Intranasal administrering av rekombinant influensavaksiner i Chimerisk musemodeller for å studere slimhinneimmunitet

Summary

There is an overall lack of knowledge about how vaccines work. Here we propose the combined use of reverse genetics and bone marrow chimeric mice to gain insight into the early host immune responses to vaccines with a special focus on dendritic cells and T cell immunity.

Abstract

Vaccines are one of the greatest achievements of mankind, and have saved millions of lives over the last century. Paradoxically, little is known about the physiological mechanisms that mediate immune responses to vaccines perhaps due to the overall success of vaccination, which has reduced interest into the molecular and physiological mechanisms of vaccine immunity. However, several important human pathogens including influenza virus still pose a challenge for vaccination, and may benefit from immune-based strategies.

Although influenza reverse genetics has been successfully applied to the generation of live-attenuated influenza vaccines (LAIVs), the addition of molecular tools in vaccine preparations such as tracer components to follow up the kinetics of vaccination in vivo, has not been addressed. In addition, the recent generation of mouse models that allow specific depletion of leukocytes during kinetic studies has opened a window of opportunity to understand the basic immune mechanisms underlying vaccine-elicited protection. Here, we describe how the combination of reverse genetics and chimeric mouse models may help to provide new insights into how vaccines work at physiological and molecular levels, using as example a recombinant, cold-adapted, live-attenuated influenza vaccine (LAIV). We utilized laboratory-generated LAIVs harboring cell tracers as well as competitive bone marrow chimeras (BMCs) to determine the early kinetics of vaccine immunity and the main physiological mechanisms responsible for the initiation of vaccine-specific adaptive immunity. In addition, we show how this technique may facilitate gene function studies in single animals during immune responses to vaccines. We propose that this technique can be applied to improve current prophylactic strategies against pathogens for which urgent medical countermeasures are needed, for example influenza, HIV, Plasmodium, and hemorrhagic fever viruses such as Ebola virus.

Introduction

Genereringen av immunologisk hukommelse i fravær av sykdom er fysiologiske grunnlaget for effektiv vaksinering ^1. Nylig har systembiologi baserte tilnærminger avslørte at vellykkede vaksiner som for eksempel gul feber-vaksine, induserer en sterk induksjon av medfødte immunresponser og aktivering av flere undergrupper av dendrittiske celler (DCS), som i sin tur, å føre multilineage aktivering av antigen- spesifikke T-celler ^2,3. Siden DC er de eneste immun cellepopulasjon med evne til å aktivere antigen-spesifikke naive T-celler ^4, er studiet av deres funksjon under vaksinasjon viktig å forstå immunresponser mot vaksiner og å utforme fremtidige strategier mot utfordrende patogener.

Et system som tillater sporing av forskjellige DCS delmengder i løpet av immunresponser mot vaksiner ville være ønskelig for å etablere en nøyaktig kinetikken til DC migrering til lymfevev, og derfor å tilveieinnsikt i de fysiologiske mekanismene som er ansvarlig for igangsetting av vaksinen spesifikke adaptiv immunitet. Revers genetikk baserte tilnærminger tilbyr muligheten for å generere modifiserte, levende-svekkede vaksiner som kan brukes eksperimentelt til dette formålet. Siden innføringen per influensa forskning, har plasmid-basert revers genetikk vært mye brukt til å generere rekombinante influensastammer inkludert LAIVs. Standardprotokollene for å redde rekombinante influensavirus krever multi transfeksjon av høyt transfectable cellelinjer med ambisense plasmider (som produserer både positive og negative sense RNA) inneholdende åtte influensa viral segmenter samt forsterkning i et ettergivende system slik som Madin-Darby kaninnyre ( MDCK-celler) og / eller kylling embryonerte egg ^5. Men fortsatt bruk av revers genetikk å generere molekylære verktøy for å studere immunmekanismer vaksinasjon uutforsket.

