Intranasal המינהל של החיסונים שפעת רקומביננטי במודלי כימרי עכבר ללמוד חסינות רירית
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
הדור של זיכרון חיסוני בהעדר המחלה הוא הבסיס הפיזיולוגי של חיסון יעיל 1. לאחרונה, מערכות גישות מבוססות ביולוגיה חשפו כי חיסונים מוצלחים כגון חיסון הקדחת הצהוב, לגרום לאינדוקציה חזקה של תגובות חיסוניות מולדים והפעלה של מספר תת קבוצות של תאים דנדריטים (DCS), אשר בתורו, להוביל לmultilineage הפעלה של אנטיגן תאי T ספציפיים 2,3. מאז DCs הוא אוכלוסיית תאים חיסונית רק עם היכולת להפעיל תאי T הנאיביים אנטיגן ספציפי 4, חקר תפקודם במהלך החיסון הוא קריטי להבנת תגובות חיסוניות לחיסונים ולעצב אסטרטגיות עתידיות נגד פתוגנים מאתגרים.
מערכת מאפשרת מעקב של תת DCs שונה במהלך תגובה חיסונית לחיסונים תהיה רצויה כדי להקים קינטיקה מדויקת של הגירת DC לרקמות הלימפה, ולכן כדי לספקתובנה המנגנונים הפיסיולוגיים אחראים על הייזום של חסינות אדפטיבית חיסון ספציפי. הפוך גנטיקה מבוססת גישות מציעות האפשרות ליצירת שינוי, חיסונים-מוחלש חיים, שניתן להשתמש בניסוי עם מטרה זו. מאז יישומה על מחקר שפעת, גנטיקה הפוכה מבוסס פלסמיד הועסקה נרחבת כדי ליצור זני שפעת רקומביננטי כולל LAIVs. פרוטוקולים סטנדרטיים להצלת נגיפי שפעת רקומביננטי דורשים רב-transfection של קווי transfectable מאוד תא עם פלסמידים ambisense (הפקת שני RNA תחושה חיובי והשלילי) המכילים את הקטעים נגיפיים שפעת שמונה, כמו גם הגברה במערכת מתירנית כגון כליות כלבי מדין-דארבי ( תאי MDCK) ו / או ביצי תרנגולת embryonated 5. עם זאת, היישום של גנטיקה הפוכה כדי ליצור כלים מולקולריים כדי ללמוד את מנגנוני החיסון של חיסון נשאר נחקר.
הדורמודלים עכבר חדשים המאפשרים דלדול ספציפי של תת תא חיסון, כולל DCS, פתח אפשרויות חדשות כדי להבין את מנגנוני חיסון הבסיסיים שבבסיס הגנה-שהושרו חיסון. ההשוואה בין פונקציות משנה DC בעכברים ובבני האדם גילתה כי, במידה רבה, עכבר וDCs האנושי הם פונקציונלי הומולוגי 6,7, ממצאים אלה, ממליץ בחום שפיתוח המודלים עכבר מאפשר דלדול ספציפי של DCs במצב היציב ובמהלך המצבים דלקתיים, יכול לשמש כדי להבין את הפיסיולוגיה של תגובות DC בבני אדם. בשנים האחרונות מספר המודלים עכבר כבר נוצר נושא transgenes מבטא את הקולטן רעלן דיפתריה הקופי (DT) (DTR) תחת שליטתו של אזור האמרגן של גן של 8,9 עניין. מאז רקמות עכבר לא באופן טבעי להביע DTR, מודלים אלה מאפשרים דלדול מותנה של תת תא נושא את הגן הממוקד של עניין על חיסון עכבר עם DT. לפיכך, abili שלנוטאי לרוקן DCs הספציפי ולויקוציטים האחר in vivo בתהליכים פיסיולוגיים, שופר באופן משמעותי על ידי הפיתוח של ro מבוסס DTR. עם זאת, בעוד שדגמי העכבר מהונדסים אלה היו בשימוש נרחב כדי להבין את ontogeny של מערכת החיסון, היישום שלהם לפיתוח חיסון נבדק בקושי. כאן, על ידי שילוב של גנטיקה הפוכה שפעת ומפלצות מח עצם תחרותיות מבוססות DTR, אנו מציעים שיטה ללמוד קינטיקה של חסינות חיסון, כמו גם תפקוד גן בודד במהלך תגובה חיסונית לחיסוני in vivo. היישום של טכנולוגיה זו להערכה פרה-קלינית של חיסונים חדשים כנגד מחלות זיהומיות מאתגרות יכול לעזור לתרץ עיצוב חיסון ולבחון מועמדי חיסון in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה אנו מתארים כיצד הפוכים גנטיקה ומודלים של עכברים chimeric יכול להיות מנוצלים כדי להבהיר את המנגנונים הפיזיולוגיים ומולקולריים של חסינות שנוצר עקב חיסון. גנטיקה הפוכה שפעת הוקמה במעבדות רבות ומלאה תפקיד ראשי בהבנת הפתוגנזה שפעת, שכפול והעברה 17. נקודת מפתח ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
- Bevan, M. J. Understand memory, design better vaccines. Nat. Immunol. 12, 463-465 (2011).
- Gaucher, D. Yellow fever vaccine induces integrated multilineage and polyfunctional immune responses. J. Exp. Med. 205, 3119-3131 (2008).
- Querec, T. D. Systems biology approach predicts immunogenicity of the yellow fever vaccine in humans. Nat. Immunol. 10, 116-125 (2009).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Martínez-Sobrido, L., García-Sastre, A. Generation of recombinant influenza virus from plasmid DNA. J Vis Exp. 3, (2010).
- Haniffa, M. Human Tissues Contain CD141hi Cross-Presenting Dendritic Cells with Functional Homology to Mouse CD103+ Nonlymphoid Dendritic Cells. Immunity. 37, 60-73 (2012).
- Haniffa, M., Collin, M., Ginhoux, F. Ontogeny and functional specialization of dendritic cells in human and mouse. Adv. Immunol. 120, 1-49 (2013).
- Jung, S. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17, 211-220 (2011).
- Lahl, K., Sparwasser, T. In vivo depletion of FoxP3+ Tregs using the DEREG mouse model. Methods Mol. Biol. 17, 211-220 (2011).
- Duffield, J. S. Selective depletion of macrophages reveals distinct, opposing roles during liver injury and repair. J. Clin. Invest. 115, 56-65 (2005).
- Meredith, M. M. Expression of the zinc finger transcription factor zDC. J. Exp. Med. 209, 1153-1165 (2012).
- Girón, J. V. Mucosal Polyinosinic-Polycytidylic Acid Improves Protection Elicited by Replicating Influenza Vaccines via Enhanced Dendritic Cell Function and T Cell Immunity. J. Immunol. 193, 1324-1332 (2014).
- Freshney, R. I. Culture of animal cells: a manual of basic technique. bib.usb.ve. , (1983).
- Cox, R. J., Brokstad, K. A., Ogra, P. Influenza virus: immunity and vaccination strategies. Comparison of the immune response to inactivated and live, attenuated influenza vaccines. Scand. J. Immunol. 59, 1-15 (2004).
- Gowdy, K. M. Impaired CD8(+) T cell immunity after allogeneic bone marrow transplantation leads to persistent and severe respiratory viral infection. Transpl. Immunol. 32, 51-60 (2015).
