キメラマウスモデルにおける組換えインフルエンザワクチンの鼻腔内投与は、粘膜免疫を研究するために、
Summary
There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.
Abstract
Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.
Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.
Introduction
疾患の非存在下での免疫記憶の発生を効率的にワクチン接種1の生理学的基礎です。近年、システム生物学に基づくアプローチは、順番に、リードが抗原の活性化を多系列ためにどのような黄熱病ワクチンとして成功したワクチンは、強力な自然免疫応答の誘導および樹状細胞（DC）のいくつかのサブセットの活性化を誘導することを明らかにしました特異的T細胞の2,3。 DCは、抗原特異的ナイーブT細胞4を活性化する能力を持つ唯一の免疫細胞集団であるため、ワクチン接種時にその機能の研究は、ワクチンに対する免疫応答を理解し、挑戦的な病原体に対する今後の戦略を設計することが重要です。
ワクチンに対する免疫応答の間に別のDCのサブセットのトレースはリンパ組織へのDCの遊走の正確な速度を確立するために望ましいであろうため、提供することを可能にするシステムワクチン特異的適応免疫の開始を担う生理学的メカニズムへの洞察。逆遺伝学ベースのアプローチは、この目的に実験的に使用することができる修飾された、生弱毒化ワクチンを生成するための可能性を提供します。インフルエンザ研究に実装するので、プラスミドベースの逆遺伝学は広くLAIVs含む組換えインフルエンザ株を生成するために使用されてきました。組換えインフルエンザウイルスを救出するための標準的なプロトコルは、（マディンダービーイヌ腎臓として許容システムでは8個のインフルエンザウイルスのセグメントと同様に増幅を含む（正と負の両方のセンスRNAを産生する）アンビセンスプラスミドを有する高度のトランスフェクト細胞株の多トランスフェクションを必要としますMDCK）細胞および/ またはニワトリ孵化卵5。しかし、ワクチン接種の免疫機構を研究するための分子ツールを生成するための逆遺伝学の適用が未開拓のままです。
世代DCを含む免疫細胞サブセットの特定の枯渇を可能にする新しいマウスモデルの、ワクチン誘発保護の根底にある基本的な免疫機構を理解するための新たな可能性を開きました。マウスおよびヒトにおけるDCサブセット機能との比較、大幅に、マウスおよびヒトDCは機能的に相同6,7であることがこれらの調査結果を明らかにした、強力にマウスモデルの開発は、定常状態でのDCの特定の枯渇を可能にすることを示唆していますおよび炎症状態の間、ヒトにおけるDC応答の生理を理解するために役立つことができます。近年、マウスモデルの数は、目的8,9の遺伝子のプロモーター領域の制御下にサルジフテリア毒素（DT）受容体（DTR）を発現する導入遺伝子を保有する生成されています。マウス組織が自然にDTRを発現しないので、これらのモデルはDTでマウスの接種時に対象となる標的遺伝子を有する細胞サブセットの条件枯渇を可能にします。したがって、我々のabili生理学的プロセスの間に、生体内で特定のDCおよび他の白血球を枯渇させるTYは、大幅にDTRベースのROの開発によって強化されました。これらのトランスジェニックマウスモデルは、免疫系の個体発生を理解するために広く使用されているがしかし、ワクチン開発への応用はほとんどテストされていません。ここでは、インフルエンザの逆遺伝学とDTRベースの競争骨髄キメラを組み合わせることによって、我々は、in vivoでのワクチンに対する免疫応答の間にワクチン免疫の動態ならびに個々の遺伝子機能を研究するための方法を提案します。挑戦的な感染症に対する新たなワクチンの前臨床評価のためのこの技術の適用は、ワクチン設計を合理化し、in vivoでのワクチン候補をテストするために助けることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
本研究では、ワクチン誘導免疫の生理学的および分子メカニズムを解明するために利用することができますどのように逆遺伝学およびキメラマウスモデルについて説明します。インフルエンザ逆遺伝学は、多くの研究室で確立され、インフルエンザ発病、複製、および伝送17を理解する上で主な役割を果たしてきました。我々のプロトコルで重要な点は、外来エピトープを発現する寒…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Sergio Gómez-Medina for excellent technical support with mouse experiments. This work was supported by funds from the Leibniz Association and the Leibniz Center of Infection. A.L. is a recipient of a pre-doctoral fellowship from the Leibniz Graduate School.
Materials
| Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X) | Gibco RL-Life Technologies | 41965-039 | |
| Opti MEM | Gibco RL-Life Technologies | 31985-047 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen-Life Technologies | 11668-027 | |
| Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) | PAA | p11-010 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Embryonated eggs | Valo biomedia Gmbh | ||
| PBS (1X) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| 70 μM Nylon Filters | Greiner-Biorad | 542-070 | |
| Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X | BD Bioscience | 555899 | |
| CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2) | BD Pharmigen | 553142 | |
| APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16) | Biolegend | 141605 | |
| PE-Anti-mouse CD11c (HLA3) | BD Biosciences | 553802 | |
| eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2) | eBioscience | 48-5321-82 | |
| Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70) | Biolegend | 101216 | |
| PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7) | Biolegend | 121416 | |
| PE-Anti-mouse CD45.1 (A20) | eBioscience | 12-0453-82 | |
| V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4) | BD Bioscience | 562130 | |
| PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7) | eBioscience | 46-0081-80 | |
| APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611) | Biolegend | 100325 | |
| eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5) | eBioscience | 48-0041-80 | |
| CFSE Proliferation dye | eBioscience | 65-0850-85 | |
| Baytril 2.5% | Bayer | 65-0850-85 | |
| Dymethil-Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Ovalbumin | Molecular probes | O23020 | |
| Diphteria Toxin (DT) | Sigma-Aldrich | D0564 | |
| Trypsin-TPCK | Sigma-Aldrich | T1426 | |
| BD FACsCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo cell analysis software 9.5 | Flowjo inc. | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Life technologies | T10282 | |
| Countess Automatic Cell Counter | Invitrogen-Life Technologies | C10227 |
References
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