies | 11875-085 | |
Penicillin/Streptomycin solution, 100X | Life technologies | SV30010 | |
Metformin | Sigma | D150959-5G | |
L-glutamine, 200 mM, 100X | Life technologies | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G8270 | |
100mM Sodium Pyruvate solution | Life technologies | 11360-070 | |
Seahorse Assay medium | Seahorse Bioscience | 100965-000 | |
BD Cell-TAK Cell and Tissue adhesive | BD Biosciences | 354240 | |
Trypsin solution, 0.05% | Life technologies | 25300054 | |
B27 Supplement 50x | Life technologies | 17504-044 | |
Basic Fibroblast Growth Factor | Sigma | F0291 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A9576 | |
Dulbecco’s Modified Eagle Medium/F12 | Sigma | D8437 | |
Sterile 1x Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Trypan Blue | Life technologies | 15250-061 | |
Carboxy-DCFDA(5-(and-6)-Carboxy-2',7'-DichlorofluoresceinDiacetate) | Life technologies | C-369 | |
Rotenone | Sigma | R8875 | |
Ethanol 70% (vol/vol) | Sigma | 459844 | |
Isofluorane | IsoVet, Braun | 571105.8 | |
Matrigel | BD Biosciences | 35620 | |
Sterile Cotton tipped applicator | Puritan medical | ||
XF96e FluxPak with cell plates, calibrant and cartridges | Seahorse Bioscience | 102416-100 | |
XF96e Extracellular Flux analyzer | Seahorse Bioscience | ||
Incubator with CO2 input | |||
Micro scissors | |||
Curved forceps | |||
Splinter forceps | |||
Caliper |