Den generasjonenav nye musemodeller slik spesifikk uttømming av immuncelle undergrupper, inkludert DC, har åpnet nye muligheter for å forstå de grunnleggende immun mekanismene bak vaksine-fremkalte beskyttelse. Sammenligningen mellom DC-undergruppe funksjoner hos mus og mennesker har vist at, for en stor del, mus og humane DC er funksjonelt homologe ^6,7, disse funn tyder sterkt på at utviklingen av musemodeller tillater spesifikk uttømming DCS i steady state og i løpet av inflammatoriske tilstander, kan tjene til å forstå fysiologi av DC-responser hos mennesker. I de senere år har en rekke musemodeller er blitt generert som bærer transgener som uttrykker simian difteri-toksin (DT) reseptor (DTR) under kontroll av promoter-regionen av et gen av interesse ^8,9. Siden musevev ikke naturlig uttrykke DTR, disse modellene tillater betinget utarming av celle undergrupper bærer målrettet genet av interesse på musen inokulering med DT. Dermed vår ability til å utarme spesifikke DC og andre leukocytter in vivo under fysiologiske prosesser, har blitt kraftig forbedret ved utvikling av DTR-baserte ro. Men mens disse transgene musemodeller har blitt brukt i stor utstrekning for å forstå ontogeny av immunsystemet, er deres anvendelse til vaksineutvikling er neppe testet. Her, ved å kombinere influensa revers genetikk og DTR-baserte konkurranse benmarg chimeras, foreslår vi en metode for å studere kinetikk vaksineimmunitet samt individuelle genfunksjon under immunresponser mot vaksiner in vivo. Anvendelsen av denne teknologien for preklinisk vurdering av nye vaksiner mot utfordrende smittsomme sykdommer kan bidra til å effektivisere vaksine design og teste vaksinekandidater in vivo.

Protocol

Dyreforsøk ble gjennomført i henhold til godkjente protokoller og følge retningslinjene i den tyske dyrevern lov. Alle ansatte som utfører dyreforsøk gått opplæringsprogrammer i henhold til kategori B eller C i Federation of European Laboratory Animal Science foreninger. 1. generasjon av rekombinant levende svekkede influensavaksiner med Omvendt Genetics MERK: detaljert protokoll for generering av rekombinante influensavirus ved revers genetikk har blitt bes…

Representative Results

Generering av rekombinante levende-svekkede influensavaksiner kan oppnås ved transfeksjon av plasmider som koder for de åtte segmenter av influensavirus under kontroll av promotorer toveis 5. En kald-tilpasset influensavaksine inneholder som regel seks segmenter av en kald-tilpasset belastningen samt HA og NA av influensavirus av valget (f.eks H1N1) (figur 1A). Prinsippet for kald-tilpasning er basert på virus-replikasjon begrenset ved 33 ° C, temperaturen i det øvre luftveier (…

Discussion

I denne studien vil vi beskrive hvordan revers genetikk og kimære musemodeller kan anvendes for å belyse de fysiologiske og molekylære mekanismer for vaksine-indusert immunitet. Influensa revers genetikk er etablert i mange laboratorier og har spilt en sjefsrolle i å forstå influensa patogenesen, replikering, og overføring ^17. Et sentralt punkt i vår protokoll er redningen av kuldetilpassede influensavaksiner uttrykker utenlandske epitoper. Selv om strategien for innføring av korte cDNA inn i stilken …

Materials

Dulbecco´s Modified Eagle Medium (DMEM 1X)	Gibco RL-Life Technologies	41965-039
Opti MEM	Gibco RL-Life Technologies	31985-047
Lipofectamine 2000	Invitrogen-Life Technologies	11668-027
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)	PAA	p11-010
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A2153
Embryonated eggs	Valo biomedia Gmbh
PBS (1X)	Sigma-Aldrich	D8537
70 μM Nylon Filters	Greiner-Biorad	542-070
Red Blood Cell Lysing buffer (RBCL) 10X	BD Bioscience	555899
CD16/CD32 Mouse BD Fc Block (2.4G2)	BD Pharmigen	553142
APC-Anti-mouse SIINFEKL-H2kb (25 D1.16)	Biolegend	141605
PE-Anti-mouse CD11c (HLA3)	BD Biosciences	553802
eFluor 450-Anti-mouse MHCII (Md/114.15.2)	eBioscience	48-5321-82
Pe-Cy7-Anti-mouse CD11b (M1/70)	Biolegend	101216
PerCp/Cy5.5-Anti-mouse CD103 (2E7)	Biolegend	121416
PE-Anti-mouse CD45.1 (A20)	eBioscience	12-0453-82
V500-Anti-mouse CD45.2 (1O4)	BD Bioscience	562130
PerCp-eFluor710 -Anti-mouse CD8a (53-6.7)	eBioscience	46-0081-80
APC-Cy7-Anti-mouse CD3ε (145-2611)	Biolegend	100325
eFluor450-Anti-mouse CD4 (GK 1.5)	eBioscience	48-0041-80
CFSE Proliferation dye	eBioscience	65-0850-85
Baytril 2.5%	Bayer	65-0850-85
Dymethil-Sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650
Ovalbumin	Molecular probes	O23020
Diphteria Toxin (DT)	Sigma-Aldrich	D0564
Trypsin-TPCK	Sigma-Aldrich	T1426
BD FACsCanto II Flow cytometer	BD Biosciences
FlowJo cell analysis software 9.5	Flowjo inc.
Trypan Blue Stain (0.4%)	Life technologies	T10282
Countess Automatic Cell Counter	Invitrogen-Life Technologies	C10